JP5129572B2 - 生体試料中の２項目の測定対象物の同時分別定量方法 - Google Patents
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Description
病態解析、診断、予後の判定等に臨床検査が用いられる。患者の状態を正しく確認するために臨床検査の重要性は増しており、その測定項目の種類および検体数については増加の一途をたどっている。一方で国民総医療費の増加は大きな社会問題となっており、削減が強く望まれている。臨床検査の多くは自動分析装置を用いて測定されるが、迅速、簡便な測定や、少ない検体量による多項目の測定のための方法や試薬の開発が切望されている。そのような試薬が提供されることにより、多くの人が必要な臨床検査を必要なときに受けることができるようになり、より正確な治療、予防の措置が図れるようになるからである。例えば、血液中のコレステロールについて、迅速、簡便により多くの項目を測定することが望まれている。
コレステロールの増加は血管内皮における動脈硬化を発症、進展させ、冠動脈疾患におけるリスクを増大するものとして古くから測定されてきた。また、トリグリセリドは従来から糖尿病や食後高脂血症のマーカーとして用いられてきており、最近ではメタボリックシンドロームの危険因子の一つとして再注目されてきている。
これら脂質成分は血中ではリポ蛋白質の形で存在しており、リポ蛋白にはカイロミクロン（CM）、超低比重リポ蛋白（VLDL）、LDL、HDLなどが存在する。LDLの増加は動脈硬化性疾患を引き起こし、HDLはこれを抑制する働きがある。
HDLの測定について現在は分画操作を要しないHDLコレステロール測定法が報告されており広く普及している。LDLコレステロールの測定はFriedewald式による演算方法が広く使われてきたが、近年は分画操作を要しない測定法が報告されている（特許文献１参照）。また、HDLおよびLDL中のトリグリセリドを分別測定する方法が報告されている。しかし、現状では総コレステロールおよびHDLコレステロールの測定は広く行われているものの、LDLコレステロールは未だに計算式で求められる方法が主流であり、分画操作を要しない測定法は普及するには至っていない。
一方、１回の測定で２種類のコレステロールを連続して分別測定する方法が報告されている（特許文献１および２参照）。しかし、これらの方法では、２種類のコレステロールを測定するのに３種類の試薬を用いて、３つの工程で測定を行っているために、適用できる機種が限定される。また２試薬のみでコレステロールを２種類連続して分別測定する方法が報告されている（特許文献４および５を参照）。この方法は、第１工程と第２工程でそれぞれ異なるコレステロールを反応させ、吸光度を測定するものである。しかし、この方法では使用時の液状試薬の状態において第１試薬にキノン色素を生成する要素が揃っているため、試薬が空気酸化を受け、自然発色してしまうという問題があり、液状試薬としての安定性に欠けていると考えられた。
特開平11-318496号公報
特表2003-501630号公報
特開2001-124780号公報
WO04/055204号国際公開パンフレット
WO00/17388号国際公開パンフレット
本発明の目的は、第１工程および第２工程からなる２つの工程にそれぞれ１種類の試薬を用いて、１回の測定で２項目の測定対象物を一度に同時定量する分別定量方法を提供することである。２項目の測定対象物として、例えばLDLコレステロールと総コレステロールのような性質の異なる２種類のリポ蛋白成分が挙げられる。本発明は、さらに２項目の測定対象物を一度に同時に分別定量する試薬において、自然発色を抑制した安定化方法を提供することである。
本発明者等はコレステロール、トリグリセリド等の測定において、血中のこれら成分の総量、LDLおよびHDL中に含まれるこれら成分量等のうち２項目を同時に定量する方法について鋭意検討し、液状状態でも長期安定な定量方法を発明するに至った。
具体的な定量法としては、先の２試薬のみを用いた同時測定方法（WO04/055204)では第１工程で反応から検出までを行っていたが、第１工程で起こる反応を第２工程の初期に検出できるようにし、その後にもう一方の測定対象を検出できるようにしたものである。
図１に本発明における同時分別定量の原理を示す。図１に示すように本発明の方法は２工程からなる。第１工程において、試料と第１試薬を混合することにより第１の測定対象物の反応が生じ反応生成物ができる。該反応生成物を第２工程の初期に検出する（測定１）。第２工程においては、第２試薬の添加によりさらに第２の測定対象物の反応が生じ反応生成物ができる。測定２においては、第１工程における反応生成物と第２工程における反応生成物の両方を検出する（測定２）。測定対象物が特定のリポ蛋白成分（例えばHDLコレステロールとLDLコレステロール）の２項目である場合、第１工程においては、第１の測定対象物に基づく反応により過酸化水素が生じ、第２工程においては第１工程で生じた過酸化水素による反応液の吸光度変化があり、その後第２の測定対象物に基づく反応が生じ該反応による反応液の吸光度変化が測定される。