CN115236019A - 一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析检测领域，具体公开了一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系及其应用；所述检测体系包括：酶：1）铁基纳米酶和葡萄糖氧化酶或者2）铁基纳米酶和胆固醇氧化酶；溶液：HAc‑NaAc缓冲液和3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺乙醇溶液；所述铁基纳米酶基于PVCL由原位合成法制备。本发明利用制备的铁基纳米酶的过氧化物酶活性，以3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺(TMB)为底物，利用比色法，构建灵敏度高、检测范围宽的生物分析检测体系，用于检测葡萄糖和胆固醇，同时以真实患者临床检测尿样为检测样本，通过对比临床检验结果证实该方法的准确性，可用于制备相关生物分子的检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体公开了一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系及其应用。
背景技术
近年来，高效液相色谱法(HPLC)、电化学发光法、光谱法被广泛用于葡萄糖和胆固醇的检测，这些方法虽表现出较高的灵敏度，但需要较高的设备成本，检测时间长，且需要专业人士进行操作。
科学家们发现，将生物学与纳米技术结合，可以制备一种同时具备纳米材料和模拟酶特性的人工酶，即“纳米酶”。作为具有明显类酶活性的纳米材料，纳米酶因稳定性强、催化活性可调节、制备简单等特点，展现出很好的应用潜力。目前，文献报道的纳米酶主要分为以下四类：金属氧化物基纳米酶、金属基纳米酶、碳基纳米酶和其他种类纳米酶。在不同条件下，大多数这些纳米酶都表现出多种类酶的催化活性，包括过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化酶(OXD)等，在H2O2存在条件下，过氧化物酶能够将无色底物氧化成有色产物，可与比色法结合，实现对生物分子的检测。这些特殊的性质为纳米酶在生物医学领域提供了更广泛的应用范围。
如何结合纳米酶的上述性质，开发出更多的检测方法，制备临床上更易使用的检测葡萄糖和胆固醇检测体系/试剂盒，使其具有更高的灵敏度，和准确性，以及更低的检测限是非常有价值的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明公开了一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系及其应用；本发明结合纳米酶的上述性质，开发出更便捷、准确的生物分子检测方法，制备更适合临床使用的葡萄糖和胆固醇检测体系/试剂盒，使其具有更高的灵敏度、准确性以及更低的检测限。
本发明的技术方案如下：
一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，包括以下组分：
酶：1)铁基纳米酶和葡萄糖氧化酶或者2)铁基纳米酶和胆固醇氧化酶；
溶液：HAc-NaAc缓冲液和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液；
所述铁基纳米酶由以下步骤制备获得：选择N-乙烯基己内酰胺VCL和N-羟甲基丙烯酰胺NMAM为聚合单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，通过回流沉淀法制备P(VCL-co-NMAM)纳米微球，在此基础上使用P2O5对纳米水凝胶进行磷酸酯化，再与Fe2+离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的铁基纳米酶。本方案利用制备的铁基纳米酶(FeCPNGs)的过氧化物酶活性，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)为底物，利用比色法，构建灵敏度高、检测范围宽的生物分析检测体系，用于检测葡萄糖和胆固醇。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，所述酶为1)铁基纳米酶和葡萄糖氧化酶。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，由以下步骤建立：
a葡萄糖梯度浓度的建立：向1.5～2.0mL纯水中依次加入200～300μL 0.02～0.8mM梯度浓度的葡萄糖溶液和50～100μL 0.5～2.0mg/mL葡萄糖氧化酶(GOD)溶液，混匀，并分别在37℃下分别孵育5～60min；
