CN111879829B - 基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门 - Google Patents

基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于银离子和谷胱甘肽的电化学传感器的制备方法及其逻辑门应用，具体步骤如下：首先，制备了氧化石墨修饰电极GO/GCE，然后，Ag(I)和GSH反应生成复合物，基于此，成功制备传感器。随后利用葡萄糖6‑磷酸(G6P)和氧化态的还原型辅酶II(NADP+)在G6PD的催化下能够生成NADPH，NADPH和GSSG在GSR催化下能够生成GSH，利用生成的GSH与Ag(I)反应生成配位聚合物，对H2O2产生明显的电催化信号。基于这两类酶与GSH之间的生物关系，设计不同的信号输入及输出构建了四种逻辑门(YES、AND、AND‑AND和AND‑AND‑AND)，为GSH相关的疾病诊断与治疗提供了一种新思路。优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低。

Description

基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电 化学逻辑门
技术领域
本发明涉及电化学方法及其在逻辑门中的应用，尤其是涉及基于配位聚合物电催化活性的谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶相关逻辑电路设计，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
逻辑门是集成电路的基本组件。简单的逻辑门一般由晶体管组成。代表两种信号的高低电平通过集成电路中的晶体管组合之后能够产生高电平或者低电平信号。这两种信号可以分别用“真”与“假”或二进制中的1和0来表示。其中，二进制结构所需原件少，运算规则简单，便于进行逻辑运算。通常用布尔逻辑表示二进制中一系列逻辑运算。布尔逻辑基本运算较为简单，且能够衍生出较为复杂的运算。生物分子计算机或者生物分子水平上的信息处理，相对于传统的以硅为基础的计算机技术，不仅沿袭了传统技术的优点，而且具有一些新的特点(如生物相容性好、毒性低、满足医学生物检验新要求等)，是一种很有发展前途的手段。发展简单且易于编程和操作的分子逻辑系统对于生物分子的检测、分子器件的构建以及生物计算技术的发展具有重要意义。
谷胱甘肽(GSH)，别名5-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，在人体内的防御系统中起到重要作用，具有多个方面的生理功能。研究发现，谷胱甘肽表达异常与很多危险性人类疾病有紧密关系，如：肝损伤、心脏病、类风湿性关节炎、银屑病、白细胞减少、艾滋病甚至癌症。在过去的几十年里，多种谷胱甘肽分析检测方法涌现，主要有比色法、荧光法、质谱法、高效液相层析等等，而大多数分析方法都集中在GSH的直接检测，而对与其相关的谷胱甘肽还原酶(GSR，利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)将氧化型GSH(GSSG)催化反应成还原型GSH(GSH)，它的缺失会使细胞对氧化剂和抗生素更为敏感)和葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G6PD，能够催化6-磷酸葡萄糖脱氢形成6-磷酸葡糖酸和NADPH)分析检测十分有限。因此，迫切需要发展一些更简单但有效的方法来监测生理和病理条件下的GSH以及能够引起其变化的谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。分子逻辑门由于存在多个信号输入和多个信号输出，为多目标同时分析提供了契机。
本发明基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶设计了一系列新颖的电化学逻辑门，采用GSH作为生物有机配体，银离子(Ag(I))作为金属节点，通过GSH中巯基与Ag(I)和Ag(I)与Ag(I)相互作用简单绿色合成GSH-Ag(I)配位聚合物(GSH-Ag(I)CP)。基于金属离子的氧化还原活性，本发明发现该CP对双氧水(H2O2)具有较好的电催化作用。此外，GSH为NADPH参与的谷胱甘肽还原酶(GSR)催化反应产物，而NADPH是6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)催化反应产物，基于这两类酶与GSH之间的生物关系，设计不同的信号输入及输出构建了四种逻辑门(YES、AND、AND-AND和AND-AND-AND)，在生物医学领域具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是设计了四种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，具体步骤如下：