第２工程の全体の吸光度変化量は第１の測定対象物と第２の測定対象物の和に対応し、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量は第２の測定対象物に対応する。この吸光度変化を自動分析装置により測定する際の分析条件を変えることにより、一度の測定で同時に２つの測定値を得ることができ、２項目の測定対象物を一度に定量することができる。測定対象が特定のリポ蛋白中の脂質成分１項目と脂質成分の総量（例えばLDLコレステロールと総コレステロール）である場合、第１工程においては特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白（例えば、CM、VLDL、HDL中のコレステロール）に基づく反応により過酸化水素が生じ、第２工程においては第１工程で生じた過酸化水素による反応液の吸光度変化があり、その後特定のリポ蛋白（例えば、LDL中のコレステロール）に基づく反応が生じ該反応による反応液の吸光度変化が測定される。反応全体の吸光度変化量は脂質成分の総量に対応し、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量は特定のリポ蛋白（例えば、LDL中のコレステロール）に対応する。
従来の同時分別定量法では測定の第１工程で用いられる第１試薬にキノン色素生成に関わる複数の試薬組成物が集約されていた。一方、本発明の方法においては、キノン色素の生成が第２工程のみで生じるので、キノン色素の生成に関わる複数の試薬組成物を第１工程で用いる第１試薬と第２工程で用いる第２試薬へ分離することが可能となり、試薬の空気酸化による自然発色を抑えることが可能となった。試薬の自然発色を抑えることが可能となったことにより、試薬の安定化が可能となり、かつ安定に測定対象物を測定できるようになった。
本発明の方法を種々の測定条件を設定できる自動分析装置を用いて行う場合の自動分析装置の多項目分析における１つの測定条件は、第２工程における総吸光度変化量により、総コレステロールのような特定の脂質成分の総量またはLDLコレステロールとHDLコレステロールの和のような２つの測定対象の和にあたる定量を行うというものである。また、もう１つの測定条件は第２工程において第２試薬添加後の２点（第２試薬添加直後の急激な吸光度変化の後と反応最終点）間の吸光度変化量により、一方の測定対象の定量を行うというものである。第２工程における総吸光度変化量により２つの測定対象の和にあたる測定値を算出した場合には、第２試薬添加後の２点間の吸光度変化量により求められた一方の測定対象の測定値を差し引くことにより、他方の測定対象の測定値を求めることができる。
さらに、本発明の方法により、測定対象物を限定せずに、被検体試料中に存在する２項目の測定対象物を一度に定量することができる。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の測定対象物を一度に定量する方法であって、第１の測定対象物に係る反応生成物を第２工程の初期に検出し、その後に第２の測定対象に係る反応生成物を検出することを特徴とする２項目の測定対象物を一度に定量する方法。
[２] ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の測定対象物を一度に定量する方法であって、第１の測定対象物は、第１の試薬に含まれる試薬組成物と反応して第１の反応中間物を生成し第２の測定対象物は第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して第２の反応中間物を生成し、さらに該第１の反応中間物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して光学的に測定可能な第１の反応生成物を生成し前記第２の反応中間物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して光学的に測定可能な第２の反応生成物を生成し、前記方法は被検体試料中に第１の試薬を添加して第１の測定対象物を処理し前記第１の反応中間物を生成させる第１の工程および第２の試薬を添加して第１の工程で得られた前記第１の反応中間物から第１の反応生成物を生成させるとともに第２の測定対象物を処理し生成した第２の反応中間物から第２の反応生成物を生成させる第２工程からなり、第１工程においては第１の反応生成物の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来の第１の反応生成物を測定し、第２の測定で第２の測定対象物由来の第２の反応生成物または第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物の両方を測定することにより、生成した第１および第２の反応生成物の量から２項目の測定対象物を一度に定量する[１]の方法。
[３] 第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物が同じ吸光波長を有する[１]または[２]の方法。
[４] 第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物が同じ物質である[３]の方法。
