CN107884401A - 消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法 - Google Patents

消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂Ⅰ中含有脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶，NAD+，Triton X‑100，变旋酶；试剂Ⅱ中含有葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，4‑氨基安替比林，2,4‑二氯酚等有效成分：其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，甘油三酯在脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶的作用下转变为二羟丙酮；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖在葡萄糖氧化酶、过氧化物酶的作用下，与4‑氨基安替比林，2,4‑二氯酚缩合成红色醌亚胺，仪器以第一步反应为空白，由第二步产生的醌亚胺计算出葡萄糖的含量。

Description

消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法
技术领域
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中葡萄糖的测定方法。
背景技术
血清葡萄糖常用的检测方法主要有葡萄糖氧化法、微电流法、氧速率法、已糖激酶法、邻甲苯胺法、葡萄糖脱氢酶法、气相色谱/同位素稀释质谱法等，国内临床实验室推荐使用葡萄糖氧化酶法。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase，POD)使过氧化氢，4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应，红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。脂血标本是临床检验常见的干扰原因，血脂中的乳糜微粒和极低密度脂蛋白是悬浮颗粒，血清葡萄糖检测常用的比色法或比浊法有极大干扰。对于重度脂血样本，由于样本的本底吸光度过高，必须对样本进行预处理，常用的方法包括：
1、生理盐水稀释法：大部分全自动生化分析仪都具有自动稀释、自动换算功能；也可以先手工稀释，再将测定结果乘以稀释倍数。这种方法可以在一定程度上降低样本空白而提高测定的准确性，但是该法并不能完全消除脂浊对测定结果的影响，特别是要注意样本稀释后由于基质效应而导致测定结果出现一定的误差。
2、乙醚抽提法：在高脂血样本中加入有机溶剂乙醚，震荡混匀后离心，可有效地将样本中的甘油三酯等脂溶物质萃取出来，但是由于该方法加入了新的化学物质，会对有些检验项目的测定产生影响。
3、沉淀分离法：该方法来源于沉淀法测定HDL，即联合使用磷钨酸-镁沉淀剂和聚乙二醇-硫酸葡聚糖沉淀剂，沉淀血清中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、脂蛋白(a)，该方法对部分检验项目的测定会产生影响，且操作繁琐，因此该法也有一定的局限性。
4、干化学法：干化学分析仪是采用以Kubleka-Munk理论为主要理论基础的多层薄膜的固相试剂技术，将发生在液相反应物中的反应，转移到一个固相载体上，利用反射光度法和基于离子选择电极(ISE)的差示电位法进行检测的一类新型仪器。当全血通过多层薄膜的固相时，血细胞、脂浊微粒等物质可以被阻截，因此该法亦可有效地去除脂浊对生化检验结果的干扰。
5、高速离心法：将脂浊血清加盖密封，经高速离心后，血清可以分成两层，吸取下层的血清进行临床生化测定，适用大部分临床生化测定指标的测定。但该法设备要求较高，中小医疗机构没有高速离心机，限制了该法的使用。
随着社会经济的飞速发展，人们的生活水平逐步提高，但运动时间却越来越少，导致高脂血症的发病人数呈逐年递增的趋势，在临床中遇到的高脂血检验样本也越来越多。而高脂血症会对各种生化检验项目造成一定程度的干扰，这一直是困扰生化检验项目的一个重大难题，如果不及时消除高脂血症对生化检验项目的干扰，那么生化检测的结果将会受到一定程度的影响，从而间接的造成医生对病情诊断的失误，这对患者的生命健康造成了极大的威胁，必须尽快解决这一难题。
发明内容：
为了解决现有技术血清中葡萄糖测定方法存在内源性脂血干扰的问题，本发明提供一种经济方便易行，准确度更高、能够有效消除内源性脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法。
解决该技术问题采用的技术方案是：试剂Ⅰ含有脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶，NAD+，Triton X-100，变旋酶，硫酸镁；试剂Ⅱ中含有葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，4-氨基安替比林，2,4-二氯酚等有效成分：其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，甘油三酯在脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶的作用下转变为二羟丙酮；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖氧化成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与4-氨基安替比林、2,4-二氯酚缩合成红色醌亚胺，仪器以第一步反应为空白，由第二步产生的醌亚胺计算出葡萄糖的含量，本发明是一种能消除脂血干扰的葡萄糖检测方法。
反应过程如下：
第一步反应
第二步反应
本发明与现有技术相比有如下优点：原有的葡萄糖氧化酶测定方法易受脂血干扰，当甘油三酯超过7.5mmol/L，乳糜>10.％时出现明显的正干扰，而本发明测定方法当血清中甘油三酯≤22.5mmol/L，乳糜≤30.0％未出现明显干扰现象，是一种准确性更高的葡萄糖氧化酶检测方法。
附图说明
附图1是本发明消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶法实时反应曲线图。
附图2是脂血标本在不同波长情况下的光谱吸收曲线。
具体实施方式：
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a.试剂Ⅰ：
每升0.1mol磷酸盐缓冲液中含有NAD+6.0mmol，脂蛋白脂肪酶300U，甘油脱氢酶750U，Triton X-1000.15g，硫酸镁2.0mmol/L，变旋酶1.5KU、Proclin-300防腐剂200μl，其中，Triton X-100为脂蛋白解离剂，脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶为甘油三酯分解酶。
b.试剂Ⅱ：
每升0.1mol磷酸盐缓冲液中含有抗坏血酸氧化酶8.0KU、葡萄糖氧化酶15KU、过氧化物酶15KU、4-氨基安替比林0.5mmol，2,4-二氯酚0.5mmol/L,Proclin-300200μl。
其中，硫酸镁为甘油脱氢酶的激活剂，Triton X-100为脂蛋白解离剂，Proclin-300防腐剂。
c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。
上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶70～80∶70～80。
实施例2
测定程序
研究对象住院及门诊患者204例进行空腹采血2.0mL，低速离心10分钟后分离血清，根据脂血情况分为脂血组和非脂血组，应用北京利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法，脂血组采用本发明方法和超速离心后采用利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法分别进行葡萄糖测定，并观察实时反应曲线。
下面通过应用北京利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法，采用本发明方法和超速离心后采用利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法分别进行葡萄糖测定来说明本发明的检测效果。
1.本发明方法：在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3μl样品加入到225μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入225μl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在540nm波长处检测。仪器自动计算出葡萄糖结果，具体见表1：
表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
计算公式为：
ODGLU＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
葡萄糖浓度＝F×ODGLU
其中ODGLU是葡萄糖产生的吸光度，OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。
ODGLU＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
葡萄糖浓度＝F×ODGLU
其中ODGLU是葡萄糖产生的吸光度，OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。
2.目前实验室测定方法采用北京利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法
(GOD法)，样品体积3μl，试剂体积300μl，测定波长为540nm，8.1min终点法比色。
应用本发明方法、北京利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法、超速离心后采用利德曼生化股份有限公司葡萄糖测定方法分别进行脂血组和非脂血组血清葡萄糖，并进行统计学分析。
在测定非脂血组，结果显示两种方法无显著性差异(t＝0.3820,P>0.05，n＝132)，呈良好相关性，Y本发明方法＝1.01XGOD法+0.056，R2＝0.9649；在测定脂血组本发明方法与原有方法有高度显著性差异(t＝24.32,P<0.01，n＝72)，原有方法测定结果明显偏高；本发明方法与经过高速离心后采用GOD法测定脂血组葡萄糖，两种方法无显著性差异(t＝0.4813,P>0.05，n＝72)，呈良好相关性，Y本发明方法＝1.04XGOD法-0.110，R2＝0.9729。脂血标本在测定葡萄糖时，有较高的本底吸收，特别是测定波长较低时，本底吸收更大，如图2，应用本发明方法，现将脂蛋白分解，然后在应用内空白法，能够有效的去除脂血干扰，如图1所示。
经过以上比较可看出，本发明方法可以消除脂血干扰进行血清葡萄糖测定，经实验研究，当甘油三酯≤22.5mmol/L时，乳糜≤30.0％时对本发明方法无明显干扰。

