CN106367471A

CN106367471A - 用于测定总胆固醇的试剂盒和方法

Info

Publication number: CN106367471A
Application number: CN201610864199.1A
Authority: CN
Inventors: 吴昌英; 罗岚
Original assignee: Sichuan Maker Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2016-09-29
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2036-09-29
Also published as: CN106367471B

Abstract

本发明涉及用于测定总胆固醇的试剂盒和方法。所述试剂盒包含试剂组1和试剂组2，所述试剂组1包含色原和胆固醇酯酶，所述试剂组2包含4‑氨基安替比林、过氧化物酶和胆固醇氧化酶，其中，所述色原是或者包含N‑乙基‑N‑(2‑羟基‑3‑磺丙基)‑3,5‑二甲氧基苯胺。本发明的试剂盒和方法可以降低总胆固醇检测中由样品中存在的羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺所造成的干扰。

Description

用于测定总胆固醇的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域。特别地，本发明涉及一种用于检测总胆固醇的试剂盒和方法。

背景技术

胆固醇又称胆甾醇，是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇等。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质之一，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成肾上腺皮质激素、胆汁酸和维生素D等生理活性物质的重要原料，也是构成细胞膜的主要成分。

血清总胆固醇(total cholesterol,TC)是指血液中所有脂蛋白所含胆固醇之总和，分为酯化型胆固醇(又称胆固醇酯)和游离型胆固醇。测定血清TC的浓度可作为脂代谢的指标之一。此外，TC的含量测定对心脑血管疾病诊断、疗效判断和预后分析都具有一定的参考价值。

高胆固醇血症是影响冠心病发病的主要危险因素之一。TC含量的增高多见于高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿病、肾病综合征、甲状腺功能减退、胆总管阻塞、高血压(部分)等病症，以及维生素A、维生素D、口服避孕药等药物的摄入。TC含量的减少可见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、肝病、严重感染、营养不良等病理状态，以及对氨基水杨酸、卡那霉素、肝素、维生素C等药物的摄入。

总胆固醇的测定方法大致可分为化学试剂比色法、酶分析法、荧光法、气相和高效液相色谱法等五大类。由于气相和高效液相色谱法条件高，临床实验室最常用的是化学试剂法和酶分析法。

化学试剂法大都用有机溶剂提取胆固醇，然后用特殊试剂显色，比色测定，例如乙酸-乙酸酐-硫酸反应显色法(ALBK法)或者高铁-硫酸显色法。化学试剂法由于存在操作复杂、试剂有强腐蚀性(浓硫酸)和不易自动化的缺点，现在已很少应用。

酶法测定特异性强，测定准确度及灵敏度较高，操作简便，试剂无腐蚀性，可全自动操作，性价比高，是目前国内外推荐使用的临床常规的测定方法。

酶法测定总胆固醇的一般原理是：胆固醇酯被胆固醇酯酶(CEH)水解成游离脂肪酸和游离胆固醇，后者被胆固醇氧化酶(COD)氧化成胆甾烯酮，并产生过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂偶联Trinder反应呈色。即H₂O₂与4-氨基安替比林(4-AAP)和色原性氧受体在过氧化物酶(POD)的作用下生成醌亚胺，其生成量与样本中的TC含量成正比。反应式如下：

羟苯磺酸钙(calcium dobesilate)(又称多贝斯(doxium))是毛细血管保护剂，主要用于治疗微血管病、静脉曲张综合症以及与微循环障碍伴发额静脉功能不全，还用于静脉剥离和静脉硬化法的辅助治疗，用于预防术后综合症，水肿及组织浸润。

酚磺乙胺(又名止血敏)的化学名称为2,5-二羟基苯磺酸二乙胺盐。其能使血小板数量增加，并增强血小板的凝集和黏附力，促进凝血活性物质的释放，从而产生止血作用。酚磺乙胺在临床上主要用于预防和治疗外科手术出血过多，血小板减少性紫癜或过敏性紫癜以及其他原因引起的出血。

已有文献报道以上两种药物会对基于Trinder反应的试剂产生负干扰，从而得到不正确的结果，影响临床医生做出判断，最终延误患者治疗，或采用不合理治疗措施导致患者伤亡。例如，参见程涌江等，“酚磺乙胺对部分生化检验项目干扰的相关研究，《国际检验医学杂志》，2011年第11期。

