CN102382875A

CN102382875A - 一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1,5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102382875A
Application number: CN2011103245238A
Authority: CN
Inventors: 商纯尔; 陈青松
Original assignee: ZHEJIANG KUAKE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG KUAKE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-10-22
Filing date: 2011-10-22
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2031-10-22
Also published as: CN102382875B

Abstract

本发明公开了一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法，包括：配制pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)、ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清样本，并于20-50℃反应3-5分钟。在ATP存在下，GK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同时生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD进一步把G6P转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL)；反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP。依据该法构建的葡萄糖清除试剂置2-8℃保存可稳定14个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪。

Description

一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1,5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法和试剂盒。

背景技术

1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)，又名2-脱氧葡萄糖、1，5-脱水山梨醇。临床资料表明，血清1，5-AG的监测可确切地反映较短期内糖尿病的控制程度，是糖尿病监护中的良好指标。

自1，5-脱水葡糖醇对糖尿病的诊断意义被临床所认识以来，已有阴离子交换层析法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱法(LC-MS)、吡喃糖氧化酶分析法等诸多方法应用于血清1，5-AG的测定。前三种方法需要对1，5-AG进行衍生和复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。吡喃糖氧化酶分析法虽好，但测定试剂的稳定性普遍较差，难以在临床推广应用。

申请者研究发现，要开发稳定的液体型血清1，5-AG吡喃糖氧化酶法测定试剂，应重点建立一种快速清除高浓度葡萄糖的方法，以消除葡萄糖对1，5-AG测定的干扰。Fukumura Y(Clin Chem，1994，40：2013-2016.)、陈国军(中华医学检验杂志，1999，22(6)：358-361.)、第一化学药品株式会社(中国专利申请号97126042.7)武汉埃克玛生物技术有限公司(中国专利申请号99116563.2)等在测定1，5-AG时，将葡萄糖通过酶法途径转化为6-磷酸葡萄糖，但生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足时可重新转化为葡萄糖，即使引入ATP再生系统也无法避免葡萄糖对1，5-AG测定的干扰。冯景(检验医学，2005，20(6)：551-514.)等将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的6-磷酸葡萄糖内酯，该酶法转化途径需要高浓度的三磷酸腺苷(ATP)以确保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖内酯转化，反应过程中生成的二磷酸腺苷(ADP)对该转化途径存在反馈抑制，不利于高浓度的葡萄糖清除，另外实验发现该测定试剂存储过程中ATP的逐步分解直接导致葡萄糖清除能力的降低，从而给制备液体型稳定试剂带来困难。协和梅迪克斯株式会社(中国专利申请号99124799.X)在将葡萄糖转化为果糖-1，6-二磷酸，同时使1，5-脱水葡糖醇转化为1，5-脱水葡糖醇-6磷酸，然后再用1，5-脱水葡糖醇-6磷酸脱氢酶系对1，5-脱水葡糖醇-6磷酸进行定量测定。由于吡喃糖氧化酶对1，5-脱水葡糖醇-6磷酸不产生任何氧化作用，因此该葡萄糖消除方法无法应用于1，5-脱水葡糖醇的吡喃糖氧化酶法测定。

本发明的目的是为了解决上述技术的不足，建立一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法。在测定血清1，5-AG前，将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的6-磷酸葡萄糖内酯，并使反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP，体系中仅需0.5mmol/LATP就可使60mmol/L的葡萄糖在180s内完全转化为6-磷酸葡萄糖内酯。依据该法构建的葡萄糖清除试剂置2-8℃保存可稳定14个月，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的快速清除高浓度葡萄糖的方法。

一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的快速清除高浓度葡萄糖的方法，包括：配制pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清样本，并于20-50℃反应3-5分钟。其中血清样本和葡萄糖清除试剂的体积比控制在1/10-1/200，可以获得很好的测试结果。在ATP存在下，GK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同时生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD进一步把G6P转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL)；反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP。上述反应后可加入含4- 氨基安替比林(4-AAP)、PROD、过氧化物酶(HRP)、3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)的显色剂进行显色。所述显色剂中各组分的最适含量为4-氨基安替比林(4-AAP)2mmol/L、PROD 50KU/L、过氧化物酶(HRP)6KU/L和3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)2.0mmol/L。

用于本发明吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的测定方法为两点终点法，使用的仪器为日立7080生化分析仪等类型全自动生化分析仪。

用于实现以上方法的葡萄糖清除试剂的主要物质为：2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和三磷酸腺苷(ATP)组合。

上面所述的各主要物质最适浓度为：pH6.0-9.0MES缓冲液为20-2000mmol/L、GK为1-50KU/L、G6PD为5-200KU/L、NADP为5-60mmol/L、PK为0.5-20KU/L、PEP为1-3mmol/L、ATP为0.2-2mmol/L、血清样本中的Glu为0-60mmol/L。

