CN108061750A - 基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测 - Google Patents

基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，具体步骤如下：(1)将石墨烯溶于醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散得到石墨烯分散液；(2)将石墨烯电沉积到裸玻碳电极，然后将GSH‑Ag(I)CP与0.05％wt Nafion混合滴涂于GO/GCE上，得到电化学传感器CP/GO/GCE。利用CP/GO/GCE这一体系对不同浓度过氧化氢的不同的电化学响应，以及在葡萄糖氧化酶的作用下葡萄糖被氧化产生过氧化氢的反应，得到CP/GO/GCE体系对不同浓度葡萄糖的电化学响应，从而用于检测过氧化氢和葡萄糖的浓度，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低且可用人体血液葡萄糖含量检测。

Description

基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感 器用于过氧化氢及葡萄糖检测
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器，尤其是涉及具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，并成功地应用于人体中血糖浓度检测，属于功能材料和生物传感技术领域。
背景技术
葡萄糖(Glu)是自然界分布最广泛的单糖，葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢的中间产物，即生物的主要供能物质，是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质。血液中的糖分称为血糖，绝大多数情况下都是葡萄糖。体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在空腹血糖浓度为3.9～6.0mM。低血糖给患者带来极大的危害，轻者引起记忆力减退、反应迟钝、痴呆、昏迷，直至危及生命。部分患者诱发脑血管意外，心律失常及心肌梗塞；而糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。因此，开发一种快速、高效的葡萄糖检测技术显得尤为重要。
过氧化氢(H2O2)是自然界中常见的物质，过氧化氢自身具有细胞毒性，可作为一种信号分子，对激活生物细胞、细胞凋亡等生物过程会产生一定的影响，体内的过氧化氢来源很有好几种途径，主要是在新陈代谢中，物质氧化分解过程中产生。呼吸链电子传递过程中可产生超氧粒子O2-，其他物质氧化时也可产生超氧粒子，超氧粒子进一步生成过氧化氢和OH-。过氧化氢可致人体遗传物质DNA损伤及基因突变，过氧化氢与老年帕金森氏病、脑中风、动脉硬化及糖尿病性肾病和糖尿病性神经性病变的的发展密切相关，因此对于过氧化氢的分析检测具有较大的现实意义。
近年来，由于独特的结构拓扑学和相关的光物理性质使得超分子化学迅速发展，主要通过分子间非共价键相互作用，包括氢键作用、静电作用、π-π堆积、疏水作用以及币族金属-金属相互作用，合理地设计并合成系列功能化的高维超分子结构体系。其中，基于d10币族金属离子“metallophilicity”相互作用、巯基-金属间相互作用以及金属-金属间相互作用构建的超分子结构体系引起广泛关注。目前，以巯基类分子为配体所形成的银离子配位聚合物尤为引人注目，该类配位聚合物以线性的方式配位，每一股链系由近似平面Z-型的-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-片段组成。当我们采用的配体是含巯基多肽结构的时候，通过Ag(I)-Ag(I)和巯基-Ag(I)的相互作用形成具有类蛋白结构的配位聚合物。因此我们采用谷胱甘肽(GSH)为配体，与Ag(I)形成了类蛋白结构的配位聚合物纳米线，由于其具有良好的导电性、催化性能及生物兼容性，能有效电催化H2O2还原，进而检测出电信号，非常适合用于开发电化学生物传感器。
石墨烯(GO)是至今发现的最薄二维材料，它可以加快电极表面的电子传递速度、有效增大电化学信号，使传感器的灵敏度大大提高。本发明基于具有比表面积大、边缘位点多、生物相容性好等优点的石墨烯(GO)和具有电催化活性的类蛋白质纳米线(以 GSH为配体合成GSH-银配位聚合物，标记为GSH-Ag(I)CP)，构建了一种无标记、简单、成本低廉的电化学生物传感器，可用来检测双氧水和葡萄糖，并应用于人体中血糖浓度的检测，其基本原理如下：过氧化氢在电化学检测过程中会产生较强的还原峰，不同浓度的过氧化氢具有不同的电化学响应信号。因此，可以通过所制备电化学传感器检测过氧化氢。另一方面，葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下会产生过氧化氢，因此可以通过监测过氧化氢的电化学信号间接检测葡萄糖浓度，进而检测人体中血糖的浓度。目前，国内外还没有公开任何基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I) CP)修饰电极的双氧水和葡萄糖电化学生物传感器的相关报道，并成功地应用到人体中血糖浓度的监测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I)CP)的电化学生物传感器的制备及其用于过氧化氢和葡萄糖的监测，进而检测人体中血糖的浓度。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将5.0～15.0mg的石墨烯溶于5.0～10.0mL浓度为0.1～0.3M的pH 5.0～6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2～5h，得到石墨烯分散液；
