CN110132913B - 利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法 - Google Patents

利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，该方法利用铜离子对过氧化氢的催化作用，在待测溶液、邻苯二胺、过氧化氢的混合反应体系中，加入非离子表面活性剂作为胶束剂，并借助荧光分光光度计，实现对待测溶液中铜离子的检测；本发明利用非离子表面活性剂可以明显增强铜离子催化过氧化氢氧化邻苯二胺的反应，使反应产物的荧光信号灵敏度大幅度提升，另外，本发明操作简单、检测灵敏度高且选择性良好，具有简便快速、成本低廉、灵敏稳定等优点，因此，本发明提出的铜离子检测法有望在环境、食品等实际样品的检测中得到进一步应用。

Description

利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法。
背景技术
在低浓度下快速准确地检测金属离子是一个关键问题。铜离子(Cu2+)是人体必需的微量元素，在各种生理过程中具有重要作用。人体缺乏Cu2+可能影响酶活性和细胞代谢，而高水平的Cu2+又会导致严重的胃肠道紊乱，肾脏损害的肝脏，引起各种神经疾病。各国对饮用水中Cu2+的浓度含量都有明确的限定值。尽管目前对Cu2+的检测方法有很多，但仍然迫切需要具有简便快速、高灵敏特异性强的Cu2+定量的方法，以便对环境和人类健康风险进行有效评估。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法简单、耗时短、选择性强、灵敏度高的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法。
发明的目的通过如下技术方案实现：一种利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，利用铜离子对过氧化氢的催化作用，在待测溶液、邻苯二胺、过氧化氢的混合反应体系中，加入非离子表面活性剂作为胶束剂，并借助荧光分光光度计，实现对待测溶液中铜离子的检测。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
(1)非离子表面活性剂的存在可以明显增强铜离子催化过氧化氢氧化邻苯二胺的反应，相比没有非离子表面活性剂的情况，反应速度大为提高(仅需几分钟)，且反应产物的荧光信号灵敏度可以提升4倍多；
(2)该胶束-缓冲盐体系不仅可以加速铜离子催化过氧化氢氧化邻苯二胺的反应速率，同时由于胶束体系提供了反应产物的荧光增敏微环境，使检测灵敏度大为增强。更重要的是，由于其他金属离子在该微环境中的催化能力没有得到增强，使得该检测方法具有很强的抗干扰能力。
(3)本发明不仅可以利用反应产物的荧光信号对铜离子含量进行测定，更可以进一步利用水溶性荧光硅点和邻苯二胺的氧化产物之间的荧光共振能量转移(FRET)作用，采用荧光FRET方法进行更灵敏检测，并进一步优化铜离子响应荧光信号输出的抗干扰性。
(4)本发明操作简单、检测灵敏度高且选择性良好。具有简便快速、成本低廉、灵敏稳定等优点，因此，本发明提出的铜离子检测法有望在环境、食品等实际样品的检测中得到进一步应用。
附图说明
图1是本发明铜离子荧光检测方法以及铜离子比率型荧光检测方法的检测原理示意图。
图2是溶液含有与不含非离子表面活性剂的溶液荧光光谱强度对比。其中信号强的曲线为加入5％Triton X-100的反应后溶液荧光光谱图
图3是含有与不含非离子表面活性剂的溶液对不同金属离子响应的荧光信号强度对比图。
图4是本发明中对于不同金属离子的选择性测试荧光光谱图。
图5是本发明实施例一中溶液荧光光谱随铜离子浓度变化图。
图6是与图5对应的标准曲线图。
图7是本发明实施例二中水溶性硅点的TEM表征图。
图8是本发明实施例二中溶液荧光光谱随铜离子浓度变化图。
图9是与图8对应的Cu2+-荧光比值I550/I450的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
本发明所述的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，它利用铜离子对过氧化氢的催化作用，在待测溶液、邻苯二胺、过氧化氢的混合反应体系中，加入非离子表面活性剂作为胶束剂，并借助荧光分光光度计，实现对待测溶液中铜离子的检测。
所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100(Triton X-100)、吐温-20、吐温-80中的一种或两种以上的混合物。
本发明的发明人在科研实践中发现，加入少量非离子表面活性剂后能明显促进铜离子催化过氧化氢氧化邻苯二胺的反应，并且，由于邻苯二胺的氧化产物2,3二氨基吩嗪在550nm附近的荧光信号也会在非离子表面活性剂形成的胶束系统中得到明显敏化增强，因此可依据该荧光信号的强弱对铜离子含量进行间接检测。进一步的，当反应体系中有水溶性荧光硅点共存时，该硅点会和反应产物产生FRET现象，该FRET导致的荧光信号强度变化和铜离子的浓度之间存在正相关。基于以上几点发现，本发明的发明人构建了两种快速简便、灵敏度高、抗干扰性强的铜离子检测方法，这两种方法分别为：
方法一：利用表面活性剂敏化反应，构建基于反应产物荧光信号响应的铜离子荧光检测方法：
待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺以及过氧化氢混合反应后，通过测定最终反应溶液在550nm的荧光信号强度，构建铜离子荧光检测方法，从而实现对待测溶液中铜离子的检测。