(1)GSH-Ag(I)CP的制备
依次取1～10μL浓度为0.1～20mM的硝酸银水溶液、1～10μL浓度为0.1～20mM谷胱甘肽水溶液，混合均匀后加入磷酸缓冲溶液(10mM，pH 7.0，Na2HPO4/NaH2PO4)配成50～120μL的溶液，将溶液在25～40℃下缓缓震荡8～17min，即得到GSH-Ag(I)CP，使用前将该CP溶液与50～120μL 0.02％wt Nafion溶液混合均匀，静置5～20min。
(2)电化学生物传感器的制备
a.将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上依次用粒径0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光0.5～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗1～5min，然后用N2吹干，记为GCE；
b.利用循环伏安法，设置电位范围为-1.5～0.5V、扫速5～20mV/s将0.7～2.4mg/mL石墨烯(GO)醋酸分散液(pH 5.0)电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；；然后取5～15μL(1)中溶液滴涂于GO/GCE上，室温下静置20～60min，用超纯水缓缓冲洗电极，记为CP/GO/GCE。
(3)逻辑门的构建
100μL总体积的反应液包括：葡萄糖6-磷酸(G6P)(1～20mM)，氧化态的还原型辅酶II(NADP+)(0.01～10mM)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)(0.5～30U)，GSSG(1～50mM)和GSR(0.5～30U)，37℃下反应2～10min，将该反应液代替步骤(1)中的GSH实现GSH-Ag(I)CP的制备，其余步骤同(1)和(2)。改变输入信号和输出信号，实现逻辑门的设计。
利用上述基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，利用循环伏安法，控制扫速为50mV/s，设置电位范围为-1.2～0V检测传感器在含5mMH2O2的PBS(0.1M，pH 7.0，Na2HPO4/NaH2PO4)中的电化学响应，选择不同信号输入和信号输出，通过二进制“1”和“0”构建能够对GSH、GSR和G6PD响应的逻辑门，构建了一系列仿生逻辑门用于生物医药信息的集成处理。
发明原理：本发明采用GSH作为生物有机配体，银离子(Ag(I))作为金属节点，通过GSH中巯基与Ag(I)和Ag(I)与Ag(I)相互作用简单绿色合成GSH-Ag(I)配位聚合物(GSH-Ag(I)CP)，该聚合物对H2O2具有电催化活性。葡萄糖6-磷酸(G6P)和氧化态的还原型辅酶II(NADP+)在G6PD的催化下能够生成NADPH，NADPH和GSSG在GSR催化下能够生成GSH，利用生成的GSH与Ag(I)反应生成配位聚合物，对H2O2产生明显的电催化信号。基于这两类酶与GSH之间的生物关系，设计不同的信号输入及输出构建了四种逻辑门(YES、AND、AND-AND和AND-AND-AND)，为GSH相关的疾病诊断与治疗提供了一种新思路。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门。首先，制备石墨烯修饰电极，然后，将GSH-Ag(I)CP修饰至电极表面，该配位聚合物对H2O2具有较强的电催化响应。随后将G6PD和GSR反应后生成的GSH用于配位聚合物的制备。显然，在整个分析策略中，G6PD、GSR和Ag(I)缺一不可，基于此，构建了YES、AND、AND-AND和AND-AND-AND逻辑门。其优点在于：
(1)优异电催化活性。利用GSH和Ag(I)制备的GSH-Ag(I)复合物对H2O2具有较高的催化活性，可用来制备新型电化学传感器。
(2)设置Ag(I)或GSH作为信号输入，对H2O2的电催化信号作为信号输出，构建了2个YES逻辑门。
(3)设置Ag(I)和GSH作为信号输入1和2，对H2O2的电催化信号作为信号输出，构建了AND逻辑门。
(4)设置GSSH和NADPH作为信号输入1和2，对H2O2的电催化信号作为信号输出，构建了AND逻辑门。
(5)设置NADP+和GSSG作为信号输入1和2，对H2O2的电催化信号作为信号输出，构建了AND-AND逻辑门。
(6)设置NADP+、GSSG和Ag(I)作为信号输入1，2和3，对H2O2的电催化信号作为信号输出，构建了AND-AND-AND逻辑门。
(7)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现逻辑门的构建。
综上所述，本发明是构建了基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，具有操作简单、分析快速、易于操作等优点，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器对H2O2的电催化实验图；