b标准曲线的建立：向步骤a所得溶液中依次加入1.7～2.0mL0.1～0.2MHAc-NaAc缓冲液，200～300μL5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20～80μL1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min，采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出葡萄糖浓度-吸光度的标准曲线。在一些实施例中，吸光度值与葡萄糖浓度在0.02～0.8mM范围内表现为良好的线性关系，可用于葡萄糖的定量检测。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，所述葡萄糖氧化酶GOx的浓度为0.5～2.0mg/mL。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，在制备尿液葡萄糖浓度检测试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集糖尿病患者的尿样，借助离心机以6000～12000r/min的转速处理10～20min，保留上清液；
(2)用纯水将尿样上清液稀释10～100倍，使葡萄糖浓度在标准曲线的线性范围内；
(3)将250μL尿样稀释液和50～100μL 0.5～2.0mg/mL葡萄糖氧化酶GOD溶液依次加入1.5～2.0mL纯水中，混匀，在37℃下孵育5～60min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.5～2.0mL 0.1～0.3MHAc-NaAc缓冲液，其pH4.0～5.0；200～300μL 5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及20～80μL1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min；然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。在一些实施例中，检测限(LOD)为0.7μM(检测限＝3σ/S，其中σ为空白的标准差(σ＝0.0003mM)，S为标准曲线的斜率)，低于其他相似材料的检测限。不同葡萄糖浓度的溶液颜色区别明显，表明可以通过视觉辨别葡萄糖浓度的大小，检测过程直观便捷，对操作人员要求低。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，所述酶为2)铁基纳米酶和胆固醇氧化酶。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，由以下步骤建立：
a胆固醇梯度浓度的建立:向1.5～2.0mL纯水中依次加入200～300μL0.1～1.5mM梯度浓度的胆固醇溶液和50～100μL0.5～3.0mg/mL胆固醇氧化酶ChOx溶液，混匀，并在37℃下分别孵育5～60min；
b向步骤a所得溶液中依次加入1.7～2.0mL0.1～0.2MHAc-NaAc缓冲液,其pH3.0～5.0；200～300μL5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20～80μL1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min；采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出胆固醇浓度-吸光度的标准曲线。在一些实施例中，胆固醇浓度在0.1～2.0mM时与吸光度呈良好的线性关系，相关方程为A＝1.5049C+0.4494，线性回归系数R＝0.9979，检测限(LOD)为0.5μM(检测限＝3σ/S，其中σ为空白的标准差(σ＝0.0003mM)，S为标准曲线的斜率)，低于其他相似材料的检测限。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，所述胆固醇氧化酶ChOx的浓度为0.5～3.0mg/mL。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，在制备血清胆固醇浓度检测试剂盒中的应用，包括以下步骤：
(1)采集血清样本，借助离心机以3000-10000r/min的转速处理10-30min，以清除其他碎屑；
(2)使用乙醇水溶液，将血清稀释10-30倍，使血清胆固醇浓度在标准曲线的线性范围内；