本发明所述的葡萄糖清除方法与Fukumura Y等(方法1)、冯景(方法2)等所描述的方法葡萄糖清除方法相比较结果见表1。

表1

	方法1	方法2	本法
				V_样本/V_试剂	1/41.25	1/60	1/22.5
灵敏度	中等	低	高
				试剂有效期(4℃)	7天	70天	420天
可清除葡萄糖浓度	44.4mmol/L	44.4mmol/L	60mmol/L

本发明还提供了一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除的试剂盒，该试剂盒含有pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，该缓冲液包含一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐 (PEP)和ATP。该试剂盒中各组分的最适浓度为pH6.0-9.0MES缓冲液为20-2000mmol/L、GK为1-50KU/L、G6PD为5-200KU/L、NADP为5-60mmol/L、PK为0.5-20KU/L、PEP为1-3mmol/L、ATP为0.2-2mmol/L、血清样本中的Glu为0-60mmol/L。

具体实施方式

本发明的原理：在ATP存在下，GK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同时生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP⁺存在下，G6PD进一步把G6P转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL)；反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP。

葡萄糖清除试剂组成：配制pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，该缓冲液包含一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和ATP。该葡萄糖清除试剂中各组分的最适浓度为pH6.0-9.0MES缓冲液为20-2000mmol/L、GK为1-50KU/L、G6PD为5-200KU/L、NADP为5-60mmol/L、PK为0.5-20KU/L、PEP为1-3mmol/L、ATP为0.2-2mmol/L。

实施例1

精密配制具有下述组成的葡萄糖清除试剂(下称“清除试剂1”)：pH6.50MES缓冲液为20mmol/L、GK为1KU/L、G6PD为5KU/L、NADP为5mmol/L、PK为0.5KU/L、PEP为1mmol/L、ATP为0.2mmol/L。进行葡萄糖清除试验以确定本法的有效性。在4个试管内分别加入(1)去离子水、(2)含有304μmol/L 1，5-AG的待检液、(3)含有60mmol/L葡萄糖的待检液、(4)含有304μmol/L 1，5-AG和60mmol/L葡萄糖的待检液各0.10毫升，再分别注入1.50ml上述葡萄糖清除试剂，在37℃加热5分钟后，各管分别加入含4-氨基安替比林(4-AAP)2mmol/L、PROD50KU/L、过氧化物酶(HRP)6KU/L、3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)2.0mmol/L的显色剂各0.75毫升，在37℃继续加热5分钟，测定510nm下的吸光度得到表2的结果。

表2

	检测液	吸光度值
			(1)	去离子水	0.032
(2)	304μmol/L1，5-AG	0.258
			(3)	60mmol/L葡萄糖	0.032
(4)	304μmol/L 1，5-AG+60mmol/L葡萄糖	0.259

从表2可以看出，(1)和(3)的吸光度完全相同，表明本法完全可以在5分钟内消除60mmol/L葡萄糖；(2)和(4)的吸光度几乎完全相同，可以说明本法的有效性。

实施例2

精密配制具有下述组成的葡萄糖清除试剂(下称“清除试剂2”)：pH6.50MES缓冲液为1000mmol/L、GK为25KU/L、G6PD为100KU/L、NADP为30mmol/L、PK为10KU/L、PEP为2mmol/L、ATP为lmmol/L。同实施例1一样进行葡萄糖清除试验以确定本法的有效性。在4个试管内分别加入(1)去离子水、(2)含有304μmol/L 1，5-AG的待检液、(3)含有60mmol/L葡萄糖的待检液、(4)含有304μmol/L 1，5-AG和60mmol/L葡萄糖的待检液各0.10毫升，再加入葡萄糖清除试剂1.50ml，于37℃条件下加热4分钟后，加入与实施例1一致的显色剂各0.75毫升，在37℃条件下继续加热5分钟，测定510nm下的吸光度得到表3的结果。

表3

	检测液	吸光度值
			(1)	去离子水	0.033
(2)	304μmol/L1，5-AG	0.259
			(3)	60mmol/L葡萄糖	0.033
(4)	304μmol/L 1，5-AG+60mmol/L葡萄糖	0.259

从表2可以看出，(1)和(3)的吸光度完全相同，表明本法完全可以在4分钟内消除60mmol/L葡萄糖；(2)和(4)的吸光度也完全相同，可以说明本法的有效性。

实施例3

精密配制具有下述组成的葡萄糖清除试剂(下称“清除试剂3”)：pH6.50MES缓冲液为2000mmol/L、GK为50KU/L、G6PD为200KU/L、NADP为60mmol/L、PK为20KU/L、PEP为3mmol/L、ATP为2mmol/L。同实施例1一样进行葡萄糖清除试验以确定本法的有效性。在4个试管内分别加入(1)去离子水、(2)含有304μmol/L 1，5-AG的待检液、(3)含有60mmol/L葡萄糖的待检液、(4)含有304μmol/L 1，5-AG和60mmol/L葡萄糖的待检液各0.10毫升，再加入葡萄糖清除试剂1.50ml，于37℃条件下加热3分钟后，加入与实施例1一致的显色剂各0.75毫升，在37℃条件下继续加热5分钟，测定510nm下的吸光度得到表4的结果。

