CN107478621A - 借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生h2o2的生物分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，首先，制备铜氮共掺杂碳点Cu‑CDs；然后，将可代谢产生H2O2的生物分子与对应的氧化酶反应生成H2O2，用辣根过氧化酶催化H2O2，与底物邻苯二胺反应生成有黄色荧光的氧化产物DAP；接着，加入Cu‑CDs，DAP与Cu‑CDs形成比率荧光，两者荧光强度的比值I572/I460与待测物浓度呈线性关系，根据两者荧光强度的比值，定量测定血清中生物分子，灵敏度高、检测简便，具有免疫反应的高选择性、高亲和力。

Description

借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分 子的方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光比率技术和生物分析检测领域，具体涉及基于新型铜氮共掺杂碳点的比率荧光探针定量可代谢产生 H2O2生物分子的测定平台的构建。
背景技术
碳点作为功能性纳米碳族的新成员，由于其化学惰性，良好的溶剂分散性，优异的光吸收性和低毒性，吸引了大量的研究。荧光碳点的使用领域很广泛，包括生物成像、医疗诊断和体内失踪等方面。此前为解决碳点量子产率低的缺憾，提出了表面钝化、功能化和掺杂其它元素如N、S的方法。这种杂质掺杂优化碳点性能的方法因其操作简便和性能优越，获得了显着的研究关注。如水热法掺杂N碳点、S掺杂高量子产率碳点和N、S共掺杂的碳点，都显示出了独特的荧光特性。目前此方面的研究主要集中在非金属元素掺杂碳点，对于金属元素掺杂碳点的研究还很少，有必要对金属掺杂碳点的合成和性能应用进行探索。
胆固醇和黄嘌呤作为体内重要的生物分子，其在体内的含量的检测对疾病状态的诊断具有重要的参考意义。胆固醇在形成胆酸、构成细胞膜和合成激素方面必不可少，黄嘌呤是尿酸代谢的重要中间体。目前，胆固醇和黄嘌呤测定方法主要有色谱法和氧化酶比色法，荧光检测尚属研究阶段。传统氧化酶比色法测定中，血清中可代谢产生H2O2的生物分子首先与相应的氧化酶作用生成H2O2，主要采用氧化HRP显色底物以其紫外吸收强度定量生物分子。而荧光色谱法高灵敏性、选择性和快速测定的特点使其在生物测定分析领域具有良好的应用前景。同时，比率荧光方法是荧光方法的进一步优化，具有选择性好、抗干扰、稳定、快速的特点，将其应用于检测，可提高检测的灵敏度和选择性。目前将铜氮共掺杂碳点应用于荧光比率测定可代谢产生H2O2生物分子的测定平台构建研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对上面所述的问题，提出一种借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2生物分子的方法，基于铜氮共掺杂碳点进行，具有灵敏度高、检测简便、测定范围广的特点，可用于血清中多种生物分子的测定，如胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等。
本文所采用的铜氮共掺杂碳点(Cu-CDs)具有稳定的荧光性能，可与邻苯二胺(OPD)的氧化物(DAP，具有黄色荧光)发生相互作用，使荧光淬灭。而邻苯二胺作为HRP的催化底物，被广泛应用于可产生H2O2的生物分子(如胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸和谷氨酸等)的氧化酶比色法测定中，因此，将 Cu-CDs与DAP制备成比率荧光通用检测平台，可广泛应用于该类生物分子的检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，步骤如下：
