CN108802141B - 无酶的葡萄糖电化学传感器及其检测方法 - Google Patents

无酶的葡萄糖电化学传感器及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无酶的葡萄糖电化学传感器及其检测方法，该无酶的葡萄糖电化学传感器包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成；使用该无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，包括如下步骤：(1)电化学预处理工作电极：施加高负电位；(2)电化学氧化葡萄糖：施加葡萄糖氧化所需电位；(3)电化学清洗工作电极：施加正电位。本发明可去除样品pH对检测结果的影响，使原本需要在碱性条件下进行无酶的葡萄糖检测，可在中性及酸性样品中的进行，并且具有电极稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，具有非常广阔的应用前景。

Description

无酶的葡萄糖电化学传感器及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种葡萄糖检测装置及其检测方法，具体涉及一种无酶的葡萄糖电化学传感器及其检测方法。
背景技术
葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它在生物学领域具有重要地位。发展高灵敏葡萄糖检测技术对研究生物的新陈代谢和诊断疾病具有重要意义。电化学检测方法以其灵敏度高、操作简单、易于微型化及实时在线等特点受到越来越多的关注，基于电化学技术的葡萄糖检测也成为科研工作者研究的热点。
葡萄糖检测通常包括有酶检测和无酶检测两种方法，其中，有酶检测是体外检测葡萄糖的主要方法，检测过程中通过加入具有高度专一性的葡萄糖氧化酶或脱氢酶，能够排除大量干扰物的影响从而实现复杂样本中的葡萄糖定量检测，然而葡萄糖氧化酶并不稳定，它的催化活性受环境温度、湿度和pH的影响，随着保存时间的增加其稳定性受到考验，虽然已经报道了不少方法来提高酶的稳定性，但这些操作一方面繁琐耗时，另一方面降低了实验的重复性，并且仍受限于pH及温度；无酶检测是检测过程中葡萄糖与催化电极之间直接发生电子转移，因此摆脱了对酶的依赖，相对于有酶检测，无酶检测具有更高的灵敏度和长期稳定性。然而，现有技术中的无酶电极必须在强碱性条件下才能获得高的灵敏度，在中性及酸性条件下，电极极易吸附氧化产物及环境离子发生中毒，大大限制了其实际应用。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种能在中性及酸性条件下进行无酶检测葡萄糖的电化学传感器；本发明的第二目的是提供该无酶的葡萄糖电化学传感器的检测方法。
技术方案：本发明无酶的葡萄糖电化学传感器，包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成。
其中，所述对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料为下列(1)-(5)中的任意一种：
(1)金、银、铂、镍、铜、铁、钴、铅、铱、铋、钌中的一种或含有一种以上的合金材料；
(2)包括(1)中所涉及到的材料的纳米结构；
(3)包括(1)中所涉及到的材料的氧化物；
(4)碳纳米管和/或石墨烯；
(5)包括(1)、(2)、(3)、(4)中所涉及材料的两种或两种以上的复合材料。
所述参比电极为Ag/AgCl电极、甘汞电极或聚吡咯电极。所述对电极为铂、金或碳。
为使测得的实验数据更准确，所述工作电极的表面覆有选择性透过膜，所述选择性透过膜为全氟磺酸、聚三氟氯乙烯、纤维素及其衍生物中的至少一种。
本发明使用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)电化学预处理电极：施加高负电位一段时间；
(2)电化学氧化葡萄糖：施加葡萄糖氧化所需电位一段时间；
(3)电化学清洗电极：施加正电位一段时间。
其中，电化学预处理电极是通过施加高负电位一段时间，使工作电极发生析氢反应，析氢反应不断地消耗电极附近的氢离子使电极附近的pH升高并最终达到葡萄糖灵敏检测所需要的碱度，即活化电极；电化学氧化葡萄糖是通过施加常规电位一段时间，以氧化葡萄糖获得电化学信号，所施加的的常规电位是葡萄糖在工作电极表面氧化所需电位，其大小与构成工作电极的材料相关；电化学清洗电极是检测完毕后通过施加正电位一段时间清理电极，以除去电极表面的氧化产物，从而不影响下次检测。