羟苯磺酸钙和酚磺乙胺对酶法检测总胆固醇的干扰对被施用这两种药物的患者造成很大的不便。例如，对于糖尿病患者而言，常伴有冠心病、血管动脉硬化等，而所施用的羟苯磺酸钙对酶法检测总胆固醇的干扰可能造成糖尿病患者的总胆固醇水平无法得到正确评估，掩盖并延误病情。而对于手术患者，所施用的酚磺乙胺对酶法检测总胆固醇的干扰可能使得不能正确评估其总胆固醇水平，造成术后并发症，影响患者的预后。目前，市场上出售的酶法检测试剂盒普遍存在无法有效抵抗羟苯磺酸钙和酚磺乙胺干扰的缺陷。

本领域中需要满足以下一种或多种特性的总胆固醇测定试剂盒：能够抵抗羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对酶法检测总胆固醇的干扰；具有良好的重复性以及宽的线性范围。

发明内容

一方面，本发明提供了一种总胆固醇测定试剂盒，其利用酶法检测总胆固醇。

在一些实施方式中，本发明提供总胆固醇测定试剂盒，其包含试剂组1(R1)和试剂组2(R2)，所述试剂组1包含色原和胆固醇酯酶(CEH)，所述试剂组2包含4-氨基安替比林(4-AAP)、过氧化物酶(POD)、胆固醇氧化酶(COD)。优选地，色原是N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)或者包含DAOS。

本发明人出乎意料地发现，在利用酶法检测总胆固醇时，使用特定用量的DAOS或包含DAOS的色原能够降低样品中存在的羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇检测所造成的干扰。尤其是根据本发明的组合物能够降低样品中存在的100mg/L及以下的羟苯磺酸钙和/或250mg/L及以下的酚磺乙胺对总胆固醇检测所造成的干扰。在优选的实施方式中，DAOS或包含DAOS的色原是与抗坏血酸氧化酶、胆固醇酯酶组合使用的。

在一些实施方式中，色原的量可以在0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L的范围内，例如，色原的量可以为0.15mmol/L、0.2mmol/L、0.25mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、22mmol/L或24mmol/L。

在一些实施方式中，本文中所描述的试剂盒或试剂组1还可以包含抗坏血酸氧化酶。在一些实施方式中，抗坏血酸氧化酶的量在0.1-10KU/L，优选0.5-5KU/L的范围内。抗坏血酸氧化酶的量在上述优选范围内时可以有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。在一些实施方式中，所述试剂盒中抗坏血酸氧化酶的量可以为0.2KU/L、0.3KU/L、0.4KU/L、0.5KU/L、0.6KU/L、0.7KU/L、0.8KU/L、0.9KU/L、1KU/L、1.2KU/L、1.4KU/L、1.5KU/L、2KU/L、2.5KU/L、3KU/L、3.5KU/L、4KU/L、4.5KU/L、5KU/L、5.5KU/L、6KU/L、7KU/L、8KU/L、9KU/L或10KU/L。

在一些实施方式中，所述试剂盒中胆固醇酯酶的量为0.5-8.0KU/L，优选1-5KU/L。例如，所述胆固醇酯酶的量可以为0.6KU/L、0.7KU/L、0.8KU/L、1.0KU/L、1.2KU/L、1.5KU/L、1.8KU/L、2.0KU/L、2.5KU/L、3.0KU/L、3.5KU/L、4.0KU/L、4.5KU/L、5.0KU/L、5.5KU/L、5.7KU/L、6.0KU/L、7.0KU/L或7.5KU/L。胆固醇酯酶的量在上述优选范围内时可以更有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。

在一些实施方式中，使用根据本发明的组合物、试剂组或试剂盒测得的样品中的总胆固醇值与对对照样品测得的总胆固醇值相比偏差小于10％，优选小于8％，更优选小于5.5％，最优选小于4％，其中所述对照样品为除不含羟苯磺酸钙和酚磺乙胺之外，其他均与所述样品相同的样品。

在一些实施方式中，所述4-氨基安替比林的量在0.1-5g/L、优选0.2-1.5g/L的范围内。4-AAP的量在上述范围内时可以有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。在一些实施方式中，所述试剂盒中4-AAP的量可以为0.12g/L、0.15g/L、0.17g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、2g/L、3g/L或4g/L。

