CN111239125A - 一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法 - Google Patents

一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测方法，利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生产葡萄糖酸和过氧化氢，再用二硫化铂为催化剂催化生成的过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖的浓度，可解决现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、检测快速、操作方便、能够实现可视化快速检测葡萄糖的浓度，有极大的应用价值，市场前景广阔。

Description

一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法
技术领域
本发明属于葡萄糖检测技术领域，具体涉及一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测方法。
背景技术
葡萄糖是一种重要的生物医学和生化分析物质，在生理代谢中起着关键作用。血液或体液中的血糖水平与机体功能密切相关，因为血糖水平异常与某些疾病如糖尿病或低血糖有直接关系。因此，高性能的葡萄糖传感器在生物医学诊断中显示出良好的应用前景。到目前为止，已经开发了许多葡萄糖传感器，包括体内和体外生物测定。大多数葡萄糖生物传感器利用光谱信号读出，如荧光光谱、偏振谱和拉曼光谱，然而这些都需要实验室规模的操作、精密仪器和专业实验人员。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测方法，以解决现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、检测快速、操作方便、能够实现可视化快速检测葡萄糖的浓度，有极大的应用价值，市场前景广阔。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，首先利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生产葡萄糖酸和过氧化氢，再用二硫化铂为催化剂催化生成的过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖的浓度。
上述利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，主要包括如下步骤：
步骤1，首先对样品进行预处理，加磷酸二氢钠缓冲液稀释后，再加入葡萄糖氧化酶溶液混合、反应；
步骤2，加入的二硫化铂溶液，显色剂以及的磷酸二氢钠缓冲液进行显色反应；
步骤3，通过目视比色法或者紫外-可见分光光度计法检测。
优选的，所述步骤3中，目视比色法是指，将显色反应后的溶液颜色直接与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定葡萄糖的浓度。
其中，所述比色标准系列的制备方法如下：是将葡萄糖标准品加磷酸二氢钠缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化铂溶液(10μg/mL)、显色剂和磷酸二氢钠缓冲液进行显色反应即得比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
优选的，所述步骤3中，紫外-可见分光光度计法是指显色反应结束后，直接测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算葡萄糖的含量。
其中，所述标准曲线方程的建立是将葡萄糖标准品加磷酸二氢钠缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化铂溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后直接采用紫外-可见分光光度计测定在652nm波长处的吸光度，或在显色反应后先加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计在450nm波长处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
优选的，所述步骤1和步骤3中，稀释样品和葡萄糖标准品所用磷酸二氢钠缓冲液的pH值为3-9，浓度为0.1mM；更优选的，所述pH值为7.0。
优选的，所述步骤2中，显色反应中所用磷酸二氢钠缓冲液的pH值为2-7，浓度为25mM；更优选的，所述pH值为5.0。
优选的，所述步骤2中，所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺；更优选的，所述显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺。
优选的，所述步骤2中，显色反应的温度为20～70℃。
优选的，所述步骤1和步骤3中，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为1mg/mL。
优选的，所述步骤2中，二硫化铂溶液的浓度为1mg/mL。
有益效果
本发明提供的利用二硫化铂的葡萄糖的比色检测方法，与现有技术相比，至少包括以下有益效果：
(1)本发明通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再由二硫化铂催化显色剂与过氧化氢反应产生颜色变化，以指示葡萄糖的不同浓度；葡萄糖浓度不同，则溶液颜色及颜色深浅均不同；通过肉眼观察即可判断葡萄糖是否超标，而不必借助任何仪器，因此检测成本低，操作简便。
(2)本方法所使用的二硫化铂无需进行修饰即可用于过氧化氢的检测，并且二硫化铂性质稳定、保存方便、生物安全性高。
(3)本发明中使用紫外-可见光分光光度法检测葡萄糖的检测限可以达到0.20μM，线性范围为0.5μM到150μM(R2＝0.9982)。
(4)本发明的反应条件温和，检测速度快，重现性好，且无需昂贵的检测仪器，操作简便，可实现葡萄糖的可视化快速识别和检测。
附图说明
图1为本发明实施案例1中温度与二硫化铂的催化性能的关系；
图2为本发明实施案例2中加入硫酸前后的溶液颜色变化；
图3为本发明实施案例2中加入硫酸后的标准比色系列；
图4为本发明实施案例2中以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
标准葡萄糖溶液的检测：将葡萄糖氧化酶溶液、0.5～150μM的葡萄糖溶液和磷酸二氢钠缓冲液(0.1mM,pH 3-9)混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL)、显色剂和磷酸二氢钠缓冲溶液(25mM,pH 2-7)，混匀，20～70℃下放置40min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
测试样品的预处理：
(1)果汁预处理
取葡萄汁、苹果汁、桃汁5mL，先经12000rpm离心30min，取上清液，稀释50倍后作为测试样品。
(2)血清预处理
取50μL血清样本用50μL水稀释，然后加入500μL Ba(OH)2(0.11mol/L)和500μLZnSO4(0.0765mol/L)。在4000rpm离心10min,取200μL上层清液，作为测试样品，其他操作同标准葡萄糖溶液的测定。
葡萄糖检测
将50μL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)、200μL PBS缓冲液(0.1mM，pH7.0)和测试样品分别混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),35μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(20mM)和2630μL磷酸二氢钠缓冲液(25mM,pH 5.0)混合，混匀，在40℃下放置40min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
所用显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
实施例1
不同温度下的催化性能：将50μL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)、200μL磷酸二氢钠缓冲液(0.1mM，pH 7.0)和150μM的葡萄糖溶液混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),35μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(20mM)和2630μL磷酸二氢钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)混合，混匀，立即放入不同温度的水浴锅中，温度依次为20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃,反应40min后都可产生明显颜色变化，利用紫外-分光光度法在652nm波长处测定吸光度进行分析，如图1所示，二硫化铂催化该反应的最佳温度为40℃，二硫化铂在温度范围为20-70℃时均具催化活性；说明本申请的方法在20-70℃范围内，催化性能稳定。