工作电极为金电极时，施加高负电位-1.6～-3.0V时间10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.05～0.4V时间3～10s，施加正电位0.7～1.0V时间1～10s；工作电极为铂电极时，施加高负电位-1.4V～-2.5V时间8～30s，施加葡萄糖氧化所需电位+0.01V～0.4V时间3～10s，施加正电位0.7～1.0V时间1～10s；所述工作电极为铜镍合金电极时，施加高负电位-1.6V～-3.0V时间10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.4～0.7V时间3～10s,施加正电位+0.7～1.0V时间3～10s；所述工作电极为铂纳米粒子-石墨烯修饰电极时，施加高负电位-1.4V～-2.5V时间10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.1～0.7V时间3～10s，施加正电位0.7～1.0V时间2～10s。
有益效果：与现有技术相比，本发明可去除样品pH对检测结果的影响，使原本需要在碱性条件下进行无酶的葡萄糖检测，可在中性及酸性样品中的进行，并且具有电极稳定性好、灵敏度高、重复性好等优点，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为三电极检测葡萄糖原理图；
图2(a)为汗糖检测手环正面实物图；
图2(b)为汗糖检测手环背面实物图；
图2(c)为汗糖检测手环外壳三电极体系实物图；
图2(d)为3D打印出来的手环外壳；
图2(e)为与汗糖检测手环连接的智能手机及app检测界面；
图3为汗糖检测手环用于实时监测汗液葡萄糖浓度；
图4为利用汗糖手环检测到的不同葡萄糖浓度与检测电流之间的线性关系。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
如图1所示，以金电极(2mm截面直径)为工作电极1，银-氯化银为参比电极2，铂丝为对电极3构成三电极体系。在0.1M pH 5.0磷酸盐缓冲液中，利用电化学工作站对缓冲液中的葡萄糖进行检测。在设置中的技术菜单栏中选择多电位检测，在参数设置里面设置依次需要施加的电位。在本检测中，三电位设置分别为：施加-2.0V电位24s，+0.2V电位5s，+1.0V电位2s，检测是一个循环过程，检测过程中改变葡萄糖浓度得到葡萄糖氧化电流与浓度的关系，检测电流与葡萄糖浓度在10μM～1025μM范围内呈线性关系。
实施例2
以铂电极(2mm截面直径)为工作电极，银-氯化银为参比电极，铂丝为对电极构成三电极体系，在0.1M pH 5.0磷酸盐缓冲液中，利用电化学工作站对缓冲液中的葡萄糖进行检测。用移液器吸取2.5μL 0.5％的全氟磺酸溶液滴涂在铂电极表面，自然干燥。检测操作过程类似实例1，在本检测中，三电位设置分别为：-1.8V，20s；+0.1V，5s；+1.0V，5s。检测电流与葡萄糖浓度在30μM～750μM范围内呈线性关系。
实施例3
以铜镍合金(铜：镍＝1：5)电极(2mm直径)为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极构成三电极体系，在0.1M pH 7.0磷酸盐缓冲液中，利用电化学工作站对缓冲液中的葡萄糖进行检测。在设置中的技术菜单栏中选择电流时间曲线，在参数设置里面起始点位设定为检测电位+0.6V，时间设置为5s。在控制菜单栏中选择预处理，在里面分别设定两个预处理电位，电位1为+0.8V，时间为5s，用于除去前一次检测吸附的氧化产物，电位2设定为-1.8V，时间为20s。每改变一次葡萄糖浓度，重复检测一次，最终得到检测电流与葡萄糖浓度的关系。检测电流与葡萄糖浓度在16～480μM范围内呈线性关系。
实施例4
将玻碳电极(2mm截面)在麂皮上分别用0.3mm和0.05mm的Al2O3粉打磨以获得光亮平整的截面，分别用水、乙醇、水超声清洗电极，各五分钟。用移液枪移取2.5μL0.25mg mL-1的氧化石墨烯(Gr)分散液滴涂于玻碳电极表面，自然干燥，得到Gr修饰过的玻碳电极。在含有7.9mM的氯铂酸中，以修饰过Gr的玻碳电极作为工作电极，以银-氯化银电极为参比电极，以铂丝为对电极，利用恒电位-0.25V沉积铂纳米粒子400s，得到铂纳米粒子-石墨烯修饰电极。
