CN108801998A - 一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于贵金属纳米材料和比率荧光探针的制备技术领域,具体涉及一种基于溶菌酶稳定的铜纳米簇复合物及其比率荧光探针的制备方法。以水合肼为还原剂,溶菌酶为稳定剂制备了铜纳米簇。胆碱氧化酶催化胆碱产生过氧化氢,过氧化氢与辣根过氧化物酶氧化邻苯二胺生成二氨基酚嗪。由于二氨基酚嗪与铜纳米簇之间发生内滤效应,随着胆碱浓度的增加,二氨基酚嗪的荧光逐渐增强,而铜纳米簇的荧光被二氨基酚嗪逐渐猝灭,基于此可构建铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光峰强度比率与胆碱浓度之间的线性关系,即制得比率荧光探针。该探针的制备方法简单,成本低,产品灵敏度高,可发展成为一种新颖的比率荧光探针,用于生物样品中胆碱的高效检测。
Description
技术领域:
本发明属于贵金属纳米材料和比率荧光探针的制备技术领域,具体涉及一种基于溶菌酶稳定的铜纳米簇复合物及其比率荧光探针的制备方法,其制备的探针可用于胆碱的高效检测。
背景技术:
胆碱是哺乳动物必需的营养物质,胆碱衍生物在人类健康的发展中起着重要的作用。胆碱的前体乙酰胆碱是一种神经递质,它对神经系统和全身主要器官的功能至关重要。胆碱还可作为甲基供体甘氨酸甜菜碱的前体,参与单碳代谢。胆碱的缺乏可导致肝损害、神经系统疾病、细胞死亡、以及癌症。奶制品中含有胆碱,婴幼儿的营养摄入量一般仅限于普通牛奶,所以添加胆碱对人体健康非常重要。胆碱的水平异常在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病中起重要作用。胆碱含量变化对人体健康和疾病造成很大的影响,因此胆碱的定量测定在临床分析中具有重要意义。胆碱的传统检测方法是色谱法,但该方法存在耗时长、操作复杂、条件苛刻、成本高等问题。相比而言,发展基于生物传感器的分析方法可在一定程度上克服色谱法存在的问题。
当前,基于生物传感器的胆碱分析方法有电化学法、比色法、荧光法、化学发光法等。文献检索表明,Qin等基于金纳米粒子修饰的碳纳米管聚合物构建了电流传感器用于胆碱的测定(Amperometric biosensors based on gold nanoparticles-decorated multi-walled carbon nanotubes-poly(diallyldimethylammonium chloride)biocompositefor the determination of choline,Xia Qin,Huicai Wang,Xinsheng Wang,ZhiyingMiao,Lili Chen,Wei Zhao,Miaomiao Shan,Qiang Chen,Sensors and Actuators B-Chemical,2010,147,593–598);Sanz-Vicente等依据分析酶促反应中荧光信号的变化,发展了水溶性磷脂胆碱的测定方法(Enzymatic methods for choline-containing watersoluble phospholipids based on fluorescence of choline oxidase:Application tolyso-PAF,Isabel Sanz-Vicente,Andres Domínguez,Carlos Ferrandez,Javier Galban,Analytical Biochemistry,2017,519,30–37)。
尽管当前发展的生物传感器方法可用于胆碱的检测,但这些方法需要昂贵的仪器、耗时和繁琐的操作,由于普遍采用了单信号检测模式,导致了测量结果的不稳定性。单信号检测模式依赖信号的强度来定性和定量目标物的浓度,而其强度往往受到体系和环境条件的影响。基于此,采用双信号强度比值处理即获得信号的比率强度,具备自校准功能,有效消除了自体和背景信号产生的干扰,提高了目标物检测结果的准确性和可靠性。贵金属纳米簇是一种重要的发光纳米材料,具有尺寸依赖的理化性质,因其尺寸小、水溶性好、光稳定性高、具备生物相容性和低毒性等优点,已被广泛用于构建荧光探针。迄今为止,尚未有采用比率荧光探针方法检测胆碱,以及基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针来检测胆碱的国内外文献和专利报道。
发明内容:
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足,设计一种操作简单、成本低廉、灵敏度高的基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法。
为了实现上述目的,本发明涉及的一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法其制备工艺包括以下步骤:
