JP6635814B2 - 微量かつ未知量体液の分析方法 - Google Patents
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Description
本発明の微量かつ未知量体液の分析方法は、検体作製工程と、第1算出工程と、第2算出工程と、を含むものである。
検体作製工程は、採取器具を用いて採取された微量の体液に、規定量の標準物質含有緩衝液を添加、混和して検体を作製する工程である。標準物質含有緩衝液の添加量は、検体の分析項目によって希釈率が異なるため、一定量ではないが、通常、60μl程度である。
第1算出工程は、検体作製工程で作製された検体の希釈率を算定するために必要な多点希釈率検量線を構築する工程である。具体的には、標準物質含有緩衝液を精製水で希釈した既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を作製する。なお、希釈系列の作製は、化学天秤等を用いた重量法で行うことが好ましい。次に、分析装置を用いて希釈系列の吸光度を測定し、すなわち、分析装置にて各々の希釈系列標本の標準物質を発色させて吸光度分析を行い、希釈率と吸光度の較正(キャリブレーション)を行って分析装置内のシステムに多点希釈率検量線を設定する。
第2算出工程は、分析装置を用いて検体の吸光度を測定し、検体の吸光度から、予め算出された検量線(多点希釈率検量線)を用いて、検体の希釈率を算出すると共に、分析装置を用いて検体の分析項目の分析値を測定し、検体の分析値に前記検体の希釈率、具体的には「1/希釈率」を乗じて、体液の分析値(原濃度の体液の分析値)を算出する工程である。
(検体の作製)
塩化コリン、パーオキシダーゼ、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、4−アミノアンチピリンを生理的食塩水に希釈した標準物質含有緩衝液1000μlに、ヒトプール血漿を30〜250μlの範囲で所定量添加して、表1に示す10段階の希釈倍数(約4〜22倍)に希釈された検体No.1〜10を作製した。
分析装置(日本電子株式会社製、JCA−BM6050)で、検体No.1〜10の総コレステロール値(TC)およびLDLコレステロール値(LDL)を測定した。測定された(TC)、(LDL)と、原濃度ヒトプール血漿の(TC):190.4mg/dl、(LDL):112.8mg/dlとから、検体No.1〜10の希釈倍数(DF)を算出し、(TC)、(LDL)の両者の希釈倍数(DF)の平均値(平均DF)を理論希釈倍数(TDF)とした。その結果を表1に示す。
以下に示す多点希釈率検量線法によって、検体No.1〜10の希釈倍数(DF)を算出した。
まず、前記標準物質含有緩衝液を精製水で所定の希釈率:0.00(ブランク)、0.05、0.10、0.20で希釈して希釈系列標本を4種作製し、前記分析装置で吸光度を5重測定した。その結果を表2に示す。ここで、希釈率:0.00(ブランク)は、標準物質含有緩衝液のみで、精製水で希釈していない希釈系列標本であることを示す。そして、表2の希釈率と、吸光度の値から折れ線近似式(図1参照)を設定し、検量線とした。
DF=1/DR・・・(2)
算出された希釈倍数(DF)と、表1に示す理論希釈倍数(TDF)とを比較して、その一致率(%)を算出した。その結果を表3に示す。
以下に示す計算法によって、検体No.1〜10の希釈倍数(DF)を算出した。
前記分析装置で検体No.1〜10の吸光度(E1)を測定した。1検体について3重測定した。測定した吸光度(E1)の平均値(Av)と、予め測定した前記標準物質含有緩衝液のみの吸光度(E0):5414.7とから、下式(3)で希釈倍数(DF)を算出した。
DF=E0/(E0−E1)・・・(3)
算出された希釈倍数(DF)と、表1に示す理論希釈倍数(TDF)とを比較して、その一致率(%)を算出した。その結果を表4に示す。
したがって、実施例の多点希釈率検量線法による分析方法では、微量かつ未知量体液を希釈して作製した検体を用いて分析を行っても、検体の希釈倍数(DF)および希釈率(DR)を精度良く算出でき、その希釈率(DR)から算出される体液の分析値としての分析精度(正確度)に優れることが確認できた。
Claims (3)
- 採取器具を用いて採取された5〜40μlの血液を、酵素反応物である色素を含有する標準物質含有緩衝液で希釈して検体を作製する検体作製工程と、
前記標準物質含有緩衝液を精製水で希釈した既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を作製し、分析装置を用いて前記希釈系列の吸光度を測定し、前記既知の希釈率と前記吸光度とを座標点として、多数の前記座標点から統計学的手法を用いて前記既知の希釈率と前記吸光度との関係を表す近似直線または近似曲線を算出して検量線とする第1算出工程と、
前記分析装置を用いて、前記検体の吸光度を測定し、前記検体の吸光度から予め算出された前記検量線を用いて前記検体の希釈率を算出すると共に、前記検体の分析項目の分析値を測定し、前記検体の分析値に前記検体の(1/希釈率)で定義される希釈倍数を乗じて前記血液の分析値を算出する第2算出工程と、を含み、
前記標準物質含有緩衝液は、標準物質を緩衝液で希釈したもので、前記標準物質は、試薬と、前記試薬と反応する酵素と、酵素反応によって光を吸収する色素を形成する色原体と、からなり、
前記試薬は、グリセロール−3−リン酸、塩化コリンの少なくとも1種からなり、
前記酵素は、グリセロール−3−リン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼの少なくとも1種からなり、
前記色原体は、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、4−アミノアンチピリンの少なくとも1種からなることを特徴とする微量かつ未知量体液の分析方法。 - 前記検体作製工程において、前記5〜40μlの血液を、前記標準物質含有緩衝液で3〜30倍の希釈倍数で希釈して検体を作製することを特徴とする請求項1に記載の微量かつ未知量体液の分析方法。
- 前記検体作製工程において、前記血液が、前記採取器具を用いて採取後、遠心分離されることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の微量かつ未知量体液の分析方法。
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