方法一中的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，它包括以下步骤：
(1)标准曲线的建立：将一系列不同浓度的标准铜离子溶液分别与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺以及过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min；之后，用荧光分光光度计在室温下分别测定上述各溶液在550nm处的荧光强度，据此建立铜离子浓度-荧光强度值标准曲线，进一步获得荧光强度值与铜离子浓度的线性回归方程；
(2)待测液检测：将待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺以及过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min；之后，用荧光分光光度计在室温下测定反应溶液在550nm处的荧光强度值，将该荧光强度值带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液中铜离子的浓度。
其中，所述非离子表面活性剂的浓度为0.1％-2％；所述邻苯二胺的浓度为1-20mM；所述过氧化氢的浓度为1-20mM；所述磷酸盐缓冲液pH值为4.0-7.0。
所述荧光分光光度计的激发波长设置为450nm，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为5nm。
方法二：利用表面活性剂敏化反应，构建基于水溶性荧光硅点与邻苯二胺氧化产物之间的FRET效应的铜离子比率型荧光检测方法：
将待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺、过氧化氢混合反应后，向所得混合溶液中加入水溶性荧光硅点，得终混合溶液，通过测定终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度值，获得这两个波长下荧光强度的比值，构建铜离子比率型荧光检测方法，从而实现对待测溶液中铜离子的检测。
方法二中利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的比率型荧光检测方法，它包括以下步骤：
a.标准曲线的建立：
将一系列不同浓度的标准铜离子溶液分别与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺以及过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min，得到反应后的各混合溶液；
在各混合溶液中分别加入水溶性荧光硅点，充分振荡混合，再静置2-5min，得各终混合溶液；之后用荧光分光光度计在室温下测定各终混合溶液的荧光光谱，并分别记录各终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度值，获得这两个波长下荧光强度的比值，据此绘制出铜离子浓度-荧光强度比值标准曲线，进一步获得荧光强度比值与铜离子浓度的线性回归方程；
b.待测液的测定：
将待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺、过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min，得到反应后的混合溶液；在混合溶液中加入水溶性荧光硅点，充分振荡混合，再静置2-5min后，得终混合溶液；之后用荧光分光光度计在室温下测定终混合溶液的荧光光谱，并记录终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，将该荧光强度的比值代入步骤a所得的线性回归方程中，从而计算得待测液中铜离子的浓度。
其中，所述非离子表面活性剂的浓度为0.1％-2％；所述邻苯二胺的浓度为1-20mM；所述过氧化氢的浓度为1-20mM；所述磷酸盐缓冲液pH值为4.0-7.0；所述水溶性荧光硅点的用量为0.02-0.1mg/mL。
所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为5nm。
所述水溶性荧光硅点可以采用业界已知的各种合适方法制备。例如，在一较为典型的实施案例中，所述水溶性荧光硅点的制备方法可以包括：适量三钠柠檬酸盐和氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)溶于去离子水中，均匀搅拌数分钟。随后将该溶液转入聚四氟乙烯管中装入不锈钢高压釜，于150℃下反应60-120min。待高压釜冷却后，聚四氟乙烯管中得到无色透明溶液，将该溶液转移至透析袋(1kDa)中，用超纯水透析以除去多余的杂质，最后，将得到的水溶性荧光硅点溶液收集储存于4℃的储备溶液。
以上两种利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法原理图如图1所示。
以下结合具体实施例对本发明作更细致的阐述：
实施例一：采用方法一中的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，它包括以下步骤：
(1)配制一系列浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.04、0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、1mM的标准铜离子溶液，各取5uL加入到200uL含有0.5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH5.0)中，继续往各溶液中加入1mM邻苯二胺和1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置2min；