(2)类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I)CP)的制备
依次取8～12μL浓度为0.8～10mM的硝酸银水溶液，8～12μL浓度为0.8～10mM谷胱甘肽水溶液，加蒸馏水配成80～100μL的溶液，将溶液剧烈振荡3次，每次1～5min，即得到类蛋白结构的配位聚合物纳米线，标记为GSH-Ag(I)CP；
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm) 抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；然后用移液器取2～5μL(2)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，室温下静置 0.5～1.5h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，得到类蛋白质纳米线的电化学传感器，标记为 CP/GO/GCE。
利用上述得到的基于类蛋白质纳米线的电化学传感器，利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测类蛋白质纳米线对不同浓度过氧化氢的催化活性，并利用纳米线特殊的电催化性质来监测葡萄糖反应后的过氧化氢浓度，改变葡萄糖的浓度使得生成的双氧水浓度发生改变，获得一系列不同浓度的葡萄糖对应的过氧化氢还原峰电流，建立电流响应与葡萄糖浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中葡萄糖的含量。
发明原理：本发明是一种电化学生物传感器，利用GSH的结构特性，使其与Ag(I)通过巯基-Ag(I)相互作用以及Ag(I)-Ag(I)相互作用发生聚合反应生成GSH-Ag(I)CP，形成具有类蛋白质结构的纳米线，制备了一种高效的用于检测过氧化氢和葡萄糖的电化学生物传感器。石墨烯是一种二维片状结构，具有较大的比表面积、良好的导电性和生物相容性，牢固修饰于玻碳电极表面，增强了传感器的电子转移效率及稳定性。利用石墨烯 (GO)和纳米线的协同作用，构建了一种简单快速、高灵敏、高选择性、免标记的过氧化氢和葡萄糖分析方法。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线构建电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测。首先，利用低扫速10mV/s的循环伏安法，将石墨烯均匀修饰于裸玻碳电极表面，且通过设置扫描圈数以控制电极上的石墨烯厚度，得GO/GCE。其次，室温下将纳米线与0.05％Nafion溶液混合稳定修饰于GO/GCE上，成功制备传感器。随后利用循环伏安法检测传感器对不同浓度过氧化氢或葡萄糖的电化学响应。显然，在一定的浓度范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。实验结果表明，电流的大小与目标物的浓度在一定范围内呈线性关系，实现对目标物的检测。其优点在于：
(1)高灵敏度。本发明是先将石墨烯利用循环伏安法扫描，使石墨烯均匀沉积到电极表面，且因为静电吸附作用，石墨烯可稳定吸附在电极表面，大大加快了电子传递提高检测灵敏度。实验得出传感器的电流响应对过氧化氢浓度的线性相关方程为 y＝-15.01x-4.41，R2＝0.9989，检测限为100nM，由此说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测；传感器的电流响应对葡萄糖浓度线性相关方程为y＝-1.24x-4.65，R2＝0.9876，检测限为10μM，说明传感器对过氧化氢和葡萄糖实现高灵敏度检测。
(2)高特异性。人体中常见的物质如多巴胺(DA)，抗坏血酸(AA)，柠檬酸(CA)，尿酸(UA)，对乙酰氨基酚(AP)，Ca2+，Zn2+等对实验结果均无影响。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)制备与检测方法试剂用量少、检测速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对过氧化氢和葡萄糖的高灵敏检测。
综上所述，本发明是基于GSH-Ag(I)CP修饰，用于对过氧化氢和葡萄糖浓度的检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度过氧化氢的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器对过氧化氢检测的可行性实验图；
图2为本发明传感器对不同浓度过氧化氢的电化学响应图；