(1)铜纳米簇的制备:将2毫克五水合硫酸铜加入到5毫升二次蒸馏水中,配制成硫酸铜水溶液。在磁力搅拌下,将0.3克溶菌酶溶于10毫升二次蒸馏水,直至其完全溶解,然后将溶菌酶水溶液放置在45摄氏度的恒温水浴中孵化。在磁力搅拌下,将硫酸铜水溶液缓慢加入溶菌酶水溶液中,制备溶菌酶与硫酸铜的混合水溶液,在45摄氏度水浴中搅拌10分钟。向混合水溶液中加入1摩尔/升的氢氧化钠溶液,将pH调至10-11,滴加质量浓度为50%的水合肼调整混合水溶液的颜色从蓝色变为紫色,然后在45摄氏度水浴中搅拌反应10-24小时;
(2)反应结束后,将制备的铜纳米簇混合水溶液进行高速离心处理,去除不溶物,取上层清液透析5-10小时。透析后取出混合溶液进行旋蒸处理,将混合溶液中90%的水蒸发去除,剩余的溶液放入冷冻干燥箱中进行干燥。将干燥后得到的铜纳米簇分散于磷酸盐水缓冲液(0.2摩尔/升,pH为7.0)中备用;
(3)二氨基吩嗪混合溶液的配制:称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中,制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液。量取200微升该邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升不同浓度的过氧化氢水溶液;
(4)铜纳米簇与二氨基吩嗪混合溶液的配制:将步骤(3)中配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟,然后加入40微升步骤(2)中制得的磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇,缓慢搅拌均匀,在室温下放置10分钟,得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液;
(5)测量步骤(4)中不同的过氧化氢摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系;
(6)量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶(0.2摩尔/升,pH为7.0)和10微升不同浓度的胆碱水溶液,在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟,然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中,室温下放置10分钟,得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液;
(7)测定不同的胆碱浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系,构建出检测胆碱的比率荧光探针。
本发明涉及的步骤(2)中所述的铜纳米簇尺寸为2~5纳米;步骤(3)中所述的过氧化氢摩尔浓度为1-50毫摩尔/升;步骤(4)中所述的铜纳米簇质量浓度为5-30克/升;步骤(7)中所述的胆碱浓度范围为0.01-100微摩尔/升,胆碱的检测极限为5-10纳摩尔/升。
本发明与现有技术相比,以水合肼为还原剂,溶菌酶为稳定剂制备了铜纳米簇。胆碱氧化酶催化胆碱产生过氧化氢,过氧化氢与辣根过氧化物酶氧化邻苯二胺生成二氨基酚嗪。由于二氨基酚嗪与铜纳米簇之间发生内滤效应,随着胆碱浓度的增加,二氨基酚嗪的荧光逐渐增强,而铜纳米簇的荧光被二氨基酚嗪逐渐猝灭,基于此可构建铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光峰强度比率与胆碱浓度之间的线性关系,即制得比率荧光探针;其制备方法简单,成本低,产品灵敏度高,可发展成为一种新颖的比率荧光探针,用于生物样品中胆碱的高效检测。
附图说明:
图1为本发明涉及的一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法原理示意图;
图2为本发明涉及的胆碱比率荧光探针随着胆碱摩尔浓度增大对铜纳米簇和二氨基酚嗪荧光发射峰强度的响应,以及荧光峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系。
具体实施方式:
下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1:
本实施例涉及的一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法其制备工艺与原理如图1所示,具体工艺步骤为:
铜纳米簇的制备:将2毫克五水合硫酸铜加入到5毫升二次蒸馏水中,配制成硫酸铜水溶液。在磁力搅拌下,将0.3克溶菌酶溶于10毫升二次蒸馏水,直至其完全溶解,然后将溶菌酶水溶液放置在45摄氏度的恒温水浴中孵化。在磁力搅拌下,将硫酸铜水溶液缓慢加入溶菌酶水溶液中,制备溶菌酶与硫酸铜的混合水溶液,在45摄氏度水浴中搅拌10分钟。向混合水溶液中加入1摩尔/升的氢氧化钠溶液,将pH调至10-11,滴加质量浓度为50%的水合肼调整混合水溶液的颜色从蓝色变为紫色,然后在45摄氏度水浴中搅拌反应10-24小时。将制备的铜纳米簇混合水溶液进行高速离心处理,去除不溶物,取上层清液透析5-10小时。透析后取出混合溶液进行旋蒸处理,将混合溶液中90%的水蒸发去除,剩余的溶液放入冷冻干燥箱中进行干燥。将干燥后得到的铜纳米簇分散于磷酸盐水缓冲液(0.2摩尔/升,pH为7.0)中备用;