(2)用荧光分光光度计在室温下分别检测上述不同铜离子浓度的反应后溶液在550nm处的荧光强度(溶液荧光光谱随铜离子浓度变化情况如图5所示)，由此方法获得铜离子浓度-荧光强度标准曲线(如图6所示)，进一步获得荧光强度值与铜离子浓度的线性回归方程y＝19.273x+3.8454，R2＝0.996，其中，y为荧光强度，x为反应溶液中铜离子的浓度。该检测方法检测灵敏度可达10.0nM，检测线性范围为10-100nM。
(3)待测液的测定：将待测溶液按类似上述步骤(1)的方法处理。取100uL待测液加入到100uL含有1％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，继续往该溶液中加入1mM邻苯二胺和1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置2min；之后，得到的溶液再经荧光分光光度计在室温下检测其550nm处的荧光强度为140，将该荧光强度代入步骤(2)所建立的线性回归方程中，经计算得反应溶液中铜离子浓度为7.06μM，因在检测过程中待测液是按2倍稀释，所以待测液中铜离子实际浓度为14.13μM。
具体计算方法为：140＝19.273x+3.8454，解得x＝7.06μM，待测液中铜离子浓度为14.13μM
(4)江水中铜离子的检测：将某江的江水用0.22μm微孔过滤膜过滤，再按上述步骤(3)的方法处理，最后结果经由步骤(2)所得到的线性回归方程计算，得到该江水中铜离子的浓度为0.13mM，说明该江水受到了铜离子污染。
实施例二：采用方法二中的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的比率型荧光检测方法，它包括以下步骤：
(1)水溶性荧光硅点的合成：1.104g三钠柠檬酸盐和5mL APTMS溶于10mL高纯水中(去离子水去氧)，在磁力搅拌器中均匀搅拌10min。随后将该溶液转入聚四氟乙烯管中，并将该容器装入不锈钢高压釜中，于150℃下反应90min。待高压釜冷却后，聚四氟乙烯管中得到无色透明溶液，将该溶液转移至透析袋(1kDa)中，用超纯水透析48小时以除去多余的杂质，最后，将得到的SiQDs溶液收集储存于4℃的储备溶液，该水溶性硅点的TEM表征图如图7所示。
(2)配制一系列浓度分别为0.04、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0mM的标准铜离子溶液，各取2uL加入到196uL含有0.5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，继续往各溶液中加入5mM邻苯二胺和5mM过氧化氢并充分振荡混合，静置2min。
(3)在上述步骤(2)不同铜离子浓度的反应后溶液中加入2uL步骤(1)所得的水溶性荧光硅点，充分振荡混合静置5min。
(4)用荧光分光光度计在室温下分别检测上述步骤(3)所得溶液的荧光光谱，记录450nm和550nm处的荧光强度值(溶液荧光光谱随铜离子浓度变化情况如图8所示)，并计算荧光强度比值I550/I450，据此建立铜离子浓度-荧光比值I550/I450标准曲线(如图9所示)，进一步获得荧光比值I550/I450与铜离子浓度的线性回归方程y＝0.0487x+0.1204，R2＝0.9947，其中，y为荧光比值I550/I450，x为反应溶液中铜离子的浓度。
(5)待测液的测定：将含有未知浓度铜离子的待测溶液，取100uL待测液加入到100uL含有1％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 5.0)中，继续往该溶液中加入5mM邻苯二胺和5mM过氧化氢并充分振荡混合，静置2min。后继续往溶液中加入2uL步骤(1)所得的水溶性荧光硅点，充分振荡混合继续静置5min。得到的最终溶液再经荧光分光光度计在室温下检测其450nm和550nm处的荧光强度，并计算荧光强度比值I550/I450＝1.2。将该荧光强度比值I550/I450代入步骤(4)所建立的线性回归方程y＝0.0487x+0.1204中，经计算得反应溶液中铜离子浓度为22.17μM，因在检测过程中待测液是按2倍稀释，所以待测液中铜离子实际浓度为44.34μM。
具体计算方法为：1.2＝0.0487x+0.1204，解得x＝22.17μM，待测液中铜离子浓度为44.34μM。
(6)江水中铜离子的检测：将某江水用0.22μm微孔过滤膜过滤，再按上述步骤(5)的方法处理，最后结果经由步骤(4)所得的线性回归方程计算，得到该江水中铜离子浓度为0.27mM，说明该江水受到了污染。
实施例三：为了探究本发明检测方法中非离子表面活性剂所起的作用，本发明的发明人利用方法一，对同一浓度的铜离子标准溶液进行了测定，测定方法具体为：
①取2uL浓度为0.7mM的铜离子标准溶液加入到196uL含有5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，继续往该溶液中加入1uL 1mM邻苯二胺和1uL 1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置5min；之后，再经荧光分光光度计在室温下检测溶液反应产物在550nm处的荧光信号强度。