图3为本发明传感器对不同浓度过氧化氢的电流响应对浓度的校准曲线图；
图4为本发明传感器对过氧化氢的选择性检测实验图；
图5为本发明传感器对过氧化氢的抗干扰性检测；
图6为本发明传感器的对葡萄糖检测的可行性实验图；
图7为本发明传感器对不同浓度葡萄糖的电化学响应图；
图8为本发明传感器对不同浓度葡萄糖的电流响应对浓度的校准曲线图；
图9为本发明传感器对葡萄糖的选择性实验图；
图10为本发明传感器对葡萄糖的抗干扰性实验图；
图11为本发明传感器对人体血液中葡萄糖的电化学响应图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将5.0mg的石墨烯溶于5.0mL浓度为0.1M的pH 5.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2h，得到石墨烯分散液；
(2)类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I)CP)的制备
依次取10μL浓度为1mM的硝酸银水溶液，10μL浓度为1mM谷胱甘肽水溶液，加蒸馏水配成100μL的溶液，将溶液剧烈振荡3次，每次2min，即得到类蛋白结构的配位聚合物纳米线，标记为GSH-Ag(I)CP；
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm) 抛光2min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2min，然后用 N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；然后用移液器取5μL(2)中溶液与2μL0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，室温下静置0.5h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，得到电化学传感器GSH-Ag(I)CP/GO/GCE。
实施例2
具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将8.0mg的石墨烯溶于6.0mL浓度为0.2M的pH 5.5的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散3h，得到石墨烯分散液；
(2)类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I)CP)的制备
依次取8μL浓度为0.8mM的硝酸银水溶液，8μL浓度为0.8mM谷胱甘肽水溶液，加蒸馏水配成80μL的溶液，将溶液剧烈振荡3次，每次1min，即得到类蛋白结构的配位聚合物纳米线，标记为GSH-Ag(I)CP；
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm) 抛光3min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗4min，然后用 N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；然后用移液器取3μL(2)中溶液与2μL0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，室温下静置0.8h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，得到电化学传感器GSH-Ag(I)CP/GO/GCE。
实施例3
具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，具体步骤如下：
(1)石墨烯的分散
将7.0mg的石墨烯溶于10.0mL浓度为0.3M的pH 6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散4h，得到石墨烯分散液；
(2)类蛋白质纳米线(GSH-Ag(I)CP)的制备
依次取10μL浓度为6mM的硝酸银水溶液，10μL浓度为6mM谷胱甘肽水溶液，加蒸馏水配成90μL的溶液，将溶液剧烈振荡3次，每次3min，即得到类蛋白结构的配位聚合物纳米线，标记为GSH-Ag(I)CP；
(3)电化学生物传感器的制备
a.首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm) 抛光6min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗3min，然后用 N2吹干，得到裸玻碳电极；
b.利用循环伏安法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；然后用移液器取4μL(2)中溶液与2μL 0.05％wt Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，室温下静置1.2h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，得到电化学传感器GSH-Ag(I)CP/GO/GCE。
二、过氧化氢检测应用