二氨基吩嗪混合溶液的配制:称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中,制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液。量取200微升该邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升1-10毫摩尔/升的过氧化氢水溶液;
铜纳米簇与二氨基吩嗪混合溶液的配制:将配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟,然后加入40微升磷酸盐水缓冲液分散的10克/升铜纳米簇,缓慢搅拌均匀,在室温下放置10分钟,得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液;
测量不同的过氧化氢摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系。量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶(0.2摩尔/升,pH为7.0)和10微升不同浓度的胆碱水溶液,在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟,然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中,室温下放置10分钟,得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液;
测定不同的胆碱浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系,构建出检测胆碱的比率荧光探针。分别测定不同的胆碱摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱(参见图2a),拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度比率IDAP/ICuNCs与胆碱摩尔尔浓度CCholine之间的线性关系(参见图2b)即:IDAP/ICuNCs=0.07232+0.03035CCholine(R2=0.9992),构建出胆碱的比率荧光探针,其中胆碱检测的浓度范围为0.01~80微摩尔/升,胆碱的检测极限为5纳摩尔/升。
实施例2:
本实施例中铜纳米簇制备的具体工艺步骤同实施例1。称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中,制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液。量取200微升该邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升5-20毫摩尔/升的过氧化氢水溶液。将配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟,然后加入40微升制得的磷酸盐水缓冲液分散的20克/升铜纳米簇,缓慢搅拌均匀,在室温下放置10分钟,得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液。测量不同的过氧化氢摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系。
量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶(0.2摩尔/升,pH为7.0)和10微升不同浓度的胆碱水溶液,在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟,然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中,室温下放置10分钟,得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液。测定不同的胆碱浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系,构建出检测胆碱的比率荧光探针,胆碱检测的浓度范围为0.02~80微摩尔/升,胆碱的检测极限为8纳摩尔/升。
实施例3:
本实施例中铜纳米簇制备的具体工艺步骤同实施例1。称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中,制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液。量取200微升该邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升10-50毫摩尔/升的过氧化氢水溶液。将配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟,然后加入40微升制得的磷酸盐水缓冲液分散的25克/升铜纳米簇,缓慢搅拌均匀,在室温下放置10分钟,得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液。测量不同的过氧化氢摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系。