(3)将250μL血清稀释液和50-100μL 0.5～3.0mg/mL胆固醇氧化酶溶液依次加入1.5-2.0mL纯水中，混匀，在37℃下孵育5～60min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.5-2.0mL0.1-0.3MHAc-NaAc缓冲液，pH3.0-5.0，200-300μL5-20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20-80μL1-3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5-10min；然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。
由于以上优点，使用本方案所述的生物分析检测体系用于制备胆固醇浓度检测试剂盒，可以实现高灵敏度的便捷检测。
进一步的，上述一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，所述最大吸收波长为640～660nm。在一些实施例中发现，652nm处的吸光度值随胆固醇浓度的增加而线性增加，灵敏度达到最佳。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果:
本发明选择N-乙烯基己内酰胺(PVCL)和N-羟甲基丙烯酰胺(NMAM)为聚合单体，通过回流沉淀聚合法制备了P(VCL-co-NMAM)纳米水凝胶，在此基础上通过五氧化二磷酯化和Fe2+离子螯合，制备得到一种新型的铁基纳米模拟酶(FeCPNGs)。通过研究，证明FeCPNGs纳米酶具有优异的过氧化物酶催化活性，能够在H2O2存在下催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)生成蓝色氧化物，表明具有催化H2O2分解为氧化性极强的羟基自由基(·OH)的能力。
利用铁基纳米酶的类过氧化物酶催化活性，通过比色法检测葡萄糖和胆固醇。葡萄糖或胆固醇在O2存在条件下，被葡萄糖氧化酶或胆固醇氧化酶催化产生H2O2。在铁基纳米酶的催化作用下，H2O2可以有效转化为羟基自由基(·OH)，进一步氧化TMB生成蓝色氧化物。基于以上原理，本发明以TMB为底物，利用紫外分光光度法分析纳米酶催化氧化TMB生成氧化物的量间接测定葡萄糖和胆固醇的浓度，其检测机理如图4所示。本发明利用制备的铁基纳米酶(FeCPNGs)的过氧化物酶活性，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)为底物，利用比色法，构建灵敏度高、检测范围宽的生物分析检测体系，用于检测葡萄糖和胆固醇，同时以真实患者临床检测尿样和血样为检测样本，通过对比临床检验结果证实该方法的可靠性与准确性。可用于制备相关的检测试剂盒，实现高灵敏度，高准确性，低检测限的检测。
附图说明
图1为不同葡萄糖浓度的铁基纳米酶检测体系紫外吸收光谱图(a)，曲线浓度由下往上依次升高；葡萄糖浓度与吸光度的线性关系(b)；
图2为不同葡萄糖浓度的检测体系颜色变化；
图3为不同胆固醇浓度的紫外吸收光谱图(a)，曲线浓度由下往上依次升高；和胆固醇浓度与紫外吸光度的线性关系(b)；
图4为铁基纳米酶检测葡萄糖、胆固醇机制示意图；
图5为本发明制备的铁基纳米酶的XPS谱图，以2θ±0.2°衍射角表示的XPS图在18°，28°，34°，36°处显示特征峰；
图6为本发明制备的铁基纳米酶的TEM图像；
图7(a)TMB(最下方的线)，TMB+H2O2(中间的线)，TMB+H2O2+FeCPNGs(最上的线)溶液的紫外吸收光谱(TMB:4mM；H2O2:0.1mM；FeCPNGs:0.3mg/mL)，其中插图:对应到相应曲线的三个反应体系；(b)不同酶浓度对TMB过氧化物酶催化活性的影响，图中的曲线，由下往上浓度依次增加；
图8为FeCPNGs稳态动力学分析，(a)TMB浓度为400μM，改变H2O2浓度；(b)基于Michaelis-Menten方程的双倒数Lineweaver-Burk图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
葡萄糖检测体系的建立
(1)将250μL不同浓度的葡萄糖溶液(0.02～0.8mM)和50μL2mg/mL葡萄糖氧化酶(GOD)溶液依次加入1.7mL纯水中，混匀，在37℃下孵育30min；
(2)向步骤(1)所得溶液中依次加入1.7mL0.2MHAc-NaAc缓冲液(pH4.0)，260μL10mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及40μL2mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5min。然后，采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出葡萄糖浓度-吸光度的标准曲线。
实施例2
尿液样本葡萄糖检测
(1)采集糖尿病患者的尿样，借助离心机以10000r/min的转速处理15min，保留上清液。