在一些实施方式中，所述过氧化物酶的量在0.5-12KU/L、优选1-10KU/L的范围内。例如，所述所述过氧化物酶的量可以为0.7KU/L、1.0KU/L、1.2KU/L、1.5KU/L、1.8KU/L、2.0KU/L、2.5KU/L、3.0KU/L、3.5KU/L、4.0KU/L、4.5KU/L、5.0KU/L、5.5KU/L、6.0KU/L、6.5KU/L、7.0KU/L、7.5KU/L、8.0KU/L、8.5KU/L、9.0KU/L、9.5KU/L、10KU/L、10.5KU/L、11KU/L、11.5KU/L、12KU/L、13KU/L、14KU/L或14.5KU/L。将过氧化物酶的量控制在0.5-12KU/L、优选1-10KU/L的范围内时可以更有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。

在一些实施方式中，所述胆固醇氧化酶的量在0.5-8KU/L，优选1-5KU/L的范围内。在一些实施方式中，所述试剂盒中胆固醇氧化酶的量可以为0.5KU/L、0.6KU/L、0.7KU/L、0.8KU/L、0.9KU/L、1KU/L、1.2KU/L、1.4KU/L、1.5KU/L、1.8KU/L、2KU/L、2.5KU/L、3KU/L、3.5KU/L、4KU/L、4.5KU/L、5KU/L、5.5KU/L、6KU/L、7KU/L或8KU/L。胆固醇氧化酶的量在上述范围内时可以有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。

在阅读了本申请的内容的基础上，本领域技术人员能够合理地确定各组分的用量比例。例如，在一些实施方式中，所述色原与所述4-氨基安替比林的摩尔比为0.2:1-50:1，优选0.5:1-20:1，更优选1:1-15:1，最优选1.2:1-11:1。在一些实施方式中，所述试剂盒中色原与4-氨基安替比林的摩尔比可以为0.2:1、0.5:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1、2.0:1、2.6:1、3.0:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4.0:1、4.2:1、4.5:1、4.8:1、5.0:1、5.5:1、6.0:1、6.5:1、7.0:1、7.5:1、8.0:1、8.5:1、9.0:1、9.5:1、10.0:1、10.5:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1或者50:1。

在一些实施方式中，试剂组1与试剂组2的体积比在6:1-2:1，优选为5:1-3:1范围内，最优选地为4:1。在一些实施方式中，所述试剂盒中试剂组1与试剂组2的体积比可以为6:1、5:1、4:1、3:1、2:1。

为了进一步提高试剂盒的抗干扰性，可以组合使用上述各组分的优选方式。

在本发明的一些优选实施方式中，所述试剂盒包含0.3-20mmol/L的DAOS或含DAOS的色原；1-5KU/L的胆固醇酯酶；0.5-5KU/L抗坏血酸氧化酶。在这些实施方式中，测得的样品中的胆固醇值与对对照样品测得的胆固醇酯值相比，偏差小于10％，优选小于8％，更优选小于6％，其中所述对照样品为除不含羟苯磺酸钙和酚磺乙胺之外，其他均与所述样品相同的样品。

所述试剂组1和/或试剂组2中还可以包含缓冲溶液，其可以为本领域中常规使用的缓冲溶液。在一些实施方式中，所述缓冲溶液可以各自独立地为MOPS、good's缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液以及其任意组合。在一些实施方式中，所述缓冲液的量在5-1000mmol/L、优选10-500mmol/L、更优选地50-100mmol/L的范围内。所述缓冲液的pH可以在6.0-8.5、优选6.5-8.0、更优选地7.0-7.5的范围内。

本发明试剂盒还可以包含本领域通常使用的其他辅助成分。

例如，所述试剂组1和/或试剂组2还可以包含以下试剂中的一种或更多种：稳定剂、防腐剂和表面活性剂。

稳定剂可以为蔗糖、BSA、糖醇等或其任意组合，其量可以为0.5-200g/L，优选1-50g/L。例如，稳定剂的量可以为0.2g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、1g/L、2g/L、5g/L、8g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、70g/L、80g/L、100g/L、120g/L、150g/L、180g/L或200g/L。

防腐剂可以为二氯乙酰胺、咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、尼泊金酯、PC系列、NaN₃等或其任意组合，其量可以为0.02％-0.25％、优选0.025％-0.2％。例如，防腐剂的量可以为0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.10％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.20％、0.22％、0.24％或0.25％。

表面活性剂可以为TWEEN、SPAN、TRITON、EMULGEN系列表面活性剂、胆酸钠、聚氧乙烯衍生物、月桂醇聚氧乙烯醚等，其量可以为0.01％-0.8％、优选0.02％-0.5％。例如，表面活性剂的量可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.08％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.35％、0.40％、0.45％、0.50％、0.55％、0.60％、0.65％、0.70％、0.75％或0.80％。

