CN110927153A - 一种定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，（1）在无色的ABTS溶液中加入碘化钾以及稀释后的过氧乙酸，碘离子催化过氧乙酸氧化无色的ABTS生成绿色氧化物，随着碘离子浓度增加，绿色逐渐加深，与ABTS在730 nm处的可见光吸光度呈线性增加；（2）加入红色的罗丹明B溶液后，与绿色混合使颜色差别增大，便于区分，根据反应颜色制作碘标准溶液比色卡，或根据体系可见光吸光度值对碘化钾浓度绘制标准曲线；（3）将碘化钾溶液替换为尿液样品，按步骤（1）、（2）操作，将显色结果对比碘标准溶液比色卡，或者结合标准曲线法获得尿样碘离子浓度，进行定量或半定量检测。灵敏度高、选择性好、检测简便。

Description

一种定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法
技术领域
本发明属分析技术、比色传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于分光光度计及显色底物ABTS的比色传感方法用于定量及半定量检测尿液中的碘离子浓度。
背景技术
碘是人类生长和代谢所必需的微量物质之一，也是合成甲状腺激素的必需微量元素。机体长期缺碘会导致甲状腺机能减退和地方性甲状腺肿等疾病，产前和发育早期缺碘会导致自然流产、婴儿死亡率增加。在食盐中添加KI或KIO3是预防碘缺乏病最简单和最有效的方法。然而，摄入过量碘又可导致甲状腺功能减退症、自身免疫甲状腺病和乳头状甲状腺癌的发病率显著增加。所以检测人体碘营养水平十分重要。肾脏是碘的主要排泄器官，人体摄入的碘约90％由肾脏排出。尿碘，即尿液中的碘元素，其排出量基本可以反应出碘的摄入量，所以尿碘是评价人体碘营养状况的临床常用指标。了解尿碘的情况，可以及时正确调整饮食中的碘摄入量，进而降低由于碘缺乏或碘过量而引起的病症发生。因此，开发一种灵敏度高、选择性好、使用方便的尿碘离子检测方法具有十分重要的意义。
近年来，电感耦合等离子体质谱、离子色谱、电喷雾串联质谱、化学发光、逆流注射分光光度法、毛细管电泳等方法已被提出用于碘化物的检测。尽管这些方法比较灵敏，但是需要昂贵的仪器或复杂的样品制备过程，不能满足现场快速检测的需求。因此，需致力于设计适用于碘化物检测的环境友好型传感器。与上述技术不同的比色法为生物样品和环境样品中碘化物的简单、低成本和快速检测提供了一种有前途的方法。
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐溶液(ABTS)作为一种良好的显色底物，由于其出色的显色特性，在比色传感领域具有独特的优势。近年来，ABTS被广泛应用于抗氧化剂的活性检测。ABTS被氧化可生成绿色ABTS自由基，其在415nm、650nm、及730nm处均有吸收，但730nm处吸收更强，线性关系更好。因此，通过检测730nm吸光度，可以定量测定目标物质的浓度。罗丹明B染料是典型的有机发光材料，具有毒性小、水溶性好、光量子产率高等优点，是分析化学和生物医学等领域中常用的有机染料，广泛应用在生物大分子标记、重金属离子检测、荧光标记等方面。
据我们所知，目前还没有基于ABTS和罗丹明B的可见光分析法和比色法用于尿液中碘离子浓度的定量及半定量检测。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种定量及半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，基于比色底物ABTS的生物分析检测技术，将玫瑰红色的罗丹明B染料作为背景颜色，与氧化产生的不同程度的绿色的ABTS氧化产物混合，使体系颜色层次更丰富，区分更明显，该显色反应快速灵敏，操作简便，产生的可视化信号,可用于可视化检测。可以直接应用于尿液中碘离子含量的检测，具有选择性好的优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种定量及半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，步骤如下：
(1)、配制无色的ABTS溶液：ABTS溶液浓度为0.1-1mM。
(2)、配制罗丹明B溶液；罗丹明B溶液的浓度为1-20μM。
(3)、配制不同浓度碘化钾标准溶液。
(4)、合成一元过氧乙酸稀释液：(参考文献:X.B.Zhao,T.Zhang,Y.J.Zhou,D.H.Liu,Preparation of peracetic acid from hydrogen peroxide Part I:Kineticsfor peracetic acid synthesis and hydrolysis,Journal of Molecular Catalysis A:Chemical 271(2007)246–252)在过氧化氢溶液中缓慢滴加醋酸酐溶液，加完后持续搅拌反应4h，室温放置过夜后用过氧化氢溶液稀释，稀释后过氧乙酸浓度为50-200μM。
(5)、向步骤(1)所得的ABTS溶液中加入步骤(3)所得不同浓度碘化钾标准溶液，浓度在0-500μg/L(且大于0)范围内，分别为0、50、100、200、300、400、500μg/L。
(6)、向步骤(5)所得混合溶液中加入过氧乙酸稀释液，之后立即加入罗丹明B溶液。随着碘化钾浓度增加，体系颜色从粉色到紫色再到蓝色。根据体系颜色对应的碘化钾浓度制作标准比色卡，根据体系可见光吸光度值对碘化钾浓度绘制标准曲线。
