CN113203782B - 一种基于复合材料的无酶传感器检测葡萄糖的方法 - Google Patents

一种基于复合材料的无酶传感器检测葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于复合材料的无酶传感器检测葡萄糖的方法,分别采用电沉积技术以及戊二醛的交联作用将Au NPs和H‑rGO‑Pt@Pd NPs修饰在丝网印刷电极表面,构成无酶生物传感器界面。在生物传感界面加入葡萄糖后,由于H‑rGO‑Pt@Pd NPs/Au NPs具有的良好催化氧化作用,使得在生物传感界面发生氧化还原反应。通过电化学工作站中的i‑t法记录电流信号,并描绘出该电流与葡萄糖浓度的工作曲线,从而实现对葡萄糖的检测。

Description

一种基于复合材料的无酶传感器检测葡萄糖的方法
技术领域
本发明属于生物检测领域,具体涉及一种无酶电化学生物传感器检测葡萄糖的方法。
背景技术
葡萄糖检测的方法主要有荧光分析法,比色法,液相色谱、质谱法,吸收光谱法,电化学传感器方法等等。发明专利CN 109030599B通过葡萄糖氧化酶对葡萄糖催化氧化实现对葡萄糖的检测,然而生物酶的价格普遍较高,且无法长期保持活性。发明专利CN111304284A根据葡萄糖与葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶反应产生的颜色变化分析葡萄糖的含量,该方法需要专用的仪器检测吸光度的变化。发明专利CN108593747A构造了一种基于晶体管结构的非侵入式电化学传感器用于葡萄糖检测,然而非侵入式传感器普遍面临干扰因素较多,准确性较低的缺点。发明专利CN109668951B 则构建了一种基于MoS2-AuNPs-PPY复合材料的无酶检测葡萄糖的电化学传感方法,该方法具有较高的灵敏度和较低的检测限。发明专利CN112578010A制备了Cu(OH)2/NPC/Cu电极,并在其表面修饰金纳米颗粒,制得纳米多孔铜复合微电极,从而实现对葡萄糖的无酶检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有良好催化氧化性能的H-rGO-Pt@PdNPs/Au NPs复合材料,以此构建一种最低检测限为0.25 mg/mL的无酶电化学生物传感器检测葡萄糖的方法。
为了解决该技术问题,分别采用电沉积技术以及戊二醛的交联作用将Au NPs和H-rGO-Pt@Pd NPs修饰在丝网印刷电极表面,构成无酶生物传感器界面。在生物传感界面加入葡萄糖后,由于H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs具有的良好催化氧化作用,使得在生物传感界面发生氧化还原反应。通过电化学工作站中的i-t法记录电流信号,并描绘出该电流与葡萄糖浓度的工作曲线,从而实现对葡萄糖的检测。
本发明按照以下步骤进行:
步骤1:H-rGO-Pt@Pd NPs材料的制备
(1)还原氧化石墨烯(rGO) 的制备:将氧化石墨烯(GO) 置于水中,进行超声破碎,得到GO原液。而后添加抗坏血酸进行还原,得到rGO悬浮液。
(2)血红素-还原氧化石墨烯(H-rGO)的制备:将血红素用氨水溶解,并将其与RGO悬浮液混合,加入水合肼,还原得到H-rGO溶液。
(3)血红素-还原氧化石墨烯-铂@钯(H-rGO-Pt@Pd NPs)复合材料的制备:将PDDA,NaCl与H-rGO溶液混合,制成PDDA修饰的H-rGO溶液。将Na2PtCl6和Na2PdCl4与PDDA修饰的H-rGO溶液混合,并加入乙二醇,调节pH值至12,得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合材料。
步骤2:电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)将丝网印刷电极 (SPE) 置于H2SO4溶液中,进行循环伏安扫描,得到活化的丝网印刷电极。
(2)将活化后的丝网印刷电极置于氯金酸溶液中,进行恒电位沉积,得到Au NPs/SPE电极。
(3)将制备好的H-rGO-Pt@Pd NPs复合材料重溶于水后滴加到Au NPs/SPE电极上,晾干,得到H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极。
步骤3:葡萄糖工作曲线的绘制
(1)将步骤2制备的H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极放入PBS溶液中,采用电化学工作站的i-t扫描法,记录其i-t曲线。
(2)通过不断改变PBS溶液中的葡萄糖浓度,并对不同葡萄糖浓度下的i-t水平进行记录,描述电流响应值和葡萄糖浓度的关系,绘制工作曲线,计算出该方法的最低检测限。
步骤4:实际样品中葡萄糖的检测
(1)将步骤2得到的H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极放入PBS溶液中,并在PBS溶液中滴加实际待测样品,采用电化学工作站的i-t扫描,记录其i-t曲线。
(2)根据步骤3所得到的工作曲线,计算得到所述待测实际样品中葡萄糖的浓度。