1、利用上述具体实施例1制备的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH 7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，获得一系列不同浓度的H2O2对应的还原峰电流大小，建立电流响应与H2O2之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中H2O2的含量。
利用合成的GSH-Ag(I)CP的传感器(具体合成过程同上述实施例1所述)，检测对有无5mM H2O2的PBS(100.0mM、pH 7.0)的电化学响应，如图1。实验现象表明传感器制备成功且对H2O2有良好的电催化性能。由此证明该实验在理论上和技术上是可行的。
2、灵敏度试验
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，上述具体实施例1制备的CP/GO/GCE对含H2O2的PBS溶液的检测，H2O2浓度的范围为0～5mM。试验结果如图2所示，说明随着过氧化氢浓度的增大，CP/GO/GCE对过氧化氢的电化学响应越明显；图3所示，传感器对过氧化氢的电流响应对浓度的线性相关方程为y＝-15.01x-4.41， R2＝0.9988，线性范围为0.001～5mM，检测限为100nM。说明传感器对过氧化氢可实现高灵敏度检测。
3、特异性试验
选择性实验与抗干扰实验中过氧化氢及其他还原性物质的浓度均为5mM，所用到的其他物质的缩写如下：多巴胺(DA)，抗坏血酸(AA)，柠檬酸(CA)、尿酸(UA)、对乙酰氨基酚(AP)、Ca2+、Zn2+。
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，上述具体实施例1制备的CP/GO/GCE分别对含浓度为5mM的H2O2、多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)、柠檬酸(CA)、尿酸(UA)、半胱氨酸(L-Cys)、Ca2+、Zn2+的PBS溶液的检测。结果如图 4所示，与过氧化氢对比，传感器对其他还原性物质的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于过氧化氢的检测有很好的选择性。
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，在含5mM H2O2的PBS 溶液中，分别加入5mM多巴胺(DA)、抗坏血酸(AA)、柠檬酸(CA)、尿酸(UA)、半胱氨酸(L-Cys)、Ca2+、Zn2+等七种5mM干扰物质混合，检测CP/GO/GCE分别对这七个体系的电化学响应。比较传感器对七个体系及仅过氧化氢存在时的电流响应，结果如图5，观察到还原峰电流的大小与仅有过氧化氢存在时的峰电流基本没有差异，说明传感器实现了对过氧化氢的特异性检测。
三、可行性实验
在制备电化学传感器的过程中(具体合成过程同上述实施例1所述)同时研究了在保持合成条件不变，缺少Ag(I)、GSH其中一种试剂时，制备的传感器对葡萄糖反应体系的电化学响应。
结果如图6所示，在制备电化学传感器时，保持其他条件不变，在缺少Ag(I)、GSH、以及GSH-Ag(I)CP的条件下，比较这三种传感器的电化学性能。由图可以看出，只有在GSH-Ag(I)CP与石墨烯的共同作用下，传感器才具备电化学活性，可以检测出葡萄糖的浓度。由此证明该实验在理论上和技术上是可行的。该可行性实验应用于对过氧化氢的检测，得出相同的结论。
四、葡萄糖检测应用
1、利用具体实施例1制备的电化学生物传感器检测葡萄糖浓度的方法
利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE对不同浓度葡萄糖的电化学响应，获得一系列不同浓度的葡萄糖对应的还原峰电流大小，建立电流响应与葡萄糖浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中葡萄糖的含量。
2、灵敏度实验
实验设计说明：采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，检测上述实施例1制备的CP/GO/GCE对不同浓度葡萄糖的电化学响应，葡萄糖检测浓度的范围为0～50mM。
实验结果如图7所示，说明随着葡萄糖浓度的增大，CP/GO/GCE的电化学响应越明显；图8所示，传感器的电流响应对葡萄糖浓度的线性范围在0.1～50mM，线性相关方程为y＝-1.24x-4.65，R2＝0.9876，检测限为10μM，说明传感器对葡萄糖可实现高灵敏度检测。
3、葡萄糖的特异性实验
选择性实验与抗干扰实验中葡萄糖及其他物质的浓度均为1U/mL，所用到的其他物质的缩写如下：麦芽糖(Maltose)、蔗糖(Sucrose)、半胱氨酸(Cysteine)、赖氨酸(Lysine)、腺嘌呤(Adenine)、胞嘧啶(Cytosine)、尿素(Urea)、Na+、Zn2+、Cl-、SO4 2-。
(1)选择性实验
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，按上述实施例2制备的CP/GO/GCE分别检测浓度为30mM的麦芽糖(Maltose)、蔗糖(Sucrose)、半胱氨酸(Cysteine)、赖氨酸(Lysine)、腺嘌呤(Adenine)、胞嘧啶(Cytosine)、尿素(Urea)、 Na+、Zn2 +、Cl-、SO4 2-。结果如图9所示，与葡萄糖对比，传感器对其他物质的电化学响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对于葡萄糖的检测有很好的选择性。