量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶(0.2摩尔/升,pH为7.0)和10微升不同浓度的胆碱水溶液,在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟,然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中,室温下放置10分钟,得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液。测定不同的胆碱浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系,构建出检测胆碱的比率荧光探针,胆碱检测的浓度范围为0.05~100微摩尔/升,胆碱的检测极限为10纳摩尔/升。
实施例4:
本实施例涉及到实施例1中制备的比率荧光探针的应用,将其用于生物样品如人血清中胆碱的检测,胆碱摩尔浓度检测范围为0.01-80微摩尔/升,胆碱的检测极限可达5纳摩尔/升。与现有技术相比,如文献Analytical Biochemistry,2017,519,30-37采用单一荧光信号探针,而非双信号比率荧光探针检测胆碱。本发明对人血清样品中胆碱的检测回收率为98.0~99.8%,相对标准偏差为1.7-2.3%。相比现有技术,本发明比率荧光探针对胆碱的检测回收率更高,相对标准偏差更低,且制备工艺简单,成本低,产品灵敏度高,可发展成为一种新颖的胆碱比率荧光探针,用于生物样品中胆碱的高效检测。
Claims (1)
1.一种基于铜纳米簇复合物的比率荧光探针检测胆碱的方法,其特征在于,该方法具体包括以下步骤:
(1)铜纳米簇的制备:将2毫克五水合硫酸铜加入到5毫升二次蒸馏水中,配制成硫酸铜水溶液。在磁力搅拌下,将0.3克溶菌酶溶于10毫升二次蒸馏水,直至其完全溶解,然后将溶菌酶水溶液放置在45摄氏度的恒温水浴中孵化。在磁力搅拌下,将硫酸铜水溶液缓慢加入溶菌酶水溶液中,制备溶菌酶与硫酸铜的混合水溶液,在45摄氏度水浴中搅拌10分钟。向混合水溶液中加入1摩尔/升的氢氧化钠溶液,将pH调至10-11,滴加质量浓度为50%的水合肼调整混合水溶液的颜色从蓝色变为紫色,然后在45摄氏度水浴中搅拌反应10-24小时;
(2)将制备的铜纳米簇混合水溶液进行高速离心处理,去除不溶物,取上层清液透析5-10小时。透析后取出混合溶液进行旋蒸处理,将混合溶液中90%的水蒸发去除,剩余的溶液放入冷冻干燥箱中进行干燥。将干燥后得到的铜纳米簇分散于磷酸盐水缓冲液(0.2摩尔/升,pH为7.0)中备用;
(3)二氨基吩嗪混合溶液的配制:称取162毫克邻苯二胺溶于磷酸盐水缓冲液中,制得3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液。量取200微升该邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1.5克/升的辣根过氧化物酶和10微升不同浓度的过氧化氢水溶液;
(4)铜纳米簇与二氨基吩嗪混合溶液的配制:将步骤(3)中配制的混合溶液在37摄氏度下避光反应30分钟,然后加入40微升步骤(2)中制得的磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇,缓慢搅拌均匀,在室温下放置10分钟,得到铜纳米簇与二氨基酚嗪的均质溶液;
(5)测量步骤(4)中不同的过氧化氢摩尔浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质水溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基酚嗪荧光发射峰强度与过氧化氢浓度之间的线性关系;
(6)量取200微升3毫摩尔/升的邻苯二胺溶液,向其中加入10微升1克/升的辣根过氧化物酶(0.2摩尔/升,pH为7.0)和10微升不同浓度的胆碱水溶液,在37摄氏度下避光搅拌反应30分钟,然后将40微升磷酸盐水缓冲液分散的铜纳米簇加入反应混合物中,室温下放置10分钟,得到铜纳米簇/二氨基酚嗪/胆碱的均质溶液;
(7)测定不同的胆碱浓度下,铜纳米簇与二氨基酚嗪均质溶液的荧光发射光谱,拟合铜纳米簇与二氨基吩嗪荧光发射峰强度比率与胆碱摩尔浓度之间的线性关系,构建出检测胆碱的比率荧光探针。
本发明涉及的步骤(2)中所述的铜纳米簇尺寸为2~5纳米;步骤(3)中所述的过氧化氢摩尔浓度为1-50毫摩尔/升;步骤(4)中所述的铜纳米簇质量浓度为5-30克/升;步骤(7)中所述的胆碱浓度范围为0.01-100微摩尔/升,胆碱的检测极限为5-10纳摩尔/升。
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