CN112014336A - 一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于级联反应检测α‑葡萄糖苷酶活性的普适性方法，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，f‑FeNC单原子纳米酶能够通过催化过氧化氢将无色的3,3',5,5'‑四甲基联苯胺氧化成显蓝色的3,3',5,5'‑氧化态四甲基联苯胺，催化显色反应将检测信号进行放大，在652 nm处产生紫外吸收峰，测试紫外光谱；葡萄糖浓度越高，溶液颜色越深，吸光度值越大，从而确定葡萄糖的含量，葡萄糖为α‑葡萄糖苷酶底物的产物，从而确定α‑葡萄糖苷酶的活性。纳米酶催化的显色反应放大了检测信号，葡萄糖是各种α‑葡萄糖苷酶底物的共有产物，比色法信号直观、测试方便，因此该方法灵敏度高、普适性好且操作简便。
Description
一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体是涉及一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，即一种利用纳米酶参与的级联反应进行α-葡萄糖苷酶活性测定的方法。
背景技术
α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，简写为α-Glu），是一种位于小肠黏膜刷状缘的膜结合酶，能催化多糖或寡糖中α-吡喃葡萄糖苷键的特异性水解，进而产生葡萄糖，为人体提供能量物质。α-葡萄糖苷酶功能异常会导致代谢类疾病，如体内酸性α-葡萄糖苷酶缺乏，糖原不能正常代谢，会引发溶酶体贮积症，即庞贝病；反之，α-葡萄糖苷酶活性过高会加速碳水化合物的吸收，引发餐后高血糖。因此，α-葡萄糖苷酶已经成为庞贝病筛选、糖尿病治疗中最重要的生物标志物，并可用于筛选天然活性药物。
现有的α-葡萄糖苷酶检测方法主要有比色法、荧光法、电化学方法等，几乎都是基于4-硝基苯酚、抗坏血酸等酶解产物进行检测。多数方法灵敏度较低且底物专一，忽略了各种底物的共有产物-葡萄糖-在检测中的应用。中国专利CN110823939A虽公开了一种利用1HNMR法检测寡糖分解产生的葡萄糖来计算α-葡萄糖苷酶比活力值的方法，但仪器昂贵且需专业操作人员，多种氘代试剂的使用和冷冻离心等处理也增加危害性和操作难度。此外，已报道的方法常涉及多种纳米材料的合成（Biosens. Bioelectron., 2016, 79, 728；CN108918478A）或材料的表面修饰（Sensor. Actuat. B-Chem., 2017, 245, 282），繁琐耗时。因此，现有α-葡萄糖苷酶检测技术在灵敏度、普适性和操作的简便性方面仍有一定的缺陷。
经济、简便且灵敏的葡萄糖检测方法对于开发可操作性强、普适性高且灵敏高效的α-葡萄糖苷酶测定技术是非常必要的。过氧化物酶法是最常用的葡萄糖检测法，基于葡萄糖氧化酶（GOx）与过氧化物酶的级联催化反应进行葡萄糖的检测，灵敏度高且操作简便。但天然酶稳定性差、价格昂贵。纳米酶与天然酶相比，具有高稳定性和低成本等优势，特别是具有极高催化效率和原子利用率的单原子纳米酶，在检测领域表现出巨大潜力。目前还未见α-葡萄糖苷酶、GOx及单原子纳米酶的级联催化反应在α-葡萄糖苷酶活性检测中的相关报道。
发明内容
针对目前α-葡萄糖苷酶测定法大多灵敏度和普适性较差，且操作复杂的缺陷，我们发展了一种基于α-葡萄糖苷酶、GOx及单原子纳米酶之间的级联催化反应进行α-葡萄糖苷酶活性检测的比色方法。纳米酶催化的显色反应放大了检测信号，葡萄糖是各种α-葡萄糖苷酶底物的共有产物，比色法信号直观、测试方便，因此该方法灵敏度高、普适性好且操作简便。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，f-FeNC单原子纳米酶能够通过催化过氧化氢将无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化成显蓝色的3,3',5,5'-氧化态四甲基联苯胺，催化显色反应将检测信号进行放大，在652 nm处产生紫外吸收峰，测试紫外光谱；葡萄糖浓度越高，溶液颜色越深，吸光度值越大，从而确定葡萄糖的含量，葡萄糖为α-葡萄糖苷酶底物的产物，从而确定α-葡萄糖苷酶的活性。
（1）铁单原子纳米酶的制备。0.1 g五水合柠檬酸铁与30 mL甲酰胺超声处理30min后转移到40 mL反应釜中，于180℃下反应12小时。产物用超纯水离心清洗三次（10000rpm，10 min），冷冻干燥，该样品标记为f-FeNC。同时，制备不含铁的材料（f-NC）作为对比。利用透射电子显微镜、X射线光电子能谱仪和X射线衍射仪表征制备的材料。
（2）f-FeNC的过氧化物酶活性的考察。f-FeNC具有过氧化物酶活性是利用其构建级联反应体系用于α-葡萄糖苷酶检测的前提条件。以3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）为过氧化物酶底物考察f-FeNC的催化活性。30μL TMB (10 mmol/L)、10μL H2O2 (100 mM)和5μLf-FeNC溶液(0.05 mg/mL)依次加入到955μL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2 mol/L, pH 4.4)中，室温下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。
（3）葡萄糖的检测。α-葡萄糖苷酶活性检测是通过测定其催化产生的葡萄糖的量进行的，因此，首先对葡萄糖检测性能进行考察。100μL系列浓度葡萄糖和50μL GOx (0.1mg/mL) 在37℃孵育40 min后，依次加入800μL醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L, pH 4.4)、5μLf-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30μL TMB (10 mmol/L)。室温下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱，并记录652 nm处吸光度。将吸光度与葡萄糖浓度进行线性拟合，确定线性范围和检出限。