(7)、尿样碘离子浓度的检测：
将碘化钾溶液替换为尿液样品(经稀释、过滤处理)，按照上述步骤处理，室温反应10min后，对照标准比色卡比色实现半定量检测尿样中碘离子浓度，根据标准曲线，可以定量检测尿样中碘离子的浓度。
本发明定量及半定量检测尿液中碘离子浓度的原理是：
ABTS作为一种显色底物，可被氧化物氧化生成绿色的ABTS自由基。碘离子对过氧乙酸氧化ABTS显色有显著的催化作用，由此建立了催化显色分光光度法测定尿碘的新方法。由于颜色单一的绿色ABTS氧化物不便于比色，于是加入红色的罗丹明B作为背景色，使得体系颜色层次丰富且区分明显。因此可以通过测定体系可见光吸光度对尿液中碘离子浓度进行定量检测，或者与标准比色卡对应的体系颜色对尿液中碘离子浓度进行半定量检测。
有益效果：本发明利用ABTS显色底物的显色特性，以ABTS被氧化后形成的自由基的绿色和罗丹明B的红色的混合色作为信号指示，构建了一种基于ABTS的比色生物传感检测方法，用于定量及半定量检测尿液中碘离子浓度。与传统的检测方法相比，不仅具有选择性好、检测简便、可视化的优点，而且扩展了ABTS在检测生物离子中的应用。
附图说明
图1是实施例1中制备的无色ABTS溶液的吸收图；如图所示，在235nm和345nm处有最大吸收，730nm处无明显吸收。
图2A是实施例2中时间对目标物响应曲线；如图所示，随着反应时间的增加，可见光吸光度先增加后维持不变。
图2B是实施例3中温度对目标物响应曲线；如图所示，随着反应温度的增加，可见光吸光度也随之增加。
图3A是实施例4中ABTS的浓度对目标物响应曲线；如图所示，随着ABTS浓度的增加，可见光吸光度先增加后维持不变。
图3B是实施例5中过氧乙酸的浓度对目标物响应曲线；如图所示，随着过氧乙酸浓度的增加，可见光吸光度也在增加。
图3C是实施例6中罗丹明B对目标物响应曲线；如图所示，随着罗丹明B浓度的增加，可见光吸光度维持不变。
图4A是实施例7中加入不同浓度碘化钾后溶液可见光吸光度的变化图；如图所示，随着碘化钾浓度的增加，可见光吸光度增加。
图4B是实施例7中碘化钾溶液浓度与可见光吸光度的线性相关图；由图可知，在10-500μg/L范围内，碘化钾溶液浓度与可见光吸光度比值呈线性相关，线性回归方程为F＝0.0003c+0.0144，相关系数R2＝0.9943。
图5A是实施例8中加入不同浓度碘化钾后溶液体系颜色图以及所制作的比色卡；由图可知，在0-500μg/L范围内，随着碘化钾浓度的增加，体系颜色由粉色到紫色再到蓝色；
碘化钾浓度为0时，体系显粉色；
碘化钾浓度为50μg/L时，体系显粉紫色；
碘化钾浓度为100μg/L时，体系显紫色；
碘化钾浓度为200μg/L时，体系显紫蓝色；
碘化钾浓度为300μg/L时，体系显蓝色；
碘化钾浓度为400μg/L时，体系显深蓝色；
碘化钾浓度为500μg/L时，体系显深蓝色。
图5B是实施例9中人体尿样中碘离子的检测颜色半定量比色图；由图可知：
1号样显紫蓝色，处于100-200μg/L碘化钾溶液体系的显色之间，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内(100-300μg/L)；
2号样显紫蓝色，处于100-200μg/L碘化钾溶液体系的显色之间，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
3号样显蓝色，接近300μg/L碘化钾溶液体系的颜色，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
4号样显紫色，接近100μg/L碘化钾溶液体系的颜色，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
5号样显蓝色，处于200-300μg/L碘化钾溶液体系的显色之间，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
6号样显紫蓝色，处于100-200μg/L碘化钾溶液体系的显色之间，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
7号样显蓝色，处于200-300μg/L碘化钾溶液体系的显色之间，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
8号样显紫蓝色，接近200μg/L碘化钾溶液体系的颜色，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
9号样显紫蓝色，接近200μg/L碘化钾溶液体系的颜色，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内；
10号样显紫蓝色，接近200μg/L碘化钾溶液体系的颜色，可判断该测样结果在人体尿碘含量正常值范围内。
具体实施方式
碘化钾、罗丹明B、乙酸酐、活性炭(阿拉丁试剂有限公司)；过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司)；ABTS(上海生工生物工程有限公司)。
实施例1ABTS溶液的制备，步骤如下：
称量ABTS粉末固体，加入纯化水，混匀使溶解充分，制得ABTS溶液，浓度为0.1-0.5mM。4℃避光储存备用。其吸收如图1所示。