(2)用纯水将尿样上清液稀释100倍，使葡萄糖浓度在标准曲线的线性范围内。
(3)将250μL尿样稀释液和50μL2mg/mL葡萄糖氧化酶(GOD)溶液依次加入1.7mL纯水中，混匀，在37℃下孵育30min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.7mL0.2MHAc-NaAc缓冲液(pH4.0)，260μL10mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及40μL2mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5min。然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。
实施例3
葡萄糖浓度检测结果分析
图1(a)显示了不同葡萄糖浓度的紫外吸收光谱。结果表明，吸光度随葡萄糖浓度的增大而增大。绘制的标准曲线如图1(b)所示，吸光度值与葡萄糖浓度在0.02～0.8mM范围内表现为良好的线性关系，可用于葡萄糖的定量检测。其线性回归方程为A＝1.0994C+0.0303，线性回归系数R＝0.9949，检测限(LOD)为0.7μM(检测限＝3σ/S，其中σ为空白的标准差(σ＝0.0003mM)，S为标准曲线的斜率)，低于其他相似材料的检测限(表1)。不同葡萄糖浓度的溶液颜色变化如图2所示，表明可以通过视觉辨别葡萄糖浓度的大小，我们还比较了不同纳米材料葡萄糖检测的线性范围，结果如表1所示。
表1 不同纳米材料葡萄糖检测的线性范围
实施例4
尿液样本检测结果
对不同程度的糖尿病患者的尿液进行检测，结果如表2所示，本实验方法检测结果与临床尿检结果基本一致，表明基于铁基纳米酶的检测体系是可靠的，可以很好地量化实际样本中的葡萄糖含量。
表2 不同方法糖尿病患者尿糖浓度检测结果
实施例5
胆固醇检测体系的建立
(1)将250μL不同浓度的胆固醇溶液(0.02～0.8mM)和50μL1mg/mL胆固醇氧化酶(ChOx)溶液依次加入1.7mL纯水中，混匀，在37℃下孵育30min；
(2)向步骤(1)所得溶液中依次加入1.7mL0.2MHAc-NaAc缓冲液(pH4.0)，260μL10mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及40μL2mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5min。然后，采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出胆固醇浓度-吸光度的标准曲线。
实施例6
血清样本胆固醇检测
(1)采集血清样本，借助离心机以5000r/min的转速处理20min，以清除其他碎屑。
(2)使用乙醇水溶液(体积比1:1)的将血清稀释20倍，使血清胆固醇浓度在标准曲线的线性范围内。
(3)将250μL血清稀释液和50μL1mg/mL胆固醇氧化酶(ChOx)溶液依次加入1.7mL纯水中，混匀，在37℃下孵育30min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.7mL0.2MHAc-NaAc缓冲液(pH4.0)，260μL10mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及40μL2mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5min。然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。
实施例7
胆固醇浓度检测结果分析
如图3(a)所示，652nm处的吸光度值随胆固醇浓度的增加而逐渐增加。如图3(b)所示，胆固醇浓度在0.1～2.0mM时与吸光度呈良好的线性关系，相关方程为A＝1.5049C+0.4494，线性回归系数R＝0.9979，检测限(LOD)为0.5μM(检测限＝3σ/S，其中σ为空白的标准差(σ＝0.0003mM))，S为标准曲线的斜率)，低于其他相似材料的检测限，见表3。
表3 不同纳米材料胆固醇检测的线性范围
实施例8
血清样本胆固醇检测结果
不同志愿者的血清样本胆固醇含量的检测结果如表4所示，本检测体系的检测结果与临床检测结果保持一致。证实了该检测方法的准确性与可靠性。
表4 不同方法志愿者血清胆固醇浓度检测结果
实施例9
铁基纳米酶(FeCPNGs)的制备
所述铁基纳米酶由以下步骤制备获得：选择N-乙烯基己内酰胺VCL和N-羟甲基丙烯酰胺NMAM为聚合单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，通过回流沉淀法制备P(VCL-co-NMAM)纳米微球，在此基础上使用P2O5对纳米水凝胶进行磷酸酯化，再与Fe2+离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的铁基纳米酶。
