CN103837487A - 一种尿酸的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿酸的检测方法，采用酶学速率测定法，根据在波长546nm处，反应体系吸光度的升高速率与样本中尿酸的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒内的吸光度升高速率，得到尿酸的含量,测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，可以完全排除血清样品本底的干扰，提高了结果的准确度；延迟时间短，读数时间也很短，这样就使整个反应时间大大缩短，由原来的5～10分钟缩短为3分钟以内，提高了效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种尿酸的检测方法，具体地说，涉及一种酶学速率法测定人血清尿酸的检测方法及检测试剂盒，适用于体外定量测定人血清、血浆中的尿酸的浓度，属于医用诊断制剂技术领域。
背景技术
尿酸是嘌呤、核酸和核蛋白的代谢产物。生物细胞中的DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）由核苷酸组成。核酸氧化分解后的产物之一就是嘌呤，所以说嘌呤是细胞的组成成分。体内的老旧细胞，富含嘌呤的食物在体内新陈代谢过程中，其核酸氧化分解产物就有嘌呤。嘌呤会在肝脏中再次氧化为2，6，8--三氧嘌呤又称为尿酸。因此，体内尿酸浓度的异常可指示这些物质代谢的障碍。
体液中尿酸含量变化，可以充分反映出人体内代谢、免疫等机能的状况。正常情况下，体内的尿酸大约有1200毫克，每天新生成约600毫克，同时排泄掉600毫克，处于平衡的状态。血中尿酸全部从肾小球滤过，正常人体内尿酸的生成与排泄速度较恒定。如果体内产生过多来不及排泄或者尿酸排泄机制退化，则体内尿酸滞留过多，当血液尿酸浓度大于7毫克/升，导致人体体液变酸，影响人体细胞的正常功能，长期将会引发痛风。
尿酸增高见于痛风、急性或慢性肾小球肾炎、肾结核、肾盂积水、子痫、慢性白血病、红细胞增多症、摄入过多含核蛋白食物、尿毒症肾炎、肝脏疾患、氯仿和铅中毒、甲状腺功能减低、多发性骨髓瘤、白血病、妊娠反应红细胞增多症。尿酸减低：见于恶性贫血、Fanconi综合征、使用阿司匹林、先天性黄嘌吟氧化酶和嘌吟核苷磷酸化酶缺乏等。
尿酸的测定可作为肾功能、痛风疾病的指标，它在痛风的诊断和肾功能方面有着重要的意义。
测定尿酸主要有磷钨酸法、尿酸酶法（紫外分光法，氧电极法，偶联过氧化物酶比色法，固相酶法）、色谱分析法（高效液相色谱－电化学检测法，反相高效液相色谱法，气相色谱－质谱分析法）等。磷钨酸法特异性、灵敏度较低，目前基本不用。色谱分析法操作繁琐，价格高，对临床的意义不大。尿酸酶法中的紫外分光法特异性强，操作简便，但不易实现自动化分析；氧电极法需要专用的分析设备；固相酶法的酶不稳定，活力不易保存；偶联过氧化物酶比色法灵敏度高、快速、安全、易实现自动化，适应临床的需要, 目前国内使用的基本全部为此方法，但此方法为终点法测定，有一个缺点就是易受血清本底干扰，而且反应时间长，大大影响了结果的准确性和测定效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种尿酸的检测方法，用于体外定量测定人血清、血浆中的尿酸的浓度，克服了现有检测方法易受血清本底干扰、反应时间长的缺陷，本发明检测方法以酶催化法，使用酶学速率测定法，完全排除了血清本底的干扰，大大缩短了反应时间，操作简便，结果准确可靠，适用于各种生化分析仪器。
本发明的另一目的是提供一种实施该检测方法的检测试剂盒。
为解决以上问题，本发明采用的技术方案是：一种尿酸的检测方法，其特征在于：所述检测方法为采用酶学速率测定法，根据在波长546nm处，反应体系吸光度的升高速率与样本中尿酸的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒内的吸光度升高速率，得到尿酸的含量。
一种优化方案，所述吸光度上升速率测定步骤：
a、制备反应液
取空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温3～5分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；或
将缓冲液和酶试剂按比例混合配制成试剂工作液，稳定3～5分钟；然后取空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，得到反应液；
b、反应液在37℃条件下反应，延迟30～60秒后，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率。
进一步地，所述缓冲液与酶试剂的体积比为5:1～1:1；缓冲液、酶试剂之和与待测样本的体积比为100:1～20:1。
进一步地，所述缓冲液为含有3.5～8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）的0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述酶试剂为尿酸酶和过氧化酶溶液，尿酸酶浓度为0.2U/ml～5U/ml；过氧化酶浓度为1～10U/ml。
进一步地，所述标准液为尿酸溶液，浓度为100～400μmol/L。
基于所述检测方法的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括包装盒、缓冲液、酶试剂、标准液；