(1)、制备铜氮共掺杂碳点(Cu-CDs)；首先用一锅法合成了铜掺杂的碳点Cu-CDs，是以一水合柠檬酸、二乙烯三胺、乙酸铜一水合物为原料,三者的摩尔比为6:2:1，以去离子水为溶剂，在 200-250℃反应12-20h后获得，产物的粒径均一，约1-2nm，分散性良好，显示出良好的抗光漂白和光稳定性。由于表面基团的修饰和Cu的掺杂，该碳点具有非激发光依赖的荧光特性，有别于通常的碳点；
(2)、将生物分子与相应的氧化酶(如胆固醇和胆固醇氧化酶、黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶)反应生成H2O2，将H2O2用辣根过氧化酶(HRP)催化，与底物邻苯二胺(OPD)反应生成有黄色荧光的氧化产物(DAP)；生物分子与相应氧化酶混合后，按照混合后总体积1.0mL加入10μL浓度为1-5mg/mL氧化酶的比例加入辣根过氧化酶；反应体系是在25-37℃反应20-45min；
(3)、在步骤(2)的体系中加入步骤(1)获得的Cu-CDs， DAP的荧光随待测物浓度增大而增强，而Cu-CDs则反之，DAP 与Cu-CDs形成比率荧光，两者荧光强度的比值I572/I460与待测物浓度呈线性关系，根据两者荧光强度的比值，定量测定血清中生物分子。
荧光测定激发波长为380nm，DAP发射波长572nm，Cu-CDs 发射波长460nm，以I572/I460与待测物的浓度相关关系定量其浓度。 Cu-CDs以磷酸盐缓冲液溶液的形式加入，加入量为20μL，浓度为 20-200μg/mL，加入Cu-CDs后在25-37℃反应1min。
本发明所涉及的定量检测可代谢产生H2O2生物分子的原理是：各生物分子可在其特定的生物氧化酶作用下生产H2O2(如如胆固醇与胆固醇氧化酶、黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶)；H2O2在HRP的催化下将其无荧光底物邻苯二胺(OPD)氧化形成具有黄色荧光的 DAP；DAP在572nm处有荧光发射，其紫外吸收光谱与铜氮共掺杂碳点(Cu-CDs)的荧光发射光谱有很大的重叠，产生荧光内滤效应使Cu-CDs荧光淬灭。而且DAP的荧光强度随生物分子量增大而增强，Cu-CDs荧光随DAP荧光增强而减弱，其两者荧光比值 I572/I460与待测物的浓度呈线性关系，可用于定量待测生物分子浓度。
与传统的氧化酶比色法相比较，本发明采用荧光信号定量的方式，灵敏度高于紫外吸吸收；因为具有黄色荧光的氧化物DAP 的紫外吸收光谱与铜氮共掺杂碳点的荧光发射光谱具有很大程度重叠，将两者混合可使铜氮共掺杂碳点发生内滤效应而使荧光淬灭，与DAP形成比率荧光定量生物分子；重要的是，DAP的荧光发射波长虽不随激发光波长改变，但其荧光强度在380nm波长激发时显著强于350nm激发，因Cu-CDs的发射波长不随激发光波长而改变，其在460nm处的发射光谱与DAP在572nm处的发射光谱依然保持大于100nm的距离，可达到良好的区分效果。DAP的荧光强度随生物分子浓度增大而增强，而Cu-CDs随之减弱，用两者的荧光比值I572/I460定量生物分子，具有放大信号的效果，可提升测定的灵敏度。且此方法基于氧化酶反应，具有良好的选择性。
有益效果
本发明采用新型铜氮共掺杂碳点荧光纳米材料和传统酶催化测定生物分子相结合的方法，通过将Cu-CDs的荧光与H2O2酶催化显色底物OPD的氧化产物DAP的荧光相互作用形成比率荧光，基于Cu-CDs荧光的稳定性和比率荧光对目标信号的放大作用，高灵敏的测定血清中可代谢产生H2O2的生物分子。
该测试平台可广泛应用于血清中可代谢产生H2O2的生物分子的测定，比直接酶测定反应更加灵敏，稳定、高效。且Cu-CDs固有的低毒，良好的水溶性和较高的单粒子亮度特性使整个检测过程环保、安全、方便。