（4）α-葡萄糖苷酶的检测。100μL对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖吡喃苷(NPGlu, 10mmol/L)、100μL系列活力的α-葡萄糖苷酶和50μL GOx (0.1 mg/mL)混匀后，在37℃孵育40min。随后，依次加入700μL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2 mol/L, pH 4.4)、5μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30μL TMB溶液(10 mmol/L)，室温下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱，并记录652 nm处吸光度。将吸光度与α-葡萄糖苷酶活性之间进行线性拟合，确定线性范围和检出限。将100μL α-葡萄糖苷酶替换为100μL其他蛋白和酶(1 mg/mL)，包括牛血清蛋白（BSA）、胰蛋白酶（Trypsin）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、碱性磷酸酶（ALP）、胰酶（Pancreatin）、溶菌酶（Lysozyme）考察方法的选择性。
（5）检测方法的底物普适性。100μL 10 mmol/L底物（NPGlu、蔗糖、麦芽糖）与100μLα-葡萄糖苷酶(1 U/mL)和50μL GOx (0.1 mg/mL)混匀后，在37℃孵育40 min。随后，向反应液中依次加入700μL的醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L, pH 4.4)、5μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30μL TMB溶液(10 mM)，室温反应20 min后，测量其在652 nm处吸光度。同时，以不加α-葡萄糖苷酶的实验作为对照。
有益效果
本专利申请首次基于α-葡萄糖苷酶、GOx及单原子纳米酶的级联催化反应比色检测α-葡萄糖苷酶活性。高催化效率的单原子纳米酶能够通过催化显色反应将检测信号进行放大，灵敏度优于现有技术至少一个数量级（Anal Chim Acta, 2017, 973, 91；J. Mater. Chem. C, 2017, 5, 2826；Sensor. Actuat. B-Chem., 2017, 245, 282；Biosens. Bioelectron., 2016, 79, 728；CN108918478A）；葡萄糖为各种α-葡萄糖苷酶底物的共有产物，可拓展用于其它底物体系，普适性好；此外，该方法还具有信号直观、选择性高、操作简便等优点。
附图说明
图1（A）f-FeNC和（B）f-NC的透射电子显微镜图。f-FeNC和f-NC的（C）X射线光电子能谱图和（D）X射线衍射图；
图2 f-FeNC的过氧化物酶活性；
图3葡萄糖检测：（A）系列葡萄糖浓度下，检测体系的紫外可见吸收光谱图。（B）652 nm处吸光度与葡萄糖浓度的关系图及线性范围；
图4 α-葡萄糖苷酶检测：（A）系列α-葡萄糖苷酶活性下，检测体系的紫外可见吸收光谱图；（B）652 nm处吸光度与α-葡萄糖苷酶活性的关系图及线性范围；
图5 α-葡萄糖苷酶检测的选择性；
图6底物普适性；利用（A）NPGlu、（B）蔗糖和（C）麦芽糖检测α-葡萄糖苷酶的可行性。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
（1）f-FeNC的制备。将0.1 g五水合柠檬酸铁加入到30 mL甲酰胺中，超声处理30 min后转移到40 mL反应釜中，180℃下反应12小时。获得的黑色产物经超纯水离心清洗三次（10000 rpm，10 min）后，冷冻干燥。f-NC制备步骤与f-FeNC相同，只是不加五水合柠檬酸铁。利用透射电子显微镜、X射线光电子能谱仪和X射线衍射仪对制备的材料进行结构表征。从透射电子显微镜图可以看出，f-FeNC呈聚集的颗粒状（图1A），而f-NC为带状（图1B），铁元素的引入引起了形貌变化。X射线光电子能谱图也证实了铁元素的存在（图1C）。f-NC材料在2θ=27°处出现尖锐的衍射峰，为碳氮相的（022）特征峰；f-FeNC衍射峰也在2θ=27°处，但峰稍宽且强度降低（图1D），表明铁的掺入一定程度上降低了f-NC材料的结晶度。此外，无其他衍射峰出现，说明制备的f-FeNC中不含铁或铁氧化物的纳米颗粒，铁元素以单个原子的形式分散在NC材料中。以上表征说明成功制备了含铁的单原子纳米材料。
（2）f-FeNC的过氧化物酶活性考察。以TMB考察f-FeNC其过氧化物酶活性，具体实施方案为：30μL TMB (10 mmol/L)、10μL H2O2 (100 mM)和5μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)依次加入到955μL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2 mol/L pH 4.4)中，室温下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。同时，不加f-FeNC作为对照。从图2结果可知，TMB和H2O2的反应液吸收峰较弱，加入f-FeNC后，吸收峰明显增强，证明f-FeNC具有较好的过氧化物酶活性，能够催化H2O2氧化TMB。