②取2uL浓度为0.7mM的铜离子标准溶液加入到196uL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH5.0)中，继续往该溶液中加入1uL 1mM邻苯二胺和1uL 1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置至少10min；之后，再经荧光分光光度计在室温下检测溶液反应产物在550nm处的荧光信号强度。
测试结果如图2所示，图2为溶液含有与不含非离子表面活性剂的溶液荧光光谱强度对比图，其中信号强的曲线为加入5％Triton X-100的反应后溶液荧光光谱图，即步骤①的荧光光谱图。由图2显示的结果可知，非离子表面活性剂的存在可以明显增强铜离子催化过氧化氢氧化邻苯二胺的反应，相比没有非离子表面活性剂的情况，反应速度大为提高(不加非离子表面活性剂反应至少需10min，而加入非离子表面活性剂Triton X-100后反应仅需5min就能完成)，且反应产物的荧光信号灵敏度可以提升4倍多。
实施例四：选择性测试试验：
为了探究本发明的检测方法对不同金属离子荧光响应的情况，本发明的发明人利用方法一的荧光检测方法，对不同金属离子溶液进行了测定，测定方法具体为：
①取0.7mM的Cu2+标准溶液、3.5mM的Pb2+标准溶液、3.5mM的Fe3+标准溶液、3.5mM的Hg2+标准溶液、7mM的Zn2+标准溶液、7mM的Cr3+标准溶液、3.5mM的Ag+标准溶液以及7mM的Mn2+标准溶液各2uL，分别加入到200uL含有5％Triton X-100的磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，继续往各溶液中加入1mM邻苯二胺和1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置2min；之后，再经荧光分光光度计在室温下分别检测以上各溶液在550nm处的荧光信号强度。
②取0.7mM的Cu2+标准溶液、3.5mM的Pb2+标准溶液、3.5mM的Fe3+标准溶液、3.5mM的Hg2+标准溶液、7mM的Zn2+标准溶液、7mM的Cr3+标准溶液、3.5mM的Ag+标准溶液以及7mM的Mn2+标准溶液各2uL，分别加入到200uL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 5.0)中，继续往各溶液中加入1mM邻苯二胺和1mM过氧化氢并充分振荡混合，静置10min；之后，再经荧光分光光度计在室温下分别检测以上各溶液在550nm处的荧光信号强度。
测试结果如图3、图4所示，图3为含有与不含非离子表面活性剂的溶液对不同金属离子响应的荧光信号强度对比图。图4为实施例四步骤①中对于不同金属离子的选择性测试荧光光谱图。从测试的结果可知，本发明的检测方法具有良好的选择性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，其特征在于：将待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺、过氧化氢混合反应后，向所得混合溶液中加入水溶性荧光硅点，得终混合溶液，通过测定终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，构建铜离子比率型荧光检测方法，从而实现对待测溶液中铜离子的检测。
2.根据权利要求1所述的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
a.标准曲线的建立：
将一系列不同浓度的标准铜离子溶液分别与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺以及过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min，得到反应后的各混合溶液；
在各混合溶液中分别加入水溶性荧光硅点，充分振荡混合，再静置2-5min，得各终混合溶液；之后用荧光分光光度计在室温下测定各终混合溶液的荧光光谱，并分别记录各终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，据此绘制出铜离子浓度-荧光强度比值标准曲线，进一步获得荧光强度比值与铜离子浓度的线性回归方程；
b.待测液的测定：
将待测溶液与含有非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲液、邻苯二胺、过氧化氢充分振荡混合后，再静置1-8min，得到反应后的混合溶液；在混合溶液中加入水溶性荧光硅点，充分振荡混合，再静置2-5min后，得终混合溶液；之后用荧光分光光度计在室温下测定终混合溶液的荧光光谱，并记录终混合溶液在450nm与550nm两处的荧光强度，获得这两个波长下荧光强度的比值，将该荧光强度的比值代入步骤a所得的线性回归方程中，从而计算得待测液中铜离子的浓度。
3.根据权利要求2所述的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，其特征在于：所述非离子表面活性剂的浓度为0.1％-2％；所述邻苯二胺的浓度为1-20mM；所述过氧化氢的浓度为1-20mM；所述磷酸盐缓冲液pH值为4.0-7.0；所述水溶性荧光硅点的用量为0.02-0.1mg/mL。
4.根据权利要求2所述的利用表面活性剂敏化反应进行铜离子检测的检测方法，其特征在于：所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为5nm。
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