(2)抗干扰实验，
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，在30mM葡萄糖存在下，分别加入30mM麦芽糖(Maltose)、蔗糖(Sucrose)、半胱氨酸(Cysteine)、赖氨酸(Lysine)、腺嘌呤(Adenine)、胞嘧啶(Cytosine)、尿素(Urea)、Na+、Zn2+、Cl-、 SO4 2-等干扰物质混合，检测CP/GO/GCE分别对这些体系的电化学响应。比较传感器对这些体系及仅有葡萄糖存在时的电流响应，结果如图10，观察到峰电流的大小与仅有葡萄糖存在时的峰电流基本没有差异，说明传感器对于葡萄糖的检测有很好的抗干扰性。
4、人体血液中葡萄糖检测应用
采用循环伏安法，扫描速度为50mV/s，检测电位-1.2～0V，检测传感器对不同人体血液的葡萄糖的电化学响应。结果如图11，观察到人体新鲜血液葡萄糖峰电流大小与过夜血液葡萄糖电流大小相比，有明显差异。过夜血液中葡萄糖含量较少，因为葡萄糖不断进行新陈代谢，而对应的人体新鲜血液中葡萄糖有明显的电流响应峰，对应不同浓度葡萄糖的线性曲线(图8)，人体中血糖浓度大致在5mM左右，说明传感器可实现人体血液中的葡萄糖检测，为新型手持式血糖检测仪的发展提供了一种新的传感方法。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器用于过氧化氢及葡萄糖检测，其特征是，该电化学传感器是通过以下方法构建得到的：
首先，将石墨烯超声分散于醋酸缓冲液中的石墨烯分散液；其次，利用谷胱甘肽和硝酸银合成配位聚合物GSH-Ag(I)CP；最后，将石墨烯电化学方法修饰到处理干净的裸玻碳电极上，得到GO/GCE，再将配位聚合物溶液与Nafion溶液混合滴涂于GO/GCE电极上，得到电化学生物传感器CP/GO/GCE。
2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，玻碳电极进行抛光、清洗的具体方法是：首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极。
3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，取8～12μL浓度为0.8～10mM的硝酸银水溶液，8～12μL浓度为0.8～10mM谷胱甘肽水溶液，加蒸馏水配成80～100μL的溶液，将溶液剧烈振荡3次，每次1～5min，即得到类蛋白结构的配位聚合物纳米线，标记为GSH-Ag(I)CP。
4.如权利要求1～3所述的电化学生物传感器，其特征是，将5.0～15.0mg的石墨烯溶于5.0～10.0mL浓度为0.1～0.3M的pH5.0～6.0的醋酸缓冲液中，于超声清洗器中超声分散2～5h，得到石墨烯分散液；利用循环伏安法，电位控制在-1.5～0.5V，扫描圈数为5圈，扫速为10mV/s，在GO/GCE上滴加GSH-Ag(I)CP与2μL0.05％wt Nafion的混合溶液，室温下静置0.5～1.5h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，得到电化学传感器CP/GO/GCE。
5.具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测过氧化氢和葡萄糖的方法，其特征是，包括以下步骤：权利要求1～4中所述的电化学生物传感器为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，组成三电极体系于PBS溶液中进行循环伏安测试。
6.权利要求1～5中所述的基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法，其特征在于：利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH7.0的PBS缓冲液中对H2O2的电化学响应，利用三电极体系得到的电化学信号强度对过氧化氢浓度做线性回归方程，得工作曲线。
7.权利要求1～6中所述的基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于：利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH7.0的PBS缓冲液中对葡萄糖的电化学响应，利用三电极体系得到的电化学信号强度对葡萄糖浓度做线性回归方程，得工作曲线。
8.权利要求1～7中所述的基于具有电催化活性的类蛋白质纳米线的电化学生物传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于：在复杂体系中，利用循环伏安法，设置电位范围为-1.2～0V，扫速为50mV/s，检测CP/GO/GCE在浓度为100.0mM、pH7.0的PBS缓冲液中对不同人体新鲜血液的葡萄糖的电化学响应，对比工作曲线，计算人体血液中的葡萄糖含量。
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