（3）葡萄糖的检测。100μL系列浓度的葡萄糖和50μL GOx (0.1 mg/mL)在37℃水浴中孵育40 min后，依次加入800μL的醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L, pH 4.4)、5μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30μL TMB溶液(10 mM)。室温反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。如图3所示，在0-1.0 mmol/L的范围内，随葡萄糖浓度增加，吸收峰逐渐增强。将652 nm处吸光度与葡萄糖浓度进行线性拟合，线性范围为：0.01-0.08和0.08-0.5 mmol/L，检出限为5.6μmol/L。
（4）α-葡萄糖苷酶的检测。将100μL NPGlu (10 mmol/L)、100μL系列活力的α-葡萄糖苷酶和50μL GOx (0.1 mg/mL)混匀后，37℃孵育40 min。随后，依次加入700μL醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L, pH 4.4)、5μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30μL TMB溶液(10 mM)，室温反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。如图4所示，在0-0.2 U/mL的范围内，随α-葡萄糖苷酶活性增加，吸收峰逐渐增强。将652 nm处吸光度与α-葡萄糖苷酶活性进行线性拟合，线性范围为：0.005-0.04和0.04-0.1 U/mL，检出限为0.0022 U/mL。将100μL α-葡萄糖苷酶替换为100μL BSA、Trypsin、AChE、ALP、Pancreatin或Lysozyme，这些蛋白和酶不能引起检测体系吸光度变化（图5），表明该检测体系对α-葡萄糖苷酶检测具有较好的选择性。
（5）检测方法的底物普适性。NPGlu、蔗糖和麦芽糖为例，100μL底物（10 mmol/L）与100μL α-葡萄糖苷酶(1 U/mL)和50μL GOx (0.1 mg/mL)混匀后，在37℃水浴中孵育40min。随后，依次加入700μL醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L pH 4.4)、5μL f-FeNC溶液(0.05mg/mL)和30μL TMB溶液(10 mM)，室温下反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。图6表明，对于NPGlu、蔗糖和麦芽糖，加入α-葡萄糖苷酶后，检测体系吸收峰均增强，表明这三种底物都能用于构建α-葡萄糖苷酶检测平台，该方法具有较好的底物普适性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (7)
1.一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，f-FeNC单原子纳米酶能够通过催化过氧化氢将无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化成显蓝色的3,3',5,5'-氧化态四甲基联苯胺，催化显色反应将检测信号进行放大，在652 nm处产生紫外吸收峰，测试紫外光谱；葡萄糖浓度越高，溶液颜色越深，吸光度值越大，从而确定葡萄糖的含量，葡萄糖为α-葡萄糖苷酶底物的产物，从而确定α-葡萄糖苷酶的活性。
2.根据权利要求1所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将样品、α-葡萄糖苷酶和GOx混匀后，37℃孵育40 min，依次加入醋酸-醋酸钠缓冲、f-FeNC溶液和TMB溶液，室温反应后，测量其紫外可见吸收光谱；利用吸光度值与葡萄糖浓度进行线性拟合，测定葡萄糖的含量，得到α-葡萄糖苷酶活性的线性范围；
（2）测定待测样品的吸光度值，确定α-葡萄糖苷酶活性。
3.根据权利要求2所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，α-葡萄糖苷酶活性线性范围为：0.005-0.1 U/mL。
4.根据权利要求1-3之一所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，f-FeNC单原子纳米酶的制备方法为：将0.1 g五水合柠檬酸铁加入到30 mL甲酰胺中，超声处理30 min后转移到40 mL反应釜中，180℃下反应12小时，获得的黑色产物经超纯水离心清洗三次（10000 rpm，10 min）后，冷冻干燥得到。
5.根据权利要求2所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，所述的步骤（1）的过程为：将100μL 样品(10 mmol/L)、100 μL系列活力的α-葡萄糖苷酶和50 μL GOx (0.1 mg/mL)混匀后，37℃孵育40 min，依次加入700 μL醋酸-醋酸钠缓冲(0.2 mol/L, pH 4.4)、5 μL f-FeNC溶液(0.05 mg/mL)和30 μL TMB溶液(10 mM)，室温反应20 min后，测量其紫外可见吸收光谱。
6.根据权利要求5所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，所述的系列活力的α-葡萄糖苷酶为0.005-0.2 U/mL。
7.根据权利要求2所述的一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法，其特征在于，所述的样品中的底物为NPGlu、蔗糖或麦芽糖。
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