表4

	检测液	吸光度值
			(1)	去离子水	0.037
(2)	304μmol/L1，5-AG	0.262
			(3)	60mmol/L葡萄糖	0.036
(4)	304μmol/L 1，5-AG+60mmol/L葡萄糖	0.263

从表2可以看出，(1)和(3)的吸光度几乎完全相同，表明本法完全可以在3分钟内消除60mmol/L葡萄糖；(2)和(4)的吸光度也几乎完全相同，可以说明本法的有效性。

实施例4：

将实施例1-3所述的葡萄糖清除试剂分别置2-8℃保存14个月以确定试剂的稳定性。将储存后的试剂分别按实施例1-3的方法进行葡萄糖消除试验，得到表5的结果。

表5

从表5可以看出，(1)和(3)、(2)和(4)的吸光度完全相同或几乎完全相同，表明本法所述的葡萄糖清除试剂置2-8℃保存14个月后仍具有有效性。

实施例5：

用实施例2的试剂，即“清除试剂2”，和Fukumura Y(Clin Chem，1994，40：2013-2016.)所报道的方法进行1，5-AG方法比对实验，以确定本法应用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-AG的有效性。(1)、实施例2的试剂测定方法：在日立7080生化分析仪上设置反应类型为两点终点法；标准品浓度为304.5μmol/L，反应温度为37℃；测试的主/副波长为510/700nm；样品体积为10μl；加入实施例2的“清除试剂2”150μl反应5min后读取第1点吸光度A₁，加入实施例2的显色剂75μl，继续反应5min后读取第2点吸光度A₂，与标准比较后定量。计算公式为：血清1，5-AG浓度(μmol/L)＝(A₂-A₁)_血清/(A₂-A₁)_标准×304.5。(2)、Fukumura Y所报道的方法：按文献报道的方法进行。用两种方法分别测定了60例血清标本，测定结果见表4所示，回归方程Y(_本法)＝1.013X_{(FukumuraY法)}+0.792，r＝0.9972，两者显示了很好的相关性。

表4

Fukumura Y法测定值(μmol/L)	本法测定值(μmol/L)
		152	156
235	236
		152	157
117	125
		168	174
101	101
		83	85
22	23

[0042]

197	201
		125	111
95	98
		36	36
82	87
		106	116
150	147
		362	363
22	25
		150	157
123	126
		154	154
138	136
		175	187
121	126
		87	88
77	76
		164	165
175	188
		256	257
35	38
		61	65
98	101
		142	145
182	185
		298	301
246	254

315 320

62	65
		11	12
71	74
		246	258
80	82
		87	91
135	136
		175	185
165	154
		172	174
146	158
		162	165
142	147
		25	21
248	258
		175	187
136	125
		135	135
154	145
		195	192
142	141
		120	124
118	121
		85	88

上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。

Claims

1.一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法，其特征在于：配制pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清样本，在ATP存在下，GK将Glu转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同时生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD进一步把G6P转化为6-磷酸葡萄糖内酯(G6PL)；反应中生成的ADP在PEP的存在下经PK作用重新转化为ATP。

2.根据权利要求1所述的一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法，其特征在于：用于实现上述方法的葡萄糖清除试剂的主要物质为2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和三磷酸腺苷(ATP)组合。

3.根据权利要求1所述的一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法，其特征在于：测试温度控制在20-50℃，时间控制在3-5分钟，血清样本和葡萄糖清除试剂的体积比控制在1/10-1/200。

4.根据权利要求2所述的一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除方法，其中葡萄糖清除试剂的主要物质的最适浓度为：pH6.0-9.0MES缓冲液为20-2000mmol/L、GK为1-50KU/L、G6PD为5-200KU/L、NADP为5-60mmol/L、PK为0.5-20KU/L、PEP为1-3mmol/L、ATP为0.2-2mmol/L、血清样本中的Glu为0-60mmol/L。

5.一种适用于吡喃糖氧化酶法测定血清1，5-脱水葡糖醇的高浓度葡萄糖清除的试剂盒，该试剂盒含有pH6.0-9.0的2-玛啡琳乙基磺酸(MES)缓冲液，该缓冲液包含一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)和ATP。

6.权利要求5所述的试剂盒，其中各组分的最适浓度为：pH6.0-9.0MES缓冲液为20-2000mmol/L、GK为1-50KU/L、G6PD为5-200KU/L、NADP为5-60mmol/L、PK为0.5-20KU/L、PEP为1-3mmol/L、ATP为0.2-2mmol/L、血清样本中的Glu为0-60mmol/L。