实施例2考察时间对目标物响应的影响实验，步骤如下:
依次加入ABTS溶液、KI溶液、过氧乙酸稀释液、罗丹明B溶液，于室温孵育1、3、5、10、15、20、25、35min后，测定730nm处的可见光吸光度。考察反应的时间对目标物响应的影响，结果如图2A所示。
实施例3考察温度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
依次加入ABTS溶液、KI溶液、过氧乙酸稀释液、罗丹明B溶液，用恒温水浴控制反应温度，于4℃、15℃、25℃、37℃、60℃反应10min，测定730nm处的可见光吸光度。考察反应温度对目标物响应的影响，结果如图2B所示。
实施例4ABTS的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
其他反应条件不变，改变ABTS溶液的浓度(0.01-0.5μM)，室温反应10min，测定730nm处可见光吸光度。考察ABTS浓度对目标物响应的影响，结果如图3A所示。
实施例5过氧乙酸稀释液的体积对目标物响应的影响实验，步骤如下:
保持加入ABTS溶液、KI溶液、罗丹明B溶液和和其他反应条件不变、改变过氧乙酸稀释液(2-30μL)，室温反应10min，测定730nm处的可见光吸光度。考察过氧乙酸稀释液的体积对目标物响应的影响，结果如图3B所示。
实施例6罗丹明B的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
保持ABTS溶液、KI溶液、过氧乙酸稀释液和其他反应条件不变、改变罗丹明B溶液的浓度(1.25-18.75μM)，室温反应10min，测定730nm的可见光吸光度。考察罗丹明B溶液对目标物响应的影响，结果如图3C所示。
实施例7 730nm可见光吸光度与I-浓度的相关性实验，步骤如下:
依次加入ABTS溶液、KI溶液(0-500μg/L)、过氧乙酸稀释液、罗丹明B溶液，室温反应10min，测定730nm处的可见光吸光度，如图4A所示，可见光吸光度与浓度的相关性结果如图4B所示。
实施例8不同浓度碘化钾溶液体系的半定量显色实验，步骤如下：
保持加入ABTS溶液、过氧乙酸稀释液、罗丹明B溶液不变，，改变KI溶液的浓度(0-500μg/L)、室温反应10min，观察不同浓度碘化钾体系的颜色，并制作比色卡，结果如图5A所示。
实施例9人体尿样中碘离子的半定量比色检测，步骤如下：
将尿样用纯化水稀释后经装有活性炭并连接滤头的真空注射器静置后过滤，4℃储存备用；依次加入ABTS溶液、处理后的尿样(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10号样)、过氧乙酸稀释液、罗丹明B溶液，室温反应10min，观察10份不同人体尿样中碘离子的检测显色结果并对比标准比色卡，结果如图5B所示。
实施例10人体尿样中碘离子的定量检测，步骤如下：
实施例9中人体尿样经过处理并反应完后，测定730nm可见光吸光度，根据标准曲线计算得到尿样中碘离子的含量。实施例中10份尿液样本检测到的碘离子含量如表1所示，样本检测到的碘离子含量与比色结果和临床检测值基本一致。
表1
Figure BDA0002312493160000101

Claims (6)

1.一种定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、合成一元过氧乙酸稀释液：在质量分数为30%的过氧化氢溶液中缓慢滴加醋酸酐溶液，加完后持续搅拌反应，放置过夜后用过氧化氢溶液稀释至50-200 μM；
（2）、向无色ABTS溶液中依次加入不同浓度碘化钾标准溶液、过氧乙酸稀释液，碘离子催化过氧乙酸稀释液氧化ABTS，使得溶液颜色由无色变为绿色，根据不同碘化钾浓度对应的体系颜色制作标准比色卡，根据体系可见光吸光度值对碘化钾浓度绘制标准曲线；
（3）、将碘化钾浓度替换为经稀释、过滤处理的尿液样品，按照上述步骤处理，无色ABTS溶液中加入尿液后，再加入过氧乙酸稀释液，尿样中碘离子催化过氧乙酸稀释液氧化ABTS，使得溶液出现颜色变化；对照标准比色卡比色，实现半定量检测尿样中碘离子浓度，根据标准曲线，定量检测尿样中碘离子浓度。
2.根据权利要求1所述的定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于，在步骤（2）中，向无色ABTS溶液中依次加入不同浓度碘化钾标准溶液、过氧乙酸稀释液之后，再加入红色罗丹明B溶液作为背景色，使得体系颜色层次丰富且区分明显。
3.根据权利要求1所述的一种比色检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于ABTS溶液的浓度为0.1-0.5 mM。
4.根据权利要求1所述的定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于，过氧乙酸稀释液的浓度为50-200 μM。
5.根据权利要求2所述的定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于：罗丹明B溶液的浓度为1-20 μM。
6.根据权利要求1或2所述的定量或半定量检测尿液中碘离子浓度的方法，其特征在于：碘化钾标准溶液的浓度在0-500 μg/L且大于0。
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