(1)P(VCL-co-NMAM)纳米微球的制备
通过回流沉淀聚合技术制备P(VCL-co-NMAM)纳米微球。首先，将0.3160g N-乙烯基己内酰胺(VCL)、0.3160gN-羟甲基丙烯酰胺(NMAM)、0.1264g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)及0.0126g的偶氮二异丁腈(AIBN)加入至50mL单口烧瓶中，再向其中加入20mL乙腈溶剂，室温下超声分散均匀。搭建回流装置，搅拌速度300r/min，连续升温至90℃后反应2h。反应结束后，反应混合物呈白色乳液。倾出反应混合物，用离心机离心15min(5000r/min)分离生成的纳米水凝胶，再用无水乙醇重复离心洗涤3次。经过冷冻干燥，得到白色粉末状固体。
(2)P(VCL-co-NMAM)纳米微球的磷酸酯化
五氧化二磷(P2O5)与P(VCL-co-NMAM)纳米凝胶中的羟基发生酯化反应得到磷酸酯化物，基于以上原理，制备纳米水凝胶的磷酸酯化微球。实验操作步骤如下：向50mL三口烧瓶中加入2g纳米微球、30mL四氢呋喃(THF)，常温下超声分散均匀。搭建回流装置，搅拌速度600r/min，恒温水浴加热至50℃，随后将1g无水P2O5分3批投入至反应体系。反应溶液在70℃连续回流4h后结束反应。冷却至室温后，使用离心机在转速7000r/min下离心10min，再用无水乙醇重复离心洗涤3次。经冷冻干燥后，得到白色固体粉末。
(3)铁基纳米酶(FeCPNGs)的制备
将1.5g酯化微球、6g或10.5gFeCl2及20mL无水乙醇依次加入50mL的单口烧瓶中，超声分散均匀后，在400r/min转速下将其回流加热至60℃。反应2h后，借助旋转蒸发仪将乙醇溶剂除去，得到粗产品。使用无水乙醇洗涤粗产品，再用旋蒸法除去无水乙醇。经冷冻干燥后，得到灰白色粉末状产品，即最终产物铁基纳米酶。
对制备的铁基纳米酶进行理化测试，其XPS谱图见图5所示，XPS图显示了2θ＝18°，28°，34°，36°时铁基纳米酶(FeCPNGs)的主要衍射峰，对应于FeCPNGs的(200)、(131)、(041)和(241)面，这与Fe3(PO4)2·8H2O和FePOs一致。此外，采用XPS研究了FeCPNGs的成分及元素的价态。133eV处出现的峰(P2s)代表磷酸酯的形成，710eV处出现的特征峰(Fe2ps)对应于Fe2+，进一步确认了磷酸酯基与FeCl2成功螯合。
FeCPNGs磷钨酸染色的TEM图像如图6所示，结果表明制备的铁基纳米酶的粒径在541nm～794nm范围内，且具有规则的球型形貌。对铁基纳米酶进行过氧化物酶催化活性测试，结果见图7。针对不同浓度H2O2的铁基纳米酶(FeCPNGs)酶促动力学结果表明(图8)，与天然辣根过氧化物酶类似，铁基纳米酶(FeCPNGs)遵循典型的Michae l i s-Menten模型。FeCPNGs的Vmax为8.711×10-8M/s，Km为1.95mM，与HRP相近，表明所制备的FeCPNGs具有与HRP相似的过氧化物酶催化活性，对底物H2O2具有良好的亲和性。
以上所述实施例仅表达了本发明的有限几种优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，包括以下组分：
酶：1)铁基纳米酶和葡萄糖氧化酶或者2)铁基纳米酶和胆固醇氧化酶；
溶液：HAc-NaAc缓冲液和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺乙醇溶液；
所述铁基纳米酶以2θ±0.2°衍射角表示的XPS图在18°，28°，34°，36°处显示特征峰。
2.根据权利要求1所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系
所述铁基纳米酶由以下步骤制备获得：选择N-乙烯基己内酰胺VCL和N-羟甲基丙烯酰胺NMAM为聚合单体，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺MBA为交联剂，偶氮二异丁腈AIBN为引发剂，通过回流沉淀法制备P(VCL-co-NMAM)纳米微球，在此基础上使用P2O5对纳米水凝胶进行磷酸酯化，再与Fe2+离子进行螯合，最终形成具有过氧化物酶活性的铁基纳米酶。
3.根据权利要求1所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，所述酶为1)铁基纳米酶和葡萄糖氧化酶。
4.根据权利要求3所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，由以下步骤建立：