其中,步骤1为步骤2提供一种高导电率的复合材料。步骤2构成了检测葡萄糖的生物传感界面,并有利于电子的传递。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中葡萄糖的电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的葡萄糖的工作曲线为步骤4的实际样本中葡萄糖浓度的测定提供计算依据。可见步骤1到步骤4相互支撑,共同作用,才能利用H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极,实现葡萄糖的无酶检测。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
1. 本专利形成H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs复合材料具有独特的形貌和优异的催化活性,比表面积大,电子转移效率高,能够有效改善和提高生物传感器的性能;其中H-rGO-Pt@Pd NPs独特的网状结构能够增强葡萄糖分子的负载量,提高对葡萄糖的灵敏检测;H-rGO-Pt@Pd NPs和Au NPs都具有良好的催化葡萄糖氧化效应,二者协同作用,替代葡萄糖氧化酶而起到催化葡萄糖氧化特性。
2. 本专利采用基于H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs复合材料构建无酶葡萄糖电化学传感器。相比于传统的有酶电化学传感器,不易受湿度、温度、以及化学因素的影响,也可以在一些极端环境下进行检测,对实验过程没有太过苛刻的要求。
附图说明
图1 基于H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs复合材料的无酶电化学传感器检测葡萄糖的检测原理图;
图2 RGO-Hemin (A)和H-rGO-Pt@Pd NPs (B)的扫描电子显微镜图(SEM);
图3 无酶电化学传感器在不同葡萄糖浓度下的i-t曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs复合材料的用于检测葡萄糖的无酶电化学传感器,检测原理如图1所示。分别采用电沉积技术以及戊二醛的交联作用将Au NPs和H-rGO-Pt@Pd NPs修饰在丝网印刷电极表面,构成无酶生物传感器界面。在生物传感界面加入葡萄糖后,由于H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs具有的良好催化氧化作用,使得在生物传感界面发生氧化还原反应。通过电化学工作站中的i-t法记录电流信号,并描绘出该电流与葡萄糖浓度的工作曲线,从而实现对葡萄糖的检测。
实施步骤如下:
步骤1:H-rGO-Pt@Pd NPs材料的制备
(1)rGO的制备:称取10 mg 的GO溶于10 mL的超纯水,用超声细胞破碎仪超声破碎2 h,制成浓度为1 mg/mL的GO悬浮液。而后,将10 mL 的GO悬浮液与10 mg抗坏血酸充分混合,在室温下连续搅拌12 h,可得到rGO溶液;
(2)H-rGO的制备:将10 μL氨水滴于装有30 mg血红素的烧杯中,再向其中加入30mL纯净水,将其搅拌均匀,得到血红素溶液。取10 mL血红素溶液与10 mL的rGO溶液进行混合,然后加入8 μL的水合肼,并搅拌10 min,得到血红素与rGO的混合液。将混合液在60℃水浴下搅拌4h后,在12000 r/min的转速下离心10 min,去掉上清液,得到H-rGO复合材料。其扫描电子显微镜图如图2A所示,H-rGO复合材料呈凝固的胶状。
(3)H-rGO-Pt@Pd NPs的制备:将2.0 mL的 0.2% PDDA 和0.0585g的 NaCl加入到10 mL的0.5mg/mL H-rGO溶液中,连续搅拌12 h。而后在10000 r/min的转速下离心15 min,取沉淀得到PDDA修饰的H-rGO。称取22.5 mg的Na2PtCl6和11.8 mg的Na2PdCl4加入到PDDA修饰的H-rGO溶液中,连续搅拌反应12h,并在混合溶液中加入10 mL乙二醇,用1.0 mol/L的NaOH调节混合溶液的pH值到12,将溶液在12000 r/min的转速下,离心10 min,取其沉淀,得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合材料。其扫描电子显微镜图如图2B所示,可看出表面有胶体颗粒形状,表明金属Pt和Pd 均匀粘附。
步骤2:电极的修饰与生物传感界面的构建
(1)电极的预处理:首先将SPE浸泡在0.5 mol/L H2SO4 溶液中进行循环伏安法(CV) 扫描,在-0.4V-1.2V的电压范围内扫描20段;扫描完成之后用纯水洗净,晾干,得到活化的SPE。
(2)电极的修饰与生物传感界面的构建:将活化后的SPE电极放入4 mL 0.01%氯金酸溶液中,在-0.5 V的恒电位下沉积120 s,沉积完成后用纯水洗涤3次,吹干得到Au NPs/SPE电极。将Au NPs/SPE电极用2.5%的戊二醛浸泡15 min,并用PBS溶液冲洗。而后滴加5 μL1.0 mg/mL的H-rGO-Pt@Pd NPs悬浊液孵育30 min,用PBS溶液冲洗,晾干,得H-rGO-Pt@PdNPs/Au NPs/SPE传感器(工作电极)。