本发明试剂盒中的各试剂可以各自独立地为液体形式或冻干粉形式。同一试剂组中的试剂可以放置在同一容器中或单独放置。

本发明的试剂盒可以采用本领域技术人员熟知的方法配制。例如，可以通过将同一试剂组中的试剂混合均匀来配制本发明试剂盒。

本发明的试剂盒特别适合用于检测正在接受或已经接受羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺治疗的患者的样品中的总胆固醇，所述患者例如正在接受或已经接受羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺治疗的微血管病、静脉曲张综合症以及与微循环障碍伴发额静脉功能不全、外科手术出血过多，血小板减少性紫癜或过敏性紫癜以及其他原因引起的出血的患者，所述样品可以例如是血液。

另一方面，本发明提供了一种使用上文所述试剂盒检测样品中的总胆固醇含量的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将样品和校准品分别与所述试剂组1混合并孵育所得的混合物，测定所得混合物的吸光度A1，

(b)将所述试剂组2与经孵育的步骤(a)的混合物混合并孵育，测定所得混合物的吸光度A2，

(c)根据下式计算总胆固醇浓度，

样品中总胆固醇浓度＝(A2_U-A1_U)/(A2_C-A1_C)*C_C

上式中，A2_U和A1_U分别表示样品的吸光度A2和A1；A2_C和A1_C分别表示校准品的吸光度A2和A1；C_C表示校准品的浓度。

所述“校准品”指的是已知浓度的胆固醇溶液，已知浓度的胆固醇可以商购获得，可以将其配置为合适的浓度，例如3-10mmol/L。

在上述方法中，步骤(a)和步骤(b)中的孵育时间可由本领域技术人员常规地确定。例如，孵育时间可以为2-30分钟，例如5分钟、10分钟或20分钟。

在一些实施方式中，所述方法中所检测的样品来自正在接受或已经接受羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺治疗的患者。

在一些实施方式中，所述方法中使用的样品与试剂组1、试剂组2的量的比例为样品：试剂组1：试剂组2＝1:80:20。例如，样品、试剂组1和试剂组2的用量可以分别为3μl、240μl和60μl。

在另一方面，本发明提供了N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺或者包含DAOS的组合物或试剂盒用于降低在用酶法进行的总胆固醇检测中由样品中存在的羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺所造成的干扰的用途，其中所述色原的量为0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L。

在另外一个方面，本发明提供了N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于制备抗羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺干扰的总胆固醇测定试剂盒的用途，其中所述色原的量为0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L。优选地，所述总胆固醇测定试剂盒是根据本发明所述的总胆固醇测定试剂盒。

在一些实施方式中，在根据本发明的组合物中，抗坏血酸氧化酶的量在0.1-10KU/L，优选0.5-5KU/L的范围内。抗坏血酸氧化酶的量在上述范围内时可以有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。在一些实施方式中，色原的量可以在0.1-40mmol/L，优选0.3-20mmol/L的范围内。在一些实施方式中，胆固醇酯酶的量为0.5-8.0KU/L，优选1-5KU/L。当采用具有上述优选范围内的各组分时，可以更有效地降低羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺对总胆固醇测定所造成的干扰。

在一些实施方式中，在根据本发明的方法和用途中，使用本文中所述的试剂盒。

发明人惊奇地发现，与使用其他色原的现有技术相比，当使用特定用量的DAOS或含DAOS的色原来检测总胆固醇时，能够降低羟苯磺酸钙和酚磺乙胺对总胆固醇检测的干扰。尤其是当DAOS量可以在0.3-20mmol/L的范围内时，羟苯磺酸钙和酚磺乙胺的干扰得到明显降低。

本发明包括但不限于如下的实施方式：

实施方式1.一种总胆固醇测定试剂盒，其包含试剂组1和试剂组2，所述试剂组1包含色原和胆固醇酯酶，所述试剂组2包含4-氨基安替比林、过氧化物酶和胆固醇氧化酶，其中，所述色原是或者包含N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，其中所述色原的量为0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L。

实施方式2.根据实施方式1所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述4-氨基安替比林的量为0.1-2.0g/L，优选0.2-1.5g/L。

实施方式3.根据实施方式1或2所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述胆固醇酯酶的量为0.5-8.0KU/L，优选1-5KU/L。

实施方式4.根据前述实施方式中任一项所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述过氧化物酶的量为0.5-12KU/L，优选1-10KU/L。