图2为本发明中Ag(I)“YES”逻辑门的构建；
图3为本发明中GSH“YES”逻辑门的构建；
图4为本发明中Ag(I)/GSH“AND”逻辑门的构建；
图5为本发明中GSSG/NADPH“AND”逻辑门的构建；
图6为本发明中NADP+/GSSG“AND-AND”逻辑门的构建；
图7为本发明传感器对NADP+、GSSG和Ag(I)三输入“AND-AND-AND”逻辑门的构建。
具体实施方式
实施例1 GSH-Ag(I)CP的制备和传感器的制备
(1)GSH-Ag(I)CP的制备
依次取5μL浓度为1mM的硝酸银水溶液、5μL浓度为1mM谷胱甘肽水溶液，混合均匀后加入磷酸缓冲溶液(10mM，pH 7.0，Na2HPO4/NaH2PO4)配成60μL的溶液，将溶液在37℃下缓缓震荡11min，即得到GSH-Ag(I)CP，使用前将该CP溶液与60μL 0.02％wt Nafion溶液混合均匀，静置12min。
(2)电化学生物传感器的制备
a.将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上依次用粒径0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光2min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗3min，然后用N2吹干，记为GCE；
b.利用循环伏安法，设置电位范围为-1.5～0.5V、扫速15mV/s将1.4mg/mL石墨烯(GO)醋酸分散液(pH 5.0)电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；；然后取8μL(1)中溶液滴涂于GO/GCE上，室温下静置30min，用超纯水缓缓冲洗电极，记为CP/GO/GCE。
检测以上所述三种电极和CP/GCE对含5mM的PBS(0.1M，pH7.0)的电化学响应及构建的传感器CP/GO/GCE对PBS(0.1M，pH 7.0)有无H2O2的电化学响应，见图1。可看出制备的传感器CP/GO/GCE相比较于其他电极，电化学响应很明显，且对H2O2有良好的电催化活性(无H2O2时没有明显电信号产生)。
实施例2 Ag(I)“YES”逻辑门的构建
按实施例1的GSH-Ag(I)CP的制备，对比存在Ag(I)和不存在Ag(I)时制得聚合物构建的传感器对H2O2的电化学响应，构建Ag(I)的“YES”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000051
结果如图2所示，证明有Ag(I)存在时，对H2O2有良好的电化学响应，符合“YES”逻辑门特征。
实施例3 GSH“YES”逻辑门的构建
按实施例1的GSH-Ag(I)CP的制备，对比存在GSH和不存在GSH时制得聚合物构建的传感器对H2O2的电化学响应，构建GSH的“YES”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000052
结果如图3所示，证明有GSH存在时，对H2O2有良好的电化学响应，符合“YES”逻辑门特征。
实施例4 Ag(I)/GSH“AND”逻辑门的构建
按实施例1的GSH-Ag(I)CP的制备，对比GSH(输入1)和Ag(I)(输入2)两个输入制得聚合物构建的传感器对H2O2的电化学响应，构建Ag(I)/GSH的“AND”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000061
结果如图4所示，证明有GSH和Ag(I)同时存在时，对H2O2有良好的电化学响应，符合“AND”逻辑门特征。
实施例5 GSSG/NADPH“AND”逻辑门的构建
在离心管中有100μL的反应液，含有GSSG(1mM)、NADPH(0.5mM)和GSR(10U)，置于水浴锅中37℃反应2min，然后按上述实施例1的传感器制备步骤，代替GSH制备复合物用于修饰电极，取5μL反应液用于制备传感器，随后用于检测对含5mM H2O2的PBS(0.1M，pH7.0)的电化学响应，并基于GSSG(输入1)和NADPH(输入2)双输入构建“AND”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000062
结果如图5所示，证明有GSSG和NADPH同时存在时，对H2O2有良好的电化学响应，主要原因是生成的GSH能与Ag(I)反应形成配位聚合物，符合“AND”逻辑门特征。
实施例6 NADP+/GSSG“AND-AND”逻辑门的构建