a葡萄糖梯度浓度的建立：向1.5～2.0mL纯水中依次加入200～300μL0.02～0.8mM梯度浓度的葡萄糖溶液和50～100μL 0.5～2.0mg/mL葡萄糖氧化酶GOD溶液，混匀，并分别在37℃下分别孵育5～60min；
b标准曲线的建立：向步骤a所得溶液中依次加入1.7～2.0mL、0.1～0.2M、pH值为3.0～5.0的HAc-NaAc缓冲液，200～300μL 5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20～80μL 1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min，采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出葡萄糖浓度-吸光度的标准曲线。
5.如权利要求4所述的基于铁基纳米酶的生物分析检测体系在制备尿液葡萄糖浓度检测体试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集糖尿病患者的尿样，借助离心机以6000～12000r/min的转速处理10～20min，保留上清液；
(2)用纯水将尿样上清液稀释10～100倍，使葡萄糖浓度在标准曲线的线性范围内；
(3)将250μL尿样稀释液和50～100μL 0.5～2.0mg/mL葡萄糖氧化酶GOD溶液依次加入1.5～2.0mL纯水中，混匀，在37℃下孵育5～60min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.5～2.0mL0.1～0.3MHAc-NaAc缓冲液，其pH3.0～5.0；200～300μL 5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)乙醇溶液及20～80μL1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min；然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。
6.根据权利要求1所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，所述酶为2)铁基纳米酶和胆固醇氧化酶。
7.根据权利要求6所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，由以下步骤建立：
a胆固醇梯度浓度的建立:向1.5～2.0mL纯水中依次加入200～300μL0.1～1.5mM梯度浓度的胆固醇溶液和50～100μL 0.5～3.0mg/mL胆固醇氧化酶ChOx溶液，混匀，并在37℃下分别孵育5～60min；
b向步骤a所得溶液中依次加入1.7～2.0mL 0.1～0.2MHAc-NaAc缓冲液，其pH3.0～5.0；200～300μL 5～20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20～80μL1～3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5～10min；采用紫外分光光度法对样品进行吸光度的测量，并观察最大吸收波长下吸光度的变化规律，绘制出胆固醇浓度-吸光度的标准曲线。
8.根据权利要求7所述的一种基于铁基纳米酶的生物分析检测体系，其特征在于，所述胆固醇氧化酶ChOx的浓度为0.5～3.0mg/mL。
9.如权利要求7或8任一项所述的基于铁基纳米酶的生物分析检测体系在制备血清胆固醇浓度检测体试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集血清样本，借助离心机以3000-10000r/min的转速处理10-30min，以清除其他碎屑；
(2)使用乙醇水溶液，将血清稀释10-30倍，使血清胆固醇浓度在标准曲线的线性范围内；
(3)将250μL血清稀释液和50-100μL 0.5～3.0mg/mL胆固醇氧化酶溶液依次加入1.5-2.0mL纯水中，混匀，在37℃下孵育5～60min；
(4)向步骤(3)所得溶液中依次加入1.5-2.0mL0.1-0.3MHAc-NaAc缓冲液，pH3.0-5.0，200-300μL5-20mM3,3’,5,5’-四甲基联苯胺TMB乙醇溶液及20-80μL1-3mg/mL铁基纳米酶分散液，混匀，在室温下孵育5-10min；然后，用紫外-可见分光光度计测定在不同波长下的吸光度曲线，并记录最大吸收波长下的吸光度。
10.根据权利要求4或7任一项所述的生物分析检测体系，其特征在于，所述最大吸收波长为640～660nm。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20221025 |