以铂纳米粒子-石墨烯修饰电极为工作电极，银-氯化银为参比电极，铂丝为对电极构成三电极体系，在0.1M pH 5.0磷酸盐缓冲液中，利用电化学工作站对缓冲液中的葡萄糖进行检测。检测操作过程类似实施例2，在本检测中，三电位设置分别为：-1.6V，20s；+0.5V，5s；+1.0V，2s。检测电流与葡萄糖浓度在0.1μM-786μM范围内呈线性关系。
实施例5
基本步骤同实施例1，所不同之处在于，三电位设置分别为：施加-1.6V电位10s，0.05V电位3s，0.7V电位1s。检测电流与葡萄糖浓度在100μM～960μM范围内呈线性关系。
实施例6
基本步骤同实施例1，所不同之处在于，三电位设置分别为：施加-3.0V电位30s，0.4V电位10s，1.0V电位10s。检测电流与葡萄糖浓度在200μM～870μM范围内呈线性关系。
实施例7
基本步骤同实施例2，所不同之处在于，三电位设置分别为：施加-1.4V电位8s，+0.01V电位3s，0.7V电位1s。检测电流与葡萄糖浓度在80μM～780μM范围内呈线性关系。
实施例8
基本步骤同实施例2，所不同之处在于，三电位设置分别为：施加-2.5V电位30s，+0.4V电位10s，1.0V电位10s。由检测结果可知，检测电流与葡萄糖浓度40μM～900μM范围内呈线性关系。
实施例9
基本步骤同实施例3，所不同之处在于，所用方法为电流时间曲线，在参数设置里面起始电位设定为检测电位+0.4V，时间设置为3s。在控制菜单栏中选择预处理，在里面分别设定两个预处理电位，电位1为+0.7V，时间为2s，用于除去前一次检测吸附的氧化产物，电位2设定为-1.6V，时间为10s。由检测结果可知，检测电流与葡萄糖浓度在80～675uM范围内呈线性关系。
实施例10
基本步骤同实施例3，所不同之处在于，电流时间曲线，在参数设置里面起始电位设定为检测电位+0.7V，时间设置为10s。在控制菜单栏中选择预处理，在里面分别设定两个预处理电位，电位1为+1.0V，时间为10s，用于除去前一次检测吸附的氧化产物，电位2设定为-3.0V，时间为30s。由检测结果可知，检测电流与葡萄糖浓度在55～925uM范围内呈线性关系。
实施例11
基本步骤同实施例4，所不同之处在于，三电位设置分别为：-1.4V，10s；0.1V，3s；0.7V，2s。检测电流与葡萄糖浓度在0.85uM-487uM范围内呈线性关系。
实施例12
基本步骤同实施例4，所不同之处在于，三电位设置分别为：-2.5V，30s；0.7V，10s；1.0V，10s。由检测结果可知，检测电流与葡萄糖浓度在0.18uM-880uM范围内呈线性关系。
实施例13
利用无酶汗糖检测手环实时监测汗液葡萄糖浓度
利用3D打印机打印出具有三电极反应池的手环外壳(1.8cm×3.5cm)。工作电极是以打磨过的金丝为工作电极：截取长1cm，截面2mm的金丝，先用角磨机将截面打磨平整，随之用3000目的砂纸打磨，接着在麂皮上分别用0.3mm和0.05mm的Al2O3粉打磨以获得光亮平整的截面，分别用水、乙醇、水超声清洗电极，各五分钟；对电极是以打磨过的铂丝，其制备过程同工作电极；参比电极以沉积过聚吡咯的铂丝，铂丝制备过程同对电极，沉积聚吡咯步骤为：用电极夹夹住铂丝为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，玻碳电极为对电极，将三电极与电化学工作站连接后浸入含有100mM的四丁基六氟磷酸铵和10mM吡咯的混合溶液，利用循环伏安法进行电化学沉积，设置扫描范围为-0.8V～1.2V，扫速为0.1V/s，一共扫描50个循环。三电极制备好后固定于手环外壳，只露出光亮电极面，如图2(a)-2(e)所示。
将带有蓝牙装置的电路板固定于手环内部，三电极在内部与电路板相连，检测电路是通过DA芯片进行数模转换，对电极体系进行电压施加；通过运算放大器进行信号转换与放大，以nrf51822蓝牙芯片为核心，自带AD功能进行数字信号采集，通过蓝牙天线与上位机进行信号传输。
汗液成分是非常复杂的，检测过程会存在大量的干扰物，为了提高检测的选择性，利用移液器吸取2.5μL 0.5％的全氟磺酸溶液滴涂在金电极表面，自然干燥后用移液器吸取2.5μL 8％聚三氟氯乙烯油滴涂于金电极表面，自然干燥。
葡萄糖检测采用多步电位法，首先施加+1.0V的电位2s除去电极表面的吸附物，随后施加-2.0V的电位24s使金电极附近pH升高，最后使用+0.2V的电位氧化葡萄糖获得电化学信号。多步电位的控制是通过固定在手环内部的电路板来实现的。