附图说明
图1是实施例1制备得到的Cu-CDs的透射电子显微镜图；如图所示，Cu-CDs粒径约在2～3nm，均匀分散。
图2是实施例1制备得到的Cu-CDs的光电子能谱图；如图所示制备的Cu-CDs主要由C、N、O、Cu元素组成。
图3是实施例1制备得到的Cu-CDs的紫外吸收和荧光发射图；如图所示，Cu-CDs在360nm处有特征紫外吸收峰，以此波长的激发光激发后，发射波长在460nm左右。
图4是实施例1制备得到的Cu-CDs在不同波长激发光作用下的荧光发射图；如图所示，在激发光从300至390nm范围内，其发射波长均在460nm处，展示其激发光不依赖的荧光特性。
图5是实施例3制备得到的加入不同浓度胆固醇时Cu-CDs与 DAP的荧光光谱图；可以看出，随着体系内胆固醇浓度的增大(0-1.0 mM)DAP的荧光强度增强，同时Cu-CDs的荧光随之减弱。
图6是实施例3制备得到的胆固醇浓度与DAP与Cu-CDs的荧光强度比(I572/I460)的线性相关图；由图可知，胆固醇浓度在0 至1.0mM范围内与I572/I460呈正相关，且如内插图所示在0.05-100 μM范围内胆固醇的浓度与I572/I460呈线性，线性回归方程为y＝ 0.01309x+0.1155，相关系数r＝0.9992。由此可以说明，该方法可以很好的检测胆固醇的浓度。
图7是实施例3制备得到的加入不同浓度黄嘌呤时Cu-CDs与DAP的荧光光谱图；可以看出，随着体系内黄嘌呤浓度的增大(0-1.0 mM)DAP的荧光强度增强，同时Cu-CDs的荧光随之减弱。
图8是实施例3制备得到的黄嘌呤浓度与DAP与Cu-CDs的荧光强度比(I572/I460)的线性相关图；由图可知，黄嘌呤浓度在0 至1.0mM范围内与I572/I460呈正相关，且如内插图所示在0.25–75.00 μM范围内胆固醇的浓度与I572/I460呈线性，线性回归方程为y＝ 0.0063x+0.1033，相关系数r＝0.9998。由此可以说明，该方法可以很好的检测黄嘌呤的浓度。
具体实施方式
以下将结合具体实施例说明本发明的技术方案：
以下实施例所采用试剂的说明：辣根过氧化物酶(HRP，≥300U/mg)、黄嘌呤(98％)和邻苯二胺(OPD)从上海麦克林试剂有限公司购得；H2O2 (30％)，一水合柠檬酸、二乙烯三胺、乙酸铜一水合物(国药集团化学试剂有限公司)；胆固醇(99％)和胆固醇磷酸酯酶酶(>15U/mg) 从阿拉丁工业有限公司购得；胆固醇氧化酶(>20U/mg)从TOYOBO生物科技有限公司购得；黄嘌呤氧化酶(>10U/mg)从上海源叶有限公司购得。本文中所用碳点采用水热法制备。
实施例1 制备铜氮共掺杂碳点(Cu-CDs)
取1.2g一水合柠檬酸与0.15g乙酸铜一水合物溶解于20mL 去离子水中，超声15min使其充分溶解；将0.15mL二乙烯三胺加入到上步混合溶液中，超声15min使其充分混合；将上述溶液转移至30mL高压反应釜内，230℃反应12h；反应完成后，将其冷却至室温，取出产物加0.1M NaOH调节pH至7.0左右，1000Da 透析袋透析72h，透析液更换间隔约3～6h；透析完成后，将产物减压蒸馏浓缩得到深褐色溶液，60℃真空干燥得到褐色粉末，封闭保存备用。其TEM、XPS图如图1、2所示，其荧光与紫外吸收图如图3，其激发光不依赖发射荧光特性如图4所示。
上述的反应条件在200-250℃反应12-20h也能实施。
实施例2 以胆固醇为例，说明本发明的检测方法
一、催化胆固醇反应生成H2O2，并进一步催化H2O2与OPD 反应生成有黄色荧光DAP，步骤如下：取1mL不同浓度的胆固醇 (0、0.05、0.1、0.25、1.0、2.5、10、30、75、100、150、250、400、600、800、1000μM)，加入10μL胆固醇氧化酶(浓度为5.0 mg/mL)，充分震荡混合；取出200μL混合溶液至2mL EP管内，加入14mM OPD(含10μg/mL HRP)200μL，充分混合，37℃反应30min。溶液pH均为6.6，用20mM磷酸盐缓冲体系配置。