Claims (4)

1.一种消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法，其特征在于：试剂Ⅰ中含有脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶，NAD+，Triton X-100，变旋酶；试剂Ⅱ中含有葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，4-氨基安替比林，2,4-二氯酚等有效成分：其测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，甘油三酯在脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶的作用下转变为二羟丙酮；加入试剂Ⅱ后，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与4-氨基安替比林，2,4-二氯酚缩合成红色醌亚胺，仪器以第一步反应为空白，由第二步产生的醌亚胺计算出葡萄糖的含量。
计算公式为：
ODGLU＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
葡萄糖浓度＝F×ODGLU
其中ODGLU是葡萄糖产生的吸光度，OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2是样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。
2.根据权利要求1所述消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法，其特征在于：试剂I中0.1mol磷酸盐缓冲液中含有NAD+2.0～10.0mmol，脂蛋白脂肪酶200～400U，甘油脱氢酶500～1000U，Triton X-1000.10g～0.20g，硫酸镁1.5～2.5mmol/L，变旋酶1.0～2.0KU、Proclin-300防腐剂100μl～300μl，其中，Triton X-100为脂蛋白解离剂，脂蛋白脂肪酶，甘油脱氢酶为甘油三酯分解酶；试剂Ⅱ中每升0.1mol磷酸盐缓冲液含有抗坏血酸氧化酶6～10KU、葡萄糖氧化酶10～20KU、过氧化物酶10～20KU、4-氨基安替比林0.4～0.60mmol，2,4-二氯酚0.4～0.6mmol/L,Proclin-300100μl～300μl。
3.根据权利要求1所述消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中磷酸盐缓冲液的pH值为7.0±0.2。
4.根据权利要求1所述消除脂血干扰的葡萄糖氧化酶测定方法，其特征在于测定的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶70～80∶70～80。
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