CN101071105A

CN101071105A - 同一比色池测定葡萄糖及1,5－脱水葡萄糖醇的方法

Info

Publication number: CN101071105A
Application number: CN 200710052479
Authority: CN
Inventors: 冯景
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-06-12
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2007-11-14

Abstract

本发明提出了同一比色池测定葡萄糖及1，5－脱水葡萄糖醇的方法，具体为：首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清，经由GK和葡萄糖－6－磷酸脱氢酶偶联系统将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6－磷酸葡萄糖酸内酯，以除去内源性葡萄糖的干扰，同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量；然后加浓度为200mmol/L的N－2－羟乙基哌嗪N′－2－乙烷磺酸溶液，把被测的1，5－脱水葡萄糖醇氧化成1，5－脱水果糖和H₂O₂，H₂O₂释放出新生态的氧将与HRP、4－AAP和HTIB反应系统作用发生Trinders显色反应后(无色到红色)进行比色测定1，5－脱水葡萄糖醇的含量。本发明在同一比色池对葡萄糖和1，5－脱水葡萄糖醇进行检测，具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点，降低了检测成本，为糖尿病的检测与治疗监控提供了新的方法。

Description

同一比色池测定葡萄糖及1，5-脱水葡萄糖醇的方法

技术领域

本发明属于生命科学一临床化学领域，涉及在同一比色池测定葡萄糖及1，5-脱水葡萄糖醇测定1，5-脱水葡萄糖醇。

背景技术

血清中糖醇类物质主要是葡萄糖(Glu)和1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)。1，5-AG是呋喃葡萄糖的C1-脱氧形式，主要来源于食物，它存在于人的脑脊液、血清中，在体内形成稳定的贮存池，血清中其含量在多元糖醇类物质中仅次于Glu。糖尿病时随着血糖浓度的升高，肾小管重吸收1，5-AG能力下降导致血清中1，5-AG含量明显下降。研究表明，血清1，5-AG检测作为筛选糖尿病的随机实验比其他评价实验更为灵敏。而1，5-AG的测定方法虽多，如色谱法、全自动连续注射系统-酶测定法和微柱酶法，但均需昂贵的专用仪器，操作繁琐，不适合于临床常规检验。1994年Fukumura建立了全酶法^[4]测定血清1，5-AG。全酶法是1，5-AG最简便的测定方法，但首先要去除血清内源性Glu的干扰。葡萄糖测定的常规方法是：Glu在葡萄糖氧化酶(GOD)作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢(H₂O₂)，后者与酚及4-AAP在过氧化物酶(POD)作用下生成红色醌类化合物，可在500nm处检测，其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。这两种物质在国外是检测糖尿病的常规指标，分开测定成本很高，如酶法测定1，5-AG须去除血清葡萄糖的干扰(而又没有测定葡萄糖着实存在浪费)。

发明内容

为了降低测定葡萄糖、1，5-脱水葡萄糖醇的成本，充分利用全酶法测定1，5-脱水葡萄糖醇的中间环节，本发明提出同一比色池测定葡萄糖及1，5-脱水葡萄糖醇的方法。

技术方案为：同一比色池测定葡萄糖及1，5-脱水葡萄糖醇的方法，步骤如下：首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清，经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联系统将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯，以除去内源性Glu的干扰，同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量；然后加浓度为200mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液，把被测的1，5-脱水葡萄糖醇氧化成1，5-脱水果糖和H₂O₂，H₂O₂释放出新生态的氧将与HRP、4-AAP和HTIB反应系统作用发生Trinders显色反应后进行比色测定1，5-脱水葡萄糖醇的含量。

有益效果：本方法将酶促反应的高特异性和的高灵敏性结合起来，建立了一种在同一比色池对葡萄糖和1，5-脱水葡萄糖醇检测的方法。该方法具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点，可自动化同时检测葡萄糖和1，5-脱水葡萄糖，降低了检测成本，为糖尿病的检测与治疗监控提供了新的方法。