所述缓冲液为含有3.5～8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）的0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述酶试剂为尿酸酶和过氧化酶溶液，尿酸酶浓度为0.2U/ml～5U/ml；过氧化酶浓度为1～10U/ml。
进一步地，所述标准液为尿酸溶液，浓度为100～400μmol/L。
另一种优化方案，根据下列公式计算尿酸的含量：
尿酸含量(μmol/L)= 
×标准浓度
标准浓度为标准液的浓度值。
使用方法：根据仪器要求，在半自动生化分析仪上使用单试剂模式，也可以使用单试剂模式；在分光光度计上使用单试剂模式；在全自动生化分析仪上可以使用双试剂模式，也可以使用单试剂模式。
储存条件及有效期为：原装试剂2～8℃保存，有效期12个月；缓冲液、酶试剂配成试剂工作液后，室温可以稳定72小时，在2～8℃冷藏可稳定90天。
适用仪器为适用于各种半自动和全自动生化分析仪及分光光度计。
样本要求为：样本可以是新鲜不溶血血清或肝素抗凝血浆、尿液。血样中尿酸在2～8℃可稳定3天。
本发明采用以上技术方案，与现有技术方案相比，具有以下优点：
本发明使用酶学速率测定法，测定的是反应的速率，在反应过程中的线性期进行读数，完全不同于其他方法的终点测定法，可以完全排除血清样品本底的干扰，提高了结果的准确度；
本发明采用速率法后，延迟时间短，读数时间也很短，这样就使整个反应时间大大缩短，由原来的5～10分钟缩短为3分钟以内，提高了效率；
本发明因为无需考虑血清样品本底的去除，所以操作简便，仪器参数设置也很简单，无需复杂的计算公式；
本发明可以使用双试剂模式进行测定，也可以使用单试剂模式进行测定，因此可以适用于各种自动、半自动生化分析仪器，适用范围广。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1为本发明实施例中尿酸酶浓度一定、尿酸浓度不同时的反应吸光度曲线；
附图2为本发明实施例中尿酸浓度一定、尿酸酶浓度不同时的反应吸光度曲线。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1，一种检测试剂盒，包括包装盒、缓冲液、酶试剂、标准液；包装盒为试剂盒外包装；以下称缓冲液为试剂1，称酶试剂为试剂2。
缓冲液为含有3.5～8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）的0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
酶试剂为尿酸酶和过氧化酶溶液，尿酸酶浓度为0.2U/ml～5U/ml；过氧化酶浓度为1～10U/ml。
试剂1与试剂2的体积比为5:1～1:1。
标准液为尿酸溶液，浓度为100～400μmol/L，以国家标准品赋值校准。
储存条件及有效期为：原装试剂2～8℃保存，有效期12个月；缓冲液、酶试剂配成试剂工作液后，室温可以稳定72小时，在2～8℃冷藏可稳定90天。
适用仪器为适用于各种半自动和全自动生化分析仪。
基于以上检测试剂盒，尿酸的检测方法按照以下步骤进行，检测方法的原理为酶学速率法，根据在波长546nm处，吸光度的上升速率与样本中尿酸的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒时间段内的吸光度上升速率，根据公式计算尿酸的含量。
测定原理依据如下：
如图1 所示，在尿酸酶浓度一定的情况下，尿酸酶活性为0.2U/ml，不同浓度尿酸的反应曲线在0～6分钟内基本为直线关系，进一步的，在0～5分钟内，反应的线性良好，所以确定线性期为0～5分钟，读数时间应在此范围内。
如图2 所示，尿酸一定的情况下，尿酸浓度为300μmol/L，不同浓度尿酸酶的反应曲线有明显差异，通过进行不同浓度尿酸情况下改变尿酸酶浓度得到的反应曲线，结果显示反应液中尿酸酶浓度在0.05U/ml～1U/ml范围内，0～5分钟内的线性良好；超过1U/ml则线性期很短，在4分钟内即到达反应终点，浓度越高，到达终点的时间越短，这样无法确定一定的读数期，或者读数期内无法实现均匀的速率反应，而且过量的酶对反应产物有一定影响，到达终点后的吸光度有下降趋势，不稳定；低于0.05U/ml则反应吸光度变化很小，灵敏度很低。所以确定酶浓度范围为0.05U/ml～1U/ml。
具体操作方法如下：
（1）吸光度上升速率检测
双试剂模式操作步骤：
首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，混匀，37℃条件下保温3～5分钟，优选为5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，延迟30～60秒后，得到反应液，反应液中酶浓度为0.05～1U/ml，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；
或，
单试剂模式操作步骤：先将缓冲液和酶试剂配成试剂工作液，稳定10分钟；然后根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，得到反应液，反应液中酶浓度为0.05～1U/ml，37℃反应，延迟30～60秒后，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；
试剂1与试剂2之和与样本的体积比为100:1～20:1。
（2）计算结果：