实施例2
标准葡萄糖溶液的检测：将50μL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)、200μL磷酸二氢钠缓冲液(0.1mM，pH 7.0)和不同的浓度依次为0μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM、150μM的标准葡萄糖溶液分别混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),35μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(20mM)和2630μL磷酸二氢钠缓冲溶液(25mM,pH5.0)混合，混匀，在40℃下放置40min后，即可产生明显颜色变化。如图2(左)所示，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，利用目视比色法(如图2(右))进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
结果显示，随着葡萄糖浓度的增加，二硫化铂催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行显色反应的产物在652nm左右的吸光度逐渐增大，相应溶液的颜色由黄色逐渐变为浅绿色，再由蓝绿色变至蓝色。加入硫酸终止反应后，随着葡萄糖浓度的增加，二硫化铂催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行显色反应的产物在450nm左右的吸光度逐渐增大，相应的溶液的颜色由浅黄色逐渐变为深黄色，如图3所示，绘制标准曲线，如图4所示，线性方程为Y＝0.1447+0.0042X(R2＝0.9982)。
实施例3
果汁样品的葡萄糖检测：分别取葡萄汁、苹果汁、桃汁5mL于离心管，经12000rpm离心30min，取上清液，稀释50倍后作为测试样品；将50μL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)、200μL磷酸二氢钠缓冲溶液(0.1mM，pH 7.0)和三种果汁样品分别混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),35μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(20mM)和2630μL磷酸二氢钠缓冲溶液(25mM,pH 5.0)混合，混匀，在40℃下放置40min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
表1果汁样品中葡萄糖的测定
Figure BDA0002402021260000051
Figure BDA0002402021260000061
结果显示，随着果汁样品中葡萄糖含量的升高，该葡萄糖检测方法在所有果汁样本中均表现出良好的响应，得到的最终结果的相对标准偏差在0.63-1.65％范围内。
实施例4
血清葡萄糖检测：取50μL血清样本用50μL水稀释，然后加入500μL Ba(OH)2(0.11mol L-1)和500μL ZnSO4(0.0765mol L-1)；在4000rpm离心10min,取200μL上层清液，作为测试样品。将50μL葡萄糖氧化酶溶液(1mg/mL)、200μL磷酸二氢钠缓冲液(0.1mM，pH 7.0)和测试样品分别混合，37℃下反应20min，然后加入35μL的二硫化铂溶液(1mg/mL),35μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(20mM)和2630μL磷酸二氢钠缓冲液(25mM,pH 5.0)混合，混匀，在40℃下放置40min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入500μL硫酸溶液(1mol/L)终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
表2血清样品中葡萄糖的测定
Figure BDA0002402021260000062
结果显示，该葡萄糖检测方法在所有血清样本中均表现出良好的响应，人血清中葡萄糖的结果与血糖仪测量的结果接近，相对标准偏差在0.63-1.93％范围内。
本发明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再以二硫化铂为催化剂催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖，随着葡萄糖浓度不同，溶液颜色及颜色深浅均不同，通过肉眼观察即可判断葡萄糖是否超标，而不必凭借任何仪器，因此检测成本低，操作简便。而分光光度法检测葡萄糖的检测限可以达到0.20μM，线性范围为0.5μM到150μM(R2＝0.9982)。本发明反应条件温和，检测速度快，重现性好，可实现水溶液和果汁、血清等实际样品中葡萄糖的可视化快速识别和检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，首先利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生产葡萄糖酸和过氧化氢，再用二硫化铂为催化剂催化生成的过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，主要包括如下步骤：
步骤1，首先对样品进行预处理，加磷酸二氢钠缓冲溶液稀释后，再加入葡萄糖氧化酶溶液混合、反应；
步骤2，加入的二硫化铂溶液，显色剂以及的磷酸二氢钠缓冲液进行显色反应；
步骤3，通过目视比色法或者紫外-可见分光光度计法检测。
3.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤3中，目视比色法是指，将显色反应后的溶液颜色直接与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定葡萄糖的浓度。
4.根据权利要求3所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述比色标准系列的制备方法如下：是将葡萄糖标准品加磷酸二氢钠缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化铂溶液、显色剂和缓冲液进行显色反应即得比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
5.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤3中，紫外-可见分光光度计法是指显色反应结束后，直接测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算葡萄糖的含量。
6. 根据权利要求5所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立是将葡萄糖标准品加磷酸二氢钠缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化铂溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后直接采用紫外-可见分光光度计测定在652 nm波长处的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计在450 nm波长处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
7. 根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤1和步骤3中，所用磷酸二氢钠缓冲溶液的pH值为3-9，浓度为0.1 mM。
8. 根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤2中，所用磷酸二氢钠缓冲溶液的pH值为2-7，浓度为25 mM。
9.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤2中，显色反应所用的显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺中的任意一种。
10.根据权利要求2所述的利用二硫化铂的葡萄糖比色检测法，其特征在于，所述步骤2中，显色反应的温度为20~70℃。
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