[５] さらに、第１の反応中間物および第２の反応中間物が同じ物質である[１]〜[４]のいずれかの方法。
[６] 第１の測定対象物および第２の測定対象物が被検体試料中の脂質成分、クレアチニン、尿酸、グルコース、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）（アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT））、ガンマ・グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ-GTP）、乳酸脱水素酵素（LDH）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、クレアチンフォスホキナーゼ（CPK）およびアミラーゼ（AMY）からなる群から選択される、[１]〜[５]のいずれかの方法。
[７] 第１の測定対象物および第２の測定対象物が被検体試料中の脂質成分である、[６]の方法。
[８] 脂質成分がリポ蛋白質中のコレステロールまたはトリグリセリド成分である[７]の方法。
[９] 第１および第２の測定対象物からの第１および第２の反応生成物の生成および第１および第２の反応中間物からの第１および第２の反応生成物の生成が酸化還元反応により起こる[１]〜[８]のいずれかの方法。
[１０] ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の脂質成分を一度に定量する方法であって、生体試料中の第１の測定対象物を処理し、過酸化水素を生成させる第１工程および第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化させるとともに第２の測定対象物を処理し発生した過酸化水素をキノン色素に転化させる第２工程からなり、第１工程においてはキノン色素の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来のキノン色素を測定し、第２の測定で第１の測定対象物および第２の測定対象物由来のキノン色素を測定することにより生成したキノン色素の量から２項目の測定対象物を一度に定量する、[１]〜[９]のいずれかの方法。
[１１] キノン色素生成に関わる試薬組成物が４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼからなり、第１工程で４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれか一つが添加され、第２工程では第１工程で添加されなかった試薬組成物が添加される、[１０]の方法。
[１２] 上記脂質成分の測定が、リポ蛋白質中のコレステロールまたはトリグリセリド成分の測定系である[１０]または[１１]の方法。
[１３] 上記脂質成分がコレステロールの場合、２項目の測定対象物が血中総コレステロールと低密度リポ蛋白（以下LDL）コレステロール、総コレステロールと高密度リポ蛋白（以下HDL）コレステロール、またはLDLコレステロールとHDLコレステロールである[１０]〜[１２]のいずれかの方法。
[１４] 上記脂質成分がトリグリセリドの場合、２項目の測定対象物が血中総トリグリセリドとLDLトリグリセリド、総トリグリセリドとHDLトリグリセリド、またはLDLトリグリセリドとHDLトリグリセリドである[１０]〜[１２]のいずれかの方法。
[１５] ２項目の測定対象物が総脂質成分とHDLまたはLDL中の脂質成分の場合、HDLまたはLDL以外のリポ蛋白にのみ作用する酵素および界面活性剤を含む試薬の存在下で過酸化水素を発生させる第１工程と、ついで第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化する反応とHDLまたはLDLのみに反応する試薬の存在下で過酸化水素を発生させ、キノン色素に転化する第２工程からなる[１０]〜[１４]のいずれかの方法。
[１６] ２項目の測定対象物がHDLおよびLDL中の脂質成分の場合、HDLにのみ作用する特定の酵素および界面活性剤を含む試薬の存在下で過酸化水素を発生させる第１工程と、ついで第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化する反応とLDLのみに反応する試薬の存在下で過酸化水素を発生させ、キノン色素に転化する第２工程からなる[１０]〜[１４]の方法。
[１７] 第２工程における吸光度の変化が、第２試薬の添加直後の急激な増加と、その後の緩やかな増加の２相性の増加を示し、後者の緩やかな吸光度変化量より一方の測定対象の定量を行う[１]〜[１６]のいずれかの方法。
[１８] 第２工程の全体の吸光度変化量より総コレステロールの定量を行う[１]〜[１７]のいずれかの方法。
[１９] 臨床生化学自動分析装置を用い、１回の測定で異なる測定条件で分析を行う[１]〜[１８]のいずれかの方法。
[２０] 第1工程および第２工程においてそれぞれ液状状態の試薬１種類を添加する、[１]〜[１９]のいずれかの方法。