实施方式5.根据前述实施方式中任一项所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述试剂组1还可以包含抗坏血酸氧化酶，并且所述抗坏血酸氧化酶的量在0.1-10KU/L，优选0.5-5KU/L的范围内。

实施方式6.一种使用前述实施方式中任一项所述的试剂盒检测样品中的总胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤：

(c)根据下式计算总胆固醇浓度，

样品中总胆固醇浓度＝(A2_U-A1_U)/(A2_C-A1_C)*C_C

式中，A2_U和A1_U分别表示样品的吸光度A2和A1；A2_C和A1_C分别表示校准品的吸光度A2和A1；C_C表示校准品的浓度。

实施方式7.N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于降低在利用酶法进行的总胆固醇检测中由样品中存在的羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺所造成的干扰的用途，其中所述色原的量为0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L。

实施方式8.N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于制备抗羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺干扰的总胆固醇测定试剂盒的用途，其中所述色原的量为0.2-24mmol/L，优选0.3-20mmol/L。

实施方式9.根据实施方式7或8所述的用途，其中使用根据实施方式1-5中任意一项所述的总胆固醇测定试剂盒来检测总胆固醇。

实施方式10.根据实施方式7-9中任一项所述的用途，其中使用所述组合物测得的样品中的总胆固醇值与对对照样品测得的总胆固醇值相比偏差小于10％，优选小于8％，更优选小于5.5％，最优选小于4％，其中所述对照样品为除不含羟苯磺酸钙和酚磺乙胺之外，其他均与所述样品相同的样品。

在本发明中，对于一个方面所描述的特征、实施方案、优选实施方案同样适用于本发明的其他方面。

在本发明的一些实施方案中，组合物、试剂组、试剂盒以及方法用“包含”或“包括”描述。但本领域技术人员可以理解，所述组合物、试剂组、试剂盒以及方法也可以由基本上由相应化合物、试剂或步骤组成或由相应化合物、试剂或步骤组成。

除了与本发明的目的明显不相容的情况外，本发明的描述应理解为包括本发明的各种实施方式或要素的组合，以及它们的替代方式的组合。

具体实施方式

现将描述实施本发明的一些方面的一些说明性且非限制性的实施例以及对比例。

实验材料

使用下表1中所示的材料来制备试剂组1和2。

表1：

对比例1：胆固醇测定试剂盒的配制

根据下表2和下表3中所示的组分和浓度，将各组分混合以分别制备试剂组1和2。

表2：R1配制

表3：R2配制

对比例2：胆固醇测定试剂盒的配制

根据下表4和下表5中所示的组分和浓度，将各组分混合以分别制备试剂组1和2。

表4：R1配制

表5：R2配制

实施例1：胆固醇测定试剂盒的配制

根据下表6和下表7中所示的组分和浓度，将各组分混合以分别制备试剂组1和2。

表6：R1配制

表7：R2配制

实施例2：胆固醇测定试剂盒的配制

根据下表8和下表9中所示的组分和浓度，将各组分混合以分别制备试剂组1和2。

表8：R1配制

表9：R2配制

实施例3：胆固醇测定试剂盒的配制

根据下表10和下表11中所示的组分和浓度，将各组分混合以分别制备试剂组1和2。

表10：R1配制

表11：R2配制

实施例4：胆固醇测定试剂盒检测方法

1.仪器

具有波长为600nm的全自动生化分析仪或半自动生化分析仪。

2.参数设置及操作

方法：终点法样本/试剂：1/100 主波长：600nm

反应温度：37℃ 反应时间：10min 副波长：700nm

样本测定具体操作方法如表12所示。

表12

单位：微升(μL)

3.计算公式

ΔA＝A₂-A₁

样本中胆固醇含量

式中：

ΔA_U――测定样本吸光度变化值；

ΔA_C――校准品吸光度变化值；

C_C――校准品浓度。

实施例5：胆固醇测定试剂盒抗药物干扰实验

1.基础血清准备：收集健康体检人员无溶血、无脂浊、无黄疸的新鲜混合血清。

2.干扰样本配制：

1)将羟苯磺酸钙水溶液与基础血清按1:9比例配制成药物浓度为100mg/L的干扰样本；对照样本为生理盐水与基础血清按1:9比例配制；不同药物浓度干扰样本由100mg/L羟苯磺酸钙药物干扰样本与对照样本不同比例配制而得；

2)将酚磺乙胺水溶液与基础血清按1:9比例配制成药物浓度为250mg/L的干扰样本；对照样本为生理盐水与基础血清按1:9比例配制；不同药物浓度干扰样本由250mg/L酚磺乙胺药物干扰样本与对照样本不同比例配制而得。