步骤3:葡萄糖的标准曲线绘制
将步骤2所得的工作电极(H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE)放入2.0 mL PBS液,每隔100s添加一定量的葡萄糖,采用电化学工作站的i-t曲线测量溶液中葡萄糖浓度的变化。不同葡萄糖浓度的i-t曲线见图3。当葡萄糖浓度梯度降低时,电流的响应也是进行梯度变化的,且电流的响应变化是均匀的。葡萄糖浓度在0.6~1.4 mg/mL范围内时,传感器电流响应值(Y) 与葡萄糖浓度(X) 之间的关系呈线性,其线性回归方程为Y=4.8515X-9.9361,相关系数为0.9844。根据最低检测限的计算公式LOD=3*Sb/S,计算出葡萄糖的最低检测限为0.25 mg/mL。
步骤4:实际血清样本中葡萄糖的检测
将浓度为0mg/mL,1.2 mg/mL,1.3mg/mL,1.4mg/mL,1.5mg/mL,1.6mg/mL的葡萄糖溶液分别与血清溶液1:1混合,制成混合液。将H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极浸没在PBS溶液中,在PBS溶液中滴加10 µL混合液,并用i-t扫描,平行测定三次。根据步骤3的工作曲线Y=4.8515X-9.9361计算可得到对应的实际血清样本中的葡萄糖浓度,检测结果见表1。
表1实际血清样本中葡萄糖的检测结果
(注:血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供)。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改,等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种基于复合材料的无酶传感器检测葡萄糖的方法,其特征在于,按以下步骤进行:
步骤1:H-rG-Pt@Pd NPs材料的制备
还原氧化石墨烯rGO的制备:将氧化石墨烯GO置于水中,进行超声破碎,得到GO原液;而后添加抗坏血酸进行还原,得到rGO悬浮液;
血红素-还原氧化石墨烯H-rGO的制备:将血红素用氨水溶解,与RGO悬浮液混合,加入水合肼,还原得到H-rGO溶液;
H-rGO-Pt@Pd NPs复合材料的制备:将PDDA,NaCl与H-rGO溶液混合,制成PDDA修饰的HrGO溶液;将Na2PtCl6和Na2PdCl4与PDDA修饰的H-rGO溶液混合,加入乙二醇,调节pH值至12,得到H-rGO-Pt@Pd NPs复合材料;
步骤2:电极的修饰与生物传感界面的构建
将丝网印刷电极置于H2SO4溶液中,进行循环伏安扫描,得到活化的丝网印刷电极;将活化后的丝网印刷电极置于氯金酸溶液中,进行恒电位沉积,得到Au NPs/SPE电极;将AuNPs/SPE电极用2.5%的戊二醛浸泡15 min,并用PBS溶液冲洗;而后滴加5μL1 .0 mg/mL的H-rGO-Pt@Pd NPs悬浊液孵育30 min,用PBS溶液冲洗,晾干,得H-rGO-Pt@PdNPs/Au NPs/SPE电极;
步骤3:葡萄糖工作曲线的绘制
将步骤2制备的H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极放入PBS溶液中,采用电化学工作站的i-t扫描法,记录其i-t曲线;通过不断改变PBS溶液中的葡萄糖浓度,并对不同葡萄糖浓度下的i-t曲线进行记录,描述电流响应值和葡萄糖浓度的关系,绘制工作曲线,计算出该方法的最低检测限;
步骤4:实际样品中葡萄糖的检测
将步骤2得到的H-rGO-Pt@Pd NPs/Au NPs/SPE电极放入PBS溶液中,并在PBS溶液中滴加实际待测样品,采用电化学工作站的i-t扫描,记录其i-t曲线;根据步骤3所得到的工作曲线,计算得到所述实际样品中葡萄糖的浓度。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1中,所使用的抗坏血酸为10 mg,氨水为10 μL,水合肼为8 μL 0.2% 的PDDA为2 mL,NaCl为0.0585 g,Na2PtCl6为22.5 mg,Na2PdCl4为11.8 mg,乙二醇为10 mL。
3.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2中,H2SO4溶液浓度为0.5 mol/L。
4.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2中,电极活化所使用的扫描电压为-0.4 V- 1.2 V,扫描段数为20。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤2中,所述的HAuCl4的质量分数为0.01%,沉积条件为-0.5 V,沉积时间为120 s。
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