CN110579472A - 体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了体液中α‑D‑葡萄糖苷的测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂II中仅有α‑糖苷酶一种有效组分，其它有效组分同在试剂I中，体液中葡萄糖先与试剂Ⅰ反应生成D‑葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶催化下与4‑氨基安替比林，2,4‑二氯酚生成红色醌亚胺和水，加入试剂Ⅱ后体液中α‑D‑葡萄糖苷在α‑糖苷酶作用下水解成ROH和α‑D‑葡萄糖，α‑D‑葡萄糖在变旋酶作用下生成β‑D‑葡萄糖再与试剂Ⅰ反应生成红色醌亚胺和水，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为反应空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出体液中α‑D‑葡萄糖苷的含量。
Description
技术领域
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法。
背景技术
单糖半缩醛羟基与另一个分子（例如醇、糖、嘌呤或嘧啶）的羟基、胺基或巯基缩合形成的含糖衍生物，也称配糖体，是单糖或寡糖的半缩醛羟基与另一分子中的羟基、氨基或硫羟基等失水而产生水合物，因此一个糖苷可分为两部分，一部分是糖的残基（糖去掉半缩醛羟基），另一个部分是配基（非糖部分），其键称为糖苷键，配基部分可以是很简单的，也可以是很复杂的，糖苷键可以通过氧、硫、氮原子彼此连接起来，它们的糖苷分别简称为O-苷、S-苷、N-苷或C-苷。糖苷的配基可以是糖，这样就缩合成双糖、寡糖和多糖，糖苷广泛分布于植物的根、茎、叶、花和果实中，大多是带色晶体，能溶于水，一般味苦，有些有剧毒，水解时生成糖和其他物质，例如苦杏仁苷（amygdalin）C20H27NO11水解的最终产物是葡萄糖C6H12O6、苯甲醛C6H5CHO和氢氰酸HCN，糖苷可用作药物，很多中药的有效成分就是糖苷，例如柴胡、桔梗、远志等。由于立体构型的不同，糖苷有α和β两类型。葡萄糖的苷（葡萄苷）和其他糖的苷，大多数是β-型糖苷，人体体液（血液和尿液）中的糖苷主要来自食物、水果及药物，特别是一些草药类，它们进入人体后通过糖苷酶进行分解，吸收，多余的未被吸收的经肾脏排出体外，体内的糖苷作为人体的外来物质，本发明提供了一种人体体液中α-D-葡萄糖苷实验室测定方法。
发明内容：为了能简单、方便、快捷及准确地测定体液中α-D-葡萄糖苷，本发明提供一种经济方便易行，准确性高的体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法。
本发明采用的技术方案是：试剂Ⅰ中含有葡萄糖氧化酶，4-氨基安替比林，2,4-二氯酚，过氧化物酶，变旋酶等主要成分及适量防腐剂；试剂Ⅱ内仅含有α-糖苷酶及适量防腐剂；其测定方法为：体液（血液或者尿液）先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，体液中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成D-葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林，2,4-二氯酚在过氧化物酶催化下生成红色醌亚胺和水，加入试剂Ⅱ后体液中α-D-葡萄糖苷在α-糖苷酶作用下水解成ROH和α-D-葡萄糖，α-D-葡萄糖在变旋酶作用下，β-D-葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成D-葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林，2,4-二氯酚在过氧化物酶催化下生成红色醌亚胺和水，在500nm～540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为反应空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出体液中α-D-葡萄糖苷的含量。
上述试剂Ⅰ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有抗坏血酸氧化酶1.0～3.0KU、葡萄糖氧化酶(POD)12～20KU、过氧化物酶1.0～2.0KU、4-氨基安替比林0.2～0.60mmol、2,4-二氯酚0.6～1.0mmol、变旋酶1.0～3.0KU、Proclin-300 100～300μL；试剂Ⅱ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有α-糖苷酶1.0～3.0KU、Proclin-300100～300μL。
上述试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0±0.2（25℃）。
上述测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II=1∶60～100∶10～40。
本发明方法试剂Ⅱ中仅有α-糖苷酶一种有效组分，葡萄糖色原物及工具酶同在试剂Ⅰ中，由于葡萄糖生成的红色醌亚胺和α-D-葡萄糖苷水解生成的葡萄糖生成的红色醌亚胺先后呈色，以试剂Ⅰ反应产生红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出α-D-葡萄糖苷的含量，其原理为：
反应公式为：
本发明的方法检测时不受体液中葡萄糖影响，由于体液中葡萄糖在加入试剂Ⅰ就已完成反应，不会参与以后的反应。加入试剂Ⅱ后α-D-葡萄糖苷才开始反应，因此消除了体液中葡萄糖的影响，使检测数据能真实反映α-D-葡萄糖苷的含量。本发明的测定方法能自动化，减少检测成本和时间，提高了检测效率。
附图说明
图1是本发明α-D-葡萄糖苷测定实时反应曲线。
图2是本发明α-D-葡萄糖苷的结构式。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明检测血清中α-D-葡萄糖苷做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a.试剂Ⅰ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有抗坏血酸氧化酶1.5KU、葡萄糖氧化酶 16KU、过氧化物酶1.5KU、4-氨基安替比林0.40mmol、2,4-二氯酚0.8mmol、变旋酶2KU、Proclin-300 200μL。