根据下列公式计算尿酸的含量：
尿酸含量(μmol/L)= 
×标准浓度
标准浓度为标准液的浓度值。
样本的制备方法为：样本采用血清或血浆，按照医院通常采用的标准方法采集血样，然后分离血清或者血浆。
样本要求为：样本可以是新鲜不溶血血清或肝素抗凝血浆、尿液。血样中尿酸在2～8℃可稳定3天。
实施例2，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，含有5mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS），pH值为7.5；酶试剂为尿酸酶溶液，浓度为0.5U/ml，含有4U/ml过氧化酶和3mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为4:1；标准液为尿酸溶液，浓度为297μmol/L，以国家标准品赋值校准。
采用以上检测试剂盒对尿酸进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为0.1U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例1的检测方法相同。
分析方法：速率法；反应方向：正反应。
| 空白管 | 标准管 | 样本管 | |
| 缓冲液（μl） | 200 | 200 | 200 |
| 蒸馏水（μl） | 5 | ---- | ---- |
| 标准液（μl） | ---- | 5 | |
| 标 本（μl） | ---- | ----- | 5 |
| 酶试剂（μl） | 50 | 50 | 50 |
尿酸含量(μmol/L)= 
×标准浓度
ΔA为吸光度变化率；
标准浓度为标准液的浓度值。
尿酸参考范围为：
男：208～428 μmol/L（37℃）
女：155～357 μmol/L（37℃）
检验结果的解释：尿酸是嘌呤、核酸和核蛋白的代谢产物。因此，体内尿酸浓度的异常可指示这些物质代谢的障碍。尿酸增高见于痛风、急性或慢性肾小球肾炎、肾结核、肾盂积水、子痫、慢性白血病、红细胞增多症、摄入过多含核蛋白食物、尿毒症肾炎、肝脏疾患、氯仿和铅中毒、甲状腺功能减低、多发性骨髓瘤、白血病、妊娠反应红细胞增多症。尿酸减低：见于恶性贫血、使用阿司匹林、先天性黄嘌吟氧化酶和嘌吟核苷磷酸化酶缺乏等。尿酸的测定可作为肾功能、痛风疾病的指标，它在痛风的诊断和肾功能方面有着重要的意义。
线性范围：0～1190μmol/L（37℃）。
注意事项
1、在全自动生化分析仪上使用双试剂工作模式，结果会更加准确可靠；
2、根据不同仪器的要求，试剂与样本用量可按比例改变；
3、测定波长可在546nm附近选择；
4、如果样品血糖浓度＞1190 μmol/L （37℃）或怀疑高值而测定偏低（钩状效应），将其以生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数；
实施例3，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，含有8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS），pH值为7.5；酶试剂为尿酸酶溶液，浓度为0.4U/ml，含有2U/ml过氧化酶和1mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为1:1；标准液为尿酸溶液，浓度为297μmol/L，以国家标准品赋值校准。
采用以上检测试剂盒对尿酸进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为0.2U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例2的检测方法相同。
分析方法：速率法；反应方向：正反应。
| 空白管 | 标准管 | 样本管 | |
| 试剂1（μl） | 150 | 150 | 150 |
| 蒸馏水（μl） | 6 | ---- | ---- |
| 标准液（μl） | ---- | 6 | |
| 标 本（μl） | ---- | ----- | 6 |
| 试剂2（μl） | 150 | 150 | 150 |
实施例4，一种检测试剂盒，除以下与实施例1不同外，其余与实施例1中检测试剂盒相同；缓冲液为0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，含有3.5mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS），pH值为7.5；酶试剂为尿酸酶溶液，浓度为0.9U/ml，含有5U/ml过氧化酶和4mmol/L的4-氨基安替比林；试剂1与试剂2的体积比为5:1；标准液为尿酸溶液，浓度为297μmol/L，以国家标准品赋值校准。
采用以上检测试剂盒对尿酸进行检测，检测方法按照以下步骤进行：吸光度上升速率测定步骤按照双试剂模式操作进行，首先根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；然后在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温5分钟，然后再加入酶试剂，混匀，得到反应液，反应液中酶浓度为0.15U/ml；37℃反应，延迟30秒后，在波长500nm处读取反应液的吸光度变化，读数时间为60秒，计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分钟，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率ΔA/分钟；各成分的具体量见下表，其余步骤与实施例2的检测方法相同。
