CN103411949A

CN103411949A - 利用sers技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法

Info

Publication number: CN103411949A
Application number: CN2013102542857A
Authority: CN
Inventors: 赵冰; 于治; 阮伟东; 王旭; 宋薇
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-11-27

Abstract

利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法，属于血清中葡萄糖含量检测技术领域。其是通过葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成过氧化氢分子，在所产生的过氧化氢分子的存在下，通过加入辣根过氧化物酶使显色底物分子被催化为其氧化态，通过该氧化态分子的表面增强拉曼信号的强度大小来间接判断血清中葡萄糖含量。该方法不仅可以实现低血糖疾病患者的血糖含量的检测，还为对人体内该类物质的检测提供了一种新的方法。

Description

利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法

技术领域

本发明属于血清中葡萄糖含量检测技术领域，具体涉及一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法。

背景技术

血液中的糖称为血糖，绝大多数情况下都是葡萄糖。体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在清晨空腹血糖浓度为80～120毫克％。空腹血糖浓度超过130毫克％称为高血糖。如果血糖浓度超过160～180毫克％，就有一部分葡萄糖随尿排出，这就是糖尿。血糖浓度低于70毫克％称为低血糖。可见于饥饿时间过长，持续的剧烈体力活动，严重肝肾疾病，垂体前叶机能减退、肾上腺皮质机能减退等。低血糖时，脑组织首先对低血糖出现反应，表现为头晕、心悸、出冷汗以及饥饿感等。如果血糖持续下降到低于45毫克％，就可发生低血糖昏迷。

酶催化反应是生命体内一类极其普遍并具有专一性的反应，不同的酶可以针对其自身所对应的某一物质，进行专一性的催化氧化反应。酶催化反应在化学分析领域同样受到广泛的关注，通过这种专一性的催化氧化反应，实现了不同物质的定性或定量分析，该反应由于具有高效性和专一性得到了各个领域广泛使用。

葡萄糖检测的方法主要为葡萄糖氧化酶法，该方法利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖的催化氧化作用以及利用酶自身专一性特点，将葡萄糖氧化，产物为葡萄糖酸和过氧化氢，通过检测产生的过氧化氢的含量就可以间接地实现葡萄糖的检测。对于过氧化氢的检测，也是应用了酶催化氧化作用，利用辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下将底物分子氧化以致显色这一原理，通过颜色变化来检测过氧化氢含量的变化，进而实现葡萄糖的检测。

SERS技术可以在分子水平上给出有关物质结构的信息，选择性好，灵敏度高，不需要超高真空条件，以非破坏性的光子为探针，即使和红外光谱技术相比，拉曼光谱也有自己独特的优点，特别是对于水溶液体系的研究。SERS技术与酶催化反应的联用可以给出催化产物的指纹信息，这些指纹信息对于间接定量体系中葡萄糖含量发挥着重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种在液态环境下，利用表面增强拉曼光谱技术，对血液中葡萄糖的含量进行定量分析的方法。该方法将SERS技术与酶催化反应技术相结合，利用酶分子对反应物分子进行专一性的催化氧化反应这一特点，使待测物质被催化氧化转化为另外一个分子，并采集催化氧化后所得到的产物的SERS信息，即可以达到对待测物实现专一性检测的目的，同时也利用了SERS技术自身的优势（快速、灵敏、不受体系中水的影响），从而提高血糖分子检测的灵敏度，并且可以克服传统检测血糖的方法上存在的操作步骤复杂、检测效率低等局限性。

本发明首先利用葡萄糖氧化酶对葡萄糖分子专一性催化氧化的特性，将待测葡萄糖氧化的同时产生过氧化氢，随后，体系中的辣根过氧化物酶在过氧化氢的存在下能够使显色底物3,3,5,5-四甲基联苯胺分子氧化，溶液体系因此变为蓝色。通过加入硫酸进行终止反应，将反应后的溶液与金溶胶混合，采集其SERS信息，通过对所得到的拉曼光谱进行分析，实现葡萄糖定量检测的目的。该发明对体系环境的要求较低，因此大大简化了检测步骤，故本发明为葡萄糖的检测提供了一种专一性强、灵敏度高的手段。

利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法如下：

(a)葡萄糖标准水溶液的配置：配置多组（5～20）已知浓度（可以分别为5.55mmoL/L、4.995mmoL/L、4.44mmoL/L、3.885mmoL/L、3.33mmoL/L、2.775mmoL/L、2.22mmoL/L、1.665mmoL/L和1.11mmoL/L）的葡萄糖标准水溶液；