b.试剂Ⅱ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有α-糖苷酶2.0KU，Proclin-300 200μL。
c.标准液：6.0mmol/Lα-D-葡萄糖苷定值血清。
实施例2
测定程序
本发明方法：在美国贝克曼 AU5800全自动化生化分析仪上，仪器自动将3µl样品加入到240µl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入60µl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在505nm波长处检测。仪器自动计算出α-D-葡萄糖苷结果，具体见表1。
表1. 本发明自动化生化分析仪测试条件
ODα-D-葡萄糖苷= OD2 -OD1×[SV+R1V1）/(SV+R1V1 +R2V2)]
α-D-葡萄糖苷浓度= F×ODα-D-葡萄糖苷
其中ODα-D-葡萄糖苷是α-D-葡萄糖苷产生的吸光度，OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2是血清样品加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积，F是校正因数。
加入试剂II后OD1的稀释倍数为[（SV+R1V1 ）/ (SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[（SV+R1V1）/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由α-D-糖苷产生的醌亚胺的吸光度为：ODα-D-葡萄糖苷 = OD2 - OD1×[（SV+R1V1）/(SV+R1V1 +R2V2)]，即ODα-D-葡萄糖苷 = OD2 –(3+240)/(3+240+60)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出α-D-葡萄糖苷的浓度，如图1所示。
实施例3
下面通过采用本发明方法测定健康体检人群和中医科中草药治疗人群测定血清中α-D-葡萄糖苷比较来说明本发明方法的性能参数。
1.检测对象：中草药治疗患者40例，其中男20人，平均年龄46.0岁；女性20人，平均年龄44.0岁；体检待检者40例，其中男20人，平均年龄46.0岁；女性20人，平均年龄45.0岁，空腹静脉采血2 mL，离心待检。
2.采用本发明方法进行测定
2.1试剂：本发明方法采用实施例1中样品∶试剂I∶试剂II=1∶60～100∶10～40。
2.2.仪器：美国贝克曼 AU5800全自动化生化分析仪。
2.3.方法
2.3.1.本发明方法 样品3μl，试剂I 240μl，试剂II 60μl。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II反应5.1分钟，505nm波长处终点法测定。
2.3.2. 本发明方法性能参数为：批内精密度<4.0%，批间精密度<5.5%，线性范围为0.18～24.0mmol/L，可报告范围为1.6～56.5mmol/L，中草药治疗患者血清中α-D-葡萄糖苷≥5.0mmol/L，健康体检者一般≤0.8mmol/L，空白吸光度<0.20(0.5cm,37℃，505nm)，灵敏度为5.50mmol/L的样本吸光度变化为≥0.16。
α-D-葡萄糖苷分解产生等摩尔的葡萄糖，通过新的试剂组合方式，根据测定的葡萄糖结果换算成α-D-葡萄糖苷，各项性能参数达到预期要求，可以广泛应用于药物浓度测定，人体内含量，体内代谢等方面研究。
Claims (5)
1.一种体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法，其特征在于体液先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，体液中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成D-葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替比林，2,4-二氯酚在过氧化物酶催化下生成红色醌亚胺和水，加入试剂Ⅱ后，体液中α-D-葡萄糖苷在α-糖苷酶作用下水解成ROH和α-D-葡萄糖，α-D-葡萄糖在变旋酶作用下生成β-D-葡萄糖，β-D-葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成D-葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化物酶催化过氧化氢、4-氨基安替比林、2,4-二氯酚生成红色醌亚胺和水，在500nm～540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为反应空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出α-D-葡萄糖苷的含量。
2.根据权利要求1所述体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法，其特征在于本发明试剂Ⅱ中仅有α-糖苷酶一种有效组分，葡萄糖色原物及工具酶同在试剂Ⅰ中。
3.根据权利要求2所述体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有抗坏血酸氧化酶1.0～3.0KU、葡萄糖氧化酶12～20KU、过氧化物酶1.0～2.0KU、4-氨基安替比林0.2～0.60mmol、2,4-二氯酚0.6～1.0mmol、变旋酶1.0～3.0KU、Proclin-300 100～300μL；试剂Ⅱ：每升0.2mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.0，25℃）中含有α-糖苷酶1.0～3.0KU，Proclin-300 100～300μL。
4.根据权利要求3所述体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中磷酸盐缓冲液的pH值为7 .0±0 .2（25℃）。
5.根据权利要求3所述体液中α-D-葡萄糖苷的测定方法，其特征在于上述测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II=1∶60～100∶10～40。
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