具体实施方式

材料与方法

1.试剂

(1)试剂I(RI)三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲溶液(Tris/HCl)内含葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)，辣根过氧化物酶(HRP)。(2)试剂II(RII) N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液(HEPES)内含呋喃糖氧化酶(PROD)，抗坏血酸氧化酶(AO)，3-羟基-2、4、6-三碘苯甲酸(HTIB，)。(3)标准液50mmol/L的Glu标准液和1mmol/L的1，5-AG标准液。

2.仪器RA1000(Technicon，美国)，Hitachi 7080全自动生化分析仪(日立，日本)。

3.方法(1)方法原理首先用RI处理血清，经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)偶联系统将血清中Glu彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-PGA)，以除去内源性Glu的干扰并测定吸光变化以计算Glu含量。加入试剂RII后，1，5-AG被氧化成1，5-脱水果糖和H₂O₂，后者经HRP、4-AAP和HTIB反应系统作用发生Trinders显色反应后进行比色测定，反应式如下：

[O]+4-AAP+HTIB→4-AAP-HTIB(有色物)

(2)参数设置上机参数：Glu测定终点法参数，温度37℃，主波长340nm，副波长405nm，RI300μl温5min读吸光度A₁，加入样品10μl，反应10min，测定吸光度A₂。将主波长调至540nm，副波长700nm，加入RII 150μl，读取吸光度A₃，反应5min，读取吸光度A₄，空白调零。手工测试参数：除上述基本参数外，样品和试剂量按比例增减。

计算公式：Glu(mmol/L)＝(A₂-A₁)×标准品浓度/(A_标2-A_标1)。

1，5-AG(μmol/L)＝(A₄-A₃)×标准品浓度/(A_标4-A_标3)。

讨论：目前在国外尤其是日本，Glu与1，5-AG是诊断与监控糖尿病近期治疗的最重要的指标。国际上推荐的Glu参考方法是HK法，而1，5-AG的测定方法中以微柱酶法和Fukumura的全酶GK和PK-PEP系统最为简便和可靠。我们首次用GK和G-6PD偶联系统去除内源性Glu并同时测定Glu的浓度，然后在同一比色池中加入含PROD的试剂改变主副波长，引入Trinder反应系统以测定1，5-AG的浓度。本方法将酶促反应的高特异性和的高灵敏性结合起来，建立了一种新全酶法对Glu和1，5-AG同时检测的自动化分析方法。本研究结果表明，该方法具有灵敏、准确、稳定、特异性等特点。二种指标的线性范围足以满足临床对糖尿病的筛检及治疗监控要求。

我们对建立的方法进行了方法学评价。Glu在0.2～40mmol/L内线性良好，若高于该值建议稀释后重新测定；1，5-AG的测定范围为2.1～550μmol/L。本方法的精密度与准确度符合RCV的要求。二者批内CV％均在2％以内、批间均3％以内；本法的测定Glu和1，5-AG的平均回收率分别为100.2％和101.7％。由于人类血清/血浆中糖醇类物质主要是Glu和1，5-AG。其它如麦芽糖、乳糖含量极微。常规条件下的高血脂、轻微溶血和高胆红素对Glu和1，5-AG的测定影响甚微。用本法测定Glu和1，5-AG分别与HK法和Lana微柱法相关性甚好。

Claims

1、同一比色池测定葡萄糖及1，5-脱水葡萄糖醇的方法，步骤如下：首先用三羟甲基氨基甲烷和盐酸组成的缓冲溶液处理血清，经由GK和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联系统将血清中葡萄糖彻底转化为不与PROD反应的6-磷酸葡萄糖酸内酯，以除去内源性Glu的干扰，同时并测定吸光变化以测定葡萄糖含量；然后加浓度为200mmol/L的N-2-羟乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液，把被测的1，5-脱水葡萄糖醇氧化成1，5-脱水果糖和H₂O₂，H₂O₂释放出新生态的氧将与HRP、4-AAP和HTIB反应系统作用发生Trinders显色反应后进行比色测定1，5-脱水葡萄糖醇的含量。