分析方法：速率法；反应方向：正反应。
| 空白管 | 标准管 | 样本管 | |
| 试剂1（μl） | 250 | 250 | 250 |
| 蒸馏水（μl） | 6 | ---- | ---- |
| 标准液（μl） | ---- | 6 | |
| 标 本（μl） | ---- | ----- | 6 |
| 试剂2（μl） | 50 | 50 | 50 |
以上实施例中吸光度上升速率测定步骤也可以按照单试剂模式操作进行，首先将试剂1与试剂2配成试剂工作液，稳定10分钟；然后根据测定取所需要的空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，得到反应液，37℃反应，其余步骤与各实施例相同；各成分的具体见下表，所得结果与各实施例的结果一致。
| 空白管 | 标准管 | 样本管 | |
| 试剂工作液（μl） | 250 | 250 | 250 |
| 蒸馏水（μl） | 5 | ---- | ---- |
| 标准液（μl） | ---- | 5 | |
| 标 本（μl） | ---- | ----- | 5 |
在半自动生化分析仪和全自动生化分析仪上均可以使用双试剂模式，也可以使用单试剂模式，推荐使用双试剂模式。
本发明上述实施例2至实施例4与传统的酶学终点法进行尿酸的检测，结果如下表：
| 测定次数 | 平均值 | 相对偏差% | |
| 实施例2 | 10 | 422μmol/L | 2.6 |
| 实施例3 | 10 | 427μmol/L | 3.9 |
| 实施例4 | 10 | 424μmol/L | 3.1 |
| 酶学终点法 | 10 | 432μmol/L | 5.1 |
结果显示：通过本发明的实施例进行尿酸的检测，并与酶学终点法的检测结果进行比较，无显著差异，但从数据看出，本发明的方法因为完全排除了血清本底因素的干扰，去除了本底对测定值的增高的影响，因此测值略微偏低，更加接近真实值，结果更加准确可靠；从结果还可看出相对偏差小，表明准确度高；本发明还缩短了反应时间，并使操作更加简便，适用于各种生化分析仪器。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种尿酸的检测方法，其特征在于：所述检测方法为采用酶学速率测定法，根据在波长546nm处，反应体系吸光度的升高速率与样本中尿酸的浓度成正比，延迟30～60秒后，测定30～180秒内的吸光度升高速率，得到尿酸的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述吸光度上升速率测定步骤：
a、制备反应液
取空白管、标准管及样本管，分别加入缓冲液；在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，混匀，37℃条件下保温3～5分钟，再加入酶试剂，混匀，得到反应液；或
将缓冲液和酶试剂按比例混合配成试剂工作液，稳定3～5分钟；然后取空白管、标准管及样本管，分别加入试剂工作液；再分别在样本管、空白管及标准管内对应加入待测样本、蒸馏水及标准液，得到反应液；
b、反应液在37℃条件下反应，延迟30～60秒后，在波长546nm处读取反应液的吸光度变化，读数间隔时间为30～180秒，计算平均每分钟吸光度变化率，得到空白管、标准管及样本管内反应液的每分钟吸光度变化率。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述缓冲液与酶试剂的体积比为5:1～1:1；缓冲液、酶试剂之和与待测样本的体积比为100:1～20:1。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述缓冲液为含有3.5～8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）的0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述酶试剂为尿酸酶和过氧化酶溶液，尿酸酶浓度为0.2U/ml～5U/ml；过氧化酶浓度为1～10U/ml。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述标准液为尿酸溶液，浓度为100～400μmol/L。
7.实现如权利要求1-6其中之一所述检测方法的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括包装盒、缓冲液、酶试剂、标准液；
所述缓冲液为含有3.5～8mmol/L N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）的0.4mol/L的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于：所述酶试剂为尿酸酶和过氧化酶溶液，尿酸酶浓度为0.2U/ml～5U/ml；过氧化酶浓度为1～10U/ml。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于：所述标准液为尿酸溶液，浓度为100～400μmol/L。
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