(b)辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶混合酶溶液的制备，其中葡萄糖氧化酶的含量为13000U/L，辣根过氧化物酶的含量为900U/L；

(c)显色底物的配置：将10mg显色底物（3,3,5,5,-四甲基联苯胺、邻苯二胺、4-氨基安替比林等）溶解在1mL DMSO（二甲基亚砜）中，然后将此溶液用磷酸缓冲液（pH=7.4）稀释10倍，最后取9mL稀释后的溶液与1mL步骤（b）中所述的混合酶溶液混合，并用磷酸缓冲溶液再稀释一倍；

(d)标准溶液显色：取步骤（a）中的葡萄糖标准水溶液各100uL于离心管中，然后分别加入1mL步骤（c）中所述的显色底物，室温下孵育15min，随后加入50uL终止剂（2M硫酸）；

(e)分别取显色后的溶液各10uL与890uL表面增强试剂（金溶胶）混合，并加入100uL乙腈作为内标物进，行SERS测试，得到SERS光谱图，以1191cm^-1处峰的强度对葡萄糖的浓度建立定量分析标准曲线；

(f)采集葡萄糖浓度未知的血清样本100uL于离心管中，然后分别加入1mL步骤（c）中所述的显色底物，室温下孵育15min，随后加入50uL终止剂（2M硫酸）；取显色后的溶液10uL与890uL表面增强试剂（金溶胶）混合，并加入100uL乙腈作为内标物，进行SERS测试，得到SERS光谱图，将1191cm^-1处峰的强度代入步骤(e)所建立的定量分析标准曲线，得到血清中葡萄糖的浓度数值，从而实现对血清样本中葡萄糖的定量检测。

内标物的选择依据该内标物所产生的信号是否对信号分子的特征峰产生干扰。本发明主要利用了乙腈特征峰（2260cm^-1）不干扰体系中探针分子的振动信息。这样依据其特征峰的信号强度对底物表面增强拉曼光谱进行相对强度的矫正。

上述方法中所述的与表面增强试剂混合，主要是将经过酶催化氧化后的底物分子吸附到金溶胶中的金纳米粒子表面，利用金纳米粒子的表面等离子体共振对分子散射信号的增强作用，可以实现较低浓度的葡萄糖的检测。金溶胶是氯金酸溶液在沸腾的状态下被柠檬酸钠还原制得的，金纳米粒子大多呈球形，平均粒径为20纳米。所用的光谱仪为共聚焦拉曼光谱仪，可采用激发光源的波长范围为400～1000nm。

上述方法中所说的葡萄糖广泛存在于生命体中，他是生命体中不可或缺的一种重要的物质。本发明将SERS技术引入该检测体系，实现了葡萄糖的快速灵敏检测。由于氧化后的底物分子展现出较高的SERS活性，将该分子与表面增强试剂混合，采集SERS光谱，会得到随着葡萄糖浓度变化的SERS谱图。通过绘制光谱特征峰的强度与葡萄糖浓度的关系曲线，实现对葡萄糖的定量分析。本发明在酶催化检测领域中有着广泛地应用前景，本发明不受体系中水分的影响，可以维持良好的生物液态环境。有助于维持酶分子的生物活性。因此，本发明在生物体系的检测中有着巨大的应用潜力。

附图说明

图1：本发明所述的利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖含量的过程示意图；

图2：实施例1所述的不同浓度的葡萄糖溶液经过酶催化氧化后，所得到氧化态的显色底物的SERS谱图；

图3：1191cm^-1处的峰强随葡萄糖浓度变化的定量分析关系曲线。

图1为本发明的实施过程示意图，先加入一定量的葡萄糖标准溶液，随后加入葡萄糖氧化酶以及辣根过氧化物酶的混合溶液，加入显色底物，显色10分钟后，溶液颜色由无色透明变为蓝色，加入硫酸终止该反应，此时溶液由蓝色变为亮黄色。之后将反应后的溶液与表面增强试剂（金溶胶）混合，此时溶液变为紫色，随后进行SERS测试。

图2为所得到的随着葡萄糖浓度变化的SERS光谱图，由图可以看出，光谱强度随着葡萄糖溶液的浓度的降低而降低，因此可以作为葡萄糖定量分析的手段。

图3为以1191cm^-1处的峰强为基准，所建立的葡萄糖定量分析曲线。根据显色后底物分子的拉曼指纹图谱，实现对葡萄糖的间接定量分析。

具体实施方式

实施例1：

1)葡萄糖标准溶液的配置:将葡萄糖配置成如下标准水溶液：5.55mM，4.995mM，4.44mM，3.885mM，3.33mM，2.775mM，2.22mM，1.665mM和1.11mM。