手环制备好后按以下步骤操作(如图3所示)：
(1)将手环佩戴在手腕上，打开开关，此时指示灯亮，表示手环工作正常；
(2)打开手机app，登录后点击“连接”与手环进行蓝牙连接；
(3)运动或等待出汗；
(4)点击“检测”按键，进行测量；
(5)等倒计时结束，读取app显示数据，即为汗糖数值；
(6)点击“再次检测”可进行再次测量；
(7)使用完成后，断开蓝牙连接，关闭手环。
图4是本实施例利用汗糖检测手环检测到的汗液葡萄糖与电流之间的关系，电流大小与葡萄糖浓度在30μM-1100μM范围内呈线性关系。
本发明无酶的葡萄糖电化学传感器不仅可以检测汗液中的葡萄糖，其它含葡萄糖的溶液均可检测，比如检测血液、尿液或唾液中的葡萄糖浓度，通过蓝牙与电脑数据传输等方式均可实现。

Claims (7)

1.一种利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，所述传感器包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成，其特征在于包括如下步骤：(1)电化学预处理工作电极，施加高负电位；(2)电化学氧化葡萄糖；(3)电化学清洗工作电极；其中，所述工作电极为金电极，施加高负电位-1.6～-3.0V，时间为10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.05～0.4V，时间为3～10s，施加正电位0.7～1.0V，时间为1～10s。
2.一种利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，所述传感器包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成，其特征在于包括如下步骤：(1)电化学预处理工作电极，施加高负电位；(2)电化学氧化葡萄糖；(3)电化学清洗工作电极；其中，所述工作电极为铂电极，施加高负电位-1.4V～-2.5V，时间为8～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.01V～0.4V，时间为3～10s，施加正电位0.7～1.0V，时间为1～10s。
3.一种利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，所述传感器包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成，其特征在于包括如下步骤：(1)电化学预处理工作电极，施加高负电位；(2)电化学氧化葡萄糖；(3)电化学清洗工作电极；其中，所述工作电极为铜镍合金电极，施加高负电位-1.6～-3.0V，时间为10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.4～0.7V，时间为2～10s，施加正电位0.7～1.0V，时间为2～10s。
4.一种利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，所述传感器包括由参比电极、对电极和工作电极组成的三电极体系，所述工作电极由对葡萄糖具有电催化氧化性能的材料制成，其特征在于包括如下步骤：(1)电化学预处理工作电极，施加高负电位；(2)电化学氧化葡萄糖；(3)电化学清洗工作电极；其中，所述工作电极为铂纳米粒子-石墨烯修饰电极，施加高负电位-1.4V～-2.5V，时间10～30s，施加葡萄糖氧化所需电位0.1～0.7V，时间3～10s，施加正电位0.7～1.0V，时间2～10s。
5.根据权利要求1-4任一所述利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述参比电极为Ag/AgCl电极、甘汞电极或聚吡咯电极；所述对电极为铂、金或碳电极。
6.根据权利要求1-4任一所述利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述工作电极的表面覆有选择性透过膜。
7.根据权利要求6所述利用无酶的葡萄糖电化学传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于：所述选择性透过膜为全氟磺酸、聚三氟氯乙烯、纤维素及其衍生物中的至少一种。
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