3.胆固醇测定试剂盒经校准后测定干扰样本，以对照样本±10％偏差为干扰判断标准，考察试剂盒抗药物干扰能力。

结果如下表13和14所示。

表13：不同的羟苯磺酸钙浓度对各对比例和实施例的效果的影响

表14：不同的酚磺乙胺浓度对各对比例和实施例的效果的影响

从以上结果可以看出，羟苯磺酸钙100mg/L、酚磺乙胺250mg/L对本发明胆固醇测定试剂盒测定结果无影响。

实施例6：实施例1-3胆固醇测定试剂盒其他性能评价

1.准确度验证：

测定朗道质控品(HN1530，批号:918UN；HE1532，批号:697UE)，重复测定3次，计算测定值与靶值偏差，并看结果是否在质控范围内。

表15：朗道质控品(HN1530)

表16：朗道质控品(HN1532)

从以上结果可以看出，根据本发明的试剂盒得到的测定结果的平均值位于质控范围内，与靶值偏差＜5％，说明本发明试剂盒准确性好。

2.重复性实验：

以常规临床样本作为待测样品，用本发明实施例1-3试剂盒重复测定10次，计算变异系数CV％，结果如下表17所示。

表17：变异系数测试

由以上结果可见，本发明试剂盒变异系数CV为0.85％、1.04％、0.92％，均明显＜4％，符合YY/T 1206-2013《总胆固醇测定试剂盒(氧化酶法)》标准要求。以上结果说明：根据本发明的试剂盒具有非常好的重复性。

3.线性范围检测：

取总胆固醇浓度13.00mmol/L左右的样本，稀释成6个不同的浓度(xi)，用本发明试剂盒按照检测方法每个浓度测定3次，计算平均值(yi)。以xi为自变量，以yi为因变量求出线性回归方程，计算线性回归相关系数r；将xi代入线性回归方程，计算yi的估算值yi'及yi与估算值yi'的偏差。结果示于下表18中。

表18：实施例1-3的线性范围检测

从以上结果可以看出，本发明的试剂盒具有非常优异的线性，实施例1-3分别获得了0.9999、0.9998和0.9997的线性相关系数r。中国医药行业标准YY/T 1206-2013《总胆固醇测定试剂盒(氧化酶法)》中要求线性相关系数r不小于0.9900。以上结果说明：根据本发明的试剂盒的线性区间完全满足临床需求。

Claims

1.一种总胆固醇测定试剂盒，其包含试剂组1和试剂组2，所述试剂组1包含色原和胆固醇酯酶，所述试剂组2包含4-氨基安替比林、过氧化物酶和胆固醇氧化酶，其中，所述色原是或者包含N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，其中所述色原的量为0.3-20mmol/L。

2.根据权利要求1所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述4-氨基安替比林的量为0.2-1.5g/L。

3.根据权利要求1或2所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述胆固醇酯酶的量为0.5-8.0KU/L，优选1-5KU/L。

4.根据前述权利要求中任一项所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述过氧化物酶的量为0.5-12KU/L，优选1-10KU/L。

5.根据前述权利要求中任一项所述的总胆固醇测定试剂盒，其中所述试剂组1还可以包含抗坏血酸氧化酶，并且所述抗坏血酸氧化酶的量在0.1-10KU/L，优选0.5-5KU/L的范围内。

6.一种使用前述权利要求中任一项所述的试剂盒检测样品中的总胆固醇的方法，所述方法包括以下步骤：

(c)根据下式计算总胆固醇浓度，

样品中总胆固醇浓度＝(A2_U-A1_U)/(A2_C-A1_C)*C_C

7.N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于降低在利用酶法进行的总胆固醇检测中由样品中存在的羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺所造成的干扰的用途，其中所述色原的量为0.3-20mmol/L。

8.N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于制备抗羟苯磺酸钙和/或酚磺乙胺干扰的总胆固醇测定试剂盒的用途，其中所述色原的量为0.3-20mmol/L。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其中使用根据权利要求1-5中任意一项所述的总胆固醇测定试剂盒来检测总胆固醇。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的用途，其中使用所述组合物测得的样品中的总胆固醇值与对对照样品测得的总胆固醇值相比偏差小于10％，优选小于8％，更优选小于5.5％，最优选小于4％，其中所述对照样品为除不含羟苯磺酸钙和酚磺乙胺之外，其他均与所述样品相同的样品。