2)酶溶液的制备：配置葡萄糖氧化酶以及辣根过氧化物酶的混合溶液（用磷酸缓冲溶液PBS直接溶解混合即可），其中葡萄糖氧化酶的含量为13000U/L，辣根过氧化物酶的含量为900U/L。

3)金纳米粒子的制备：取1mg/mL的氯金酸溶液1mL，加入99mL的超纯水（电导率为18.0MΩcm^-1），加热至沸腾，然后加入4mL、1mg/mL的柠檬酸钠溶液，保持沸腾状态，待溶液变成酒红色，维持沸腾状态15min，停止反应，得到100mL酒红色的金溶胶，作为表面增强试剂备用。

4)显色底物的配置：称取10mg的3,3,5,5-四甲基联苯胺粉末，溶于1mL二甲基亚砜中，然后加入9mL磷酸缓冲溶液（PBS），得到浓度为1mg/mL的显色溶液。取配置好的显色溶液9mL加入1mL步骤2）中配置的酶混合溶液，摇匀，并用磷酸缓冲溶液稀释一倍。

5)分别取不同浓度的葡萄糖标准溶液各100uL并加入步骤4）中所得到的显色底物1mL，室温下放置15分钟，加入50uL终止剂（2M硫酸）。

6)取步骤5）中得到的溶液10uL，加入金溶胶890uL，加入乙腈溶液100uL。进行SERS测试，采集拉曼光谱。以拉曼光谱中1191cm^-1处峰的强度对葡萄糖的浓度建立定量分析的标准曲线（如图3）。

7)取牛血清样品（购买得到），向血清中加入葡萄糖（牛血清样品中葡萄糖的浓度为2.22mM），然后取该配置好的血清样品100uL并加入步骤4）中所得到的显色底物1mL，室温下放置15分钟。取本步骤得到的溶液10uL，加入金溶胶890uL，加入乙腈溶液100uL。采集拉曼光谱，读取1191cm^-1处的峰的强度值，带入到步骤6）中得到的标准曲线关系式，计算血清中葡萄糖的含量值，并且与已知的浓度值（2.22mM）相对比，验证本实验的准确度，结果测得平均回收率为103.3%。

Claims

1.一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其步骤如下：

(a)葡萄糖标准水溶液的配置：配置多组已知浓度的葡萄糖标准水溶液；

(b)辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶混合酶溶液的制备：其中葡萄糖氧化酶的含量为13000U/L，辣根过氧化物酶的含量为900U/L；

(c)显色底物的配置：将10mg显色底物溶解在1mL DMSO中，然后将此溶液用磷酸缓冲液稀释10倍，最后取9mL稀释后的溶液与1mL步骤（b）中所述的混合酶溶液混合，并用磷酸缓冲溶液再稀释一倍；

(d)标准溶液显色：取步骤（a）中的葡萄糖标准水溶液各100uL于离心管中，然后分别加入1mL步骤（c）中所述的显色底物，室温下孵育15min，随后加入50uL终止剂；

(e)分别取显色后的溶液各10uL与890uL表面增强试剂混合，并加入100uL乙腈作为内标物进，行SERS测试，得到SERS光谱图，以1191cm^-1处峰的强度对葡萄糖的浓度建立定量分析标准曲线；

(f)采集葡萄糖浓度未知的血清样本100uL于离心管中，然后分别加入1mL步骤（c）中所述的显色底物，室温下孵育15min，随后加入50uL终止剂；取显色后的溶液10uL与890uL表面增强试剂混合，并加入100uL乙腈作为内标物，进行SERS测试，得到SERS光谱图，将1191cm^-1处峰的强度代入步骤(e)所建立的定量分析标准曲线，得到血清中葡萄糖的浓度数值，从而实现对血清样本中葡萄糖的定量检测。

2.如权利要求1所述的一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：显色底物为3,3,5,5,-四甲基联苯胺、邻苯二胺或4-氨基安替比林。

3.如权利要求1所述的一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：表面增强试剂为金溶胶，是在液态环境下氯金酸经过柠檬酸钠还原制得。

4.如权利要求1所述的一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：SERS测试所使用的仪器为共聚焦型拉曼光谱仪，激发光光源的波长范围为400～1000nm。

5.如权利要求1所述的一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：终止剂为2M的硫酸。

6.如权利要求1所述的一种利用SERS技术间接检测血清中葡萄糖的方法，其特征在于：配置5～20组已知浓度的葡萄糖标准水溶液。