在离心管中有100μL的反应液，含有葡萄糖6-磷酸(G6P)(10mM)，氧化态的还原型辅酶II(NADP+)(1mM)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)(50U)，GSSG(1mM)和GSR(10U)，37℃下反应10min，然后按上述实施例1的传感器制备步骤，代替GSH制备复合物用于修饰电极，取5μL反应液用于制备传感器，随后用于检测对含5mM H2O2的PBS(0.1M，pH 7.0)的电化学响应，并基于NADP+(输入1)和GSSG(输入2)双输入构建“AND-AND”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000071
结果如图6所示，证明有NADP+和GSSG同时存在时，对H2O2有良好的电化学响应，主要原因是生成的GSH能与Ag(I)反应形成配位聚合物，符合“AND-AND”逻辑门特征。
实施例7 NADP+、GSSG和Ag(I)三输入“AND-AND-AND”逻辑门的构建
在离心管中有100μL的反应液，含有葡萄糖6-磷酸(G6P)(10mM)，氧化态的还原型辅酶II(NADP+)(1mM)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)(50U)，GSSG(1mM)和GSR(10U)，37℃下反应10min，然后按上述实施例1的传感器制备步骤，代替GSH与Ag(I)反应制备复合物用于修饰电极，取5μL反应液用于制备传感器，随后用于检测对含5mM H2O2的PBS(0.1M，pH7.0)的电化学响应，并基于NADP+(输入1)、GSSG(输入2)和Ag(I)(输入3)三输入构建“AND-AND-AND”逻辑门，如下表：
Figure BSA0000214582740000072
结果如图7所示，证明有NADP+、GSSG和Ag(I)同时存在时，对H2O2有良好的电化学响应，主要原因是生成的GSH能与Ag(I)反应形成配位聚合物，符合“AND-AND-AND”逻辑门特征。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (4)

1.基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，具体制备步骤如下：
(1)GSH-Ag(I)CP的制备
依次取1～10μL浓度为0.1～20mM的硝酸银水溶液、1～10μL浓度为0.1～20mM谷胱甘肽水溶液，混合均匀后加入磷酸缓冲溶液配成50～120μL的溶液，将溶液在25～40℃下缓缓震荡8～17min，即得到GSH-Ag(I)CP，使用前将GSH-Ag(I)CP溶液与50～120μL 0.02％wtNafion溶液混合均匀，静置5～20min；
(2)电化学生物传感器的制备
a.将玻碳电极在麂皮上依次用粒径0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光0.5～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗1～5min，然后用N2吹干，记为GCE；
b.利用循环伏安法，设置电位范围为-1.5～0.5V、扫速5～20mV/s将0.7～2.4mg/mL石墨烯GO醋酸分散液电沉积到裸玻碳电极上得到GO/GCE；然后取5～15μL步骤(1)中溶液滴涂于GO/GCE上，室温下静置20～60min，用超纯水缓缓冲洗电极，记为CP/GO/GCE；
(3)逻辑门的构建
100μL总体积的反应液包括：葡萄糖6-磷酸1～20mM，氧化态的还原型辅酶II0.01～10mM，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶0.5～30U，GSSG 1～50mM和GSR 0.5～30U，37℃下反应2～10min，将该反应液代替步骤(1)中的GSH实现GSH-Ag(I)CP的制备，其余步骤同(1)和步骤(2)；改变输入信号和输出信号，实现逻辑门的设计。
2.根据权利要求1所述的基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，其特征在于，步骤(1)中磷酸缓冲溶液由Na2HPO4/NaH2PO4配制，浓度为10M，pH＝7.0。
3.根据权利要求1所述的基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，其特征在于，步骤(2)中醋酸分散液pH＝5.0。
4.根据权利要求1所述的基于谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的电化学逻辑门，其特征在于：所有逻辑门都以H2O2电化学信号为信号输出，不同逻辑门具有不同的输入信号：①以Ag(I)为信号输入构建“YES”逻辑门；②以GSH为信号输入构建“YES”逻辑门；③以Ag(I)和GSH为信号输入构建“AND”逻辑门；④以GSSG和NADPH为信号输入构建“AND”逻辑门；⑤以NADP+和GSSG为信号输入构建“AND-AND”逻辑门；⑥以NADP+、GSSG和Ag(I)为信号输入构建“AND-AND-AND”逻辑门。
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