二、加入Cu-CDs与DAP形成比率荧光，定量测定血清中生物分子胆固醇的量：Cu-CDs浓度为200μg/mL，用20mM、pH＝6.6 磷酸盐缓冲体系配置，在所得DAP混合溶液中加入20μL Cu-CDs，37℃孵育1min，测定溶液荧光。荧光测定激发波长为380nm，DAP 发射波长572nm，Cu-CDs发射波长460nm，以I572/I460与胆固醇的浓度相关关系定量其浓度。结果见图5、6所示。
实施例3 以黄嘌呤为例，说明本发明的检测方法：
一、催化黄嘌呤反应生成H2O2，并进一步催化H2O2与OPD 反应生成有黄色荧光DAP，步骤如下：取不同浓度黄嘌呤(0、0.25、 0.75、1.5、5、15、30、75、150、250、400、600、800、1000μM) 1mL，加入10μL胆黄嘌呤氧化酶(浓度均为5.0mg/mL)，充分震荡混合；取出200μL混合溶液至2mL EP管内，加入14mM OPD (含10μg/mL HRP)200μL，充分混合，37℃反应30min。溶液 pH均为6.6，用20mM磷酸盐缓冲体系配置。
二、加入Cu-CDs与DAP形成比率荧光，定量测定血清中生物分子黄嘌呤的，剩余步骤同实施例2，结果见图7、8所示。

Claims (6)

1.借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，步骤如下：
（1）、制备铜氮共掺杂碳点Cu-CDs；
（2）、将可代谢产生H2O2的生物分子与对应的氧化酶反应生成H2O2，用辣根过氧化酶催化H2O2，与底物邻苯二胺反应生成有黄色荧光的氧化产物DAP;
（3）、在步骤（2）的反应体系中加入Cu-CDs，DAP的荧光随待测物浓度增大而增强，而Cu-CDs则反之，DAP与Cu-CDs形成比率荧光，两者荧光强度的比值I572/I460与待测物浓度呈线性关系，根据两者荧光强度的比值，定量测定血清中生物分子。
2.根据权利要求1所述的借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，其特征在于，可代谢产生H2O2的生物分子是胆固醇、黄嘌呤、葡萄糖、乳酸、胆碱、丙酮酸或者谷氨酸。
3.根据权利要求1所述的借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，其特征在于：步骤（1）中，Cu-CDs是以一水合柠檬酸、二乙烯三胺、乙酸铜一水合物为原料,三者的摩尔比为6:2:1，以去离子水为溶剂，在200-250℃反应12-20 h后获得。
4.根据权利要求1所述的借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，其特征在于：步骤（2）中，生物分子与相应氧化酶混合后，按照混合后总体积1.0mL加入10 μL浓度为1-5 mg/mL氧化酶的比例加入辣根过氧化酶。
5.根据权利要求1所述的借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，其特征在于：步骤（2）中反应体系是在25-37 ℃反应20-45 min。
6.根据权利要求1所述的借助比率荧光探针定量检测血清中可代谢产生H2O2的生物分子的方法，其特征在于：步骤（3）中，Cu-CDs以磷酸盐缓冲液溶液的形式加入，加入量为20 μL，浓度为20-200 μg/mL，加入Cu-CDs后在25-37℃反应1 min。
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