[２１] [１]〜[２０]のいずれかの方法において、液状試薬を安定化させる方法であって、第１工程で添加される第１試薬にキノン色素生成に関わる試薬組成物である４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかが含まれ、第２試薬には４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものが含まれる、液状試薬を安定化させる方法。
[２２] ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の脂質成分を一度に定量する方法であって、生体試料中の第１の測定対象物を処理し、過酸化水素を生成させる第１工程および第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化させるとともに第２の測定対象物を処理し発生した過酸化水素をキノン色素に転化させる第２工程からなり、第１工程においてはキノン色素の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来のキノン色素を測定し、第２の測定で第１の測定対象物および第２の測定対象物由来のキノン色素を測定することにより生成したキノン色素の量から２項目の測定対象物を一度に定量する方法を行うためのキットであって、第１試薬にキノン色素生成に関わる試薬組成物である４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかが含まれ、第２試薬には４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものが含まれる、キット。
[２３] さらに、第１試薬に第１の測定対象物に作用する界面活性剤および酵素が含まれ、第２試薬に少なくとも第２の測定対象物に作用する界面活性剤が含まれる[２２]のキット。
本発明の方法において一度の測定で異なる２項目の同時定量が可能となる。さらに、用いる試薬は空気酸化による自然発色をすることなく、液体状態で安定に保つことが可能となる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-288689号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本発明は被検体試料である生体試料中の２項目の測定対象物を一度の測定で同時定量する方法である。測定対象物は限定されないが、コレステロール、トリグリセリド等の脂質成分、クレアチニン、尿酸、グルコース、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）（アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT））、ガンマ・グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ-GTP）、乳酸脱水素酵素（LDH）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、クレアチンフォスホキナーゼ（CPK）、アミラーゼ（AMY）等が挙げられる。コレステロール、トリグリセリドとしてはリポ蛋白中のものが挙げられる。生体試料としては、HDL、LDL、VLDL及びCM等のリポ蛋白、クレアチニン、尿酸、グルコース、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）（アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT））、ガンマ・グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ-GTP）、乳酸脱水素酵素（LDH）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、クレアチンフォスホキナーゼ（CPK）、アミラーゼ（AMY）等を含むかもしれない試料であり、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
本発明の方法において、第１の測定対象物および第２の測定対象物を出発物質として反応を行わせ、それぞれ特定の波長に吸光を有する反応生成物を生成させ、該反応生成物の吸光度を測定する。この際、第１の測定対象物から特定の波長に吸光を有する反応生成物の生成は反応中間物を経て少なくとも２ステップの反応により反応生成物が生成する。２ステップの反応は異なる試薬組成物により進行する。第２の測定対象物から特定の波長に吸光を有する反応生成物の生成反応は反応中間物を経ない１ステップの反応でも、反応中間物を経る少なくとも２ステップの反応でもよい。本発明の方法は２種類の試薬を用い、２工程で行われる。ここで、反応中間物とは測定対象物自体が変化して生じる物質でも、測定対象物と試薬組成物との反応により生成する物質でもよい。本発明において、「試薬」とは、試薬組成物が含まれているものをいい、「試薬組成物」とは、試薬を構成している界面活性剤や酵素などの物質をいう。第１工程では、第１の試薬により第１の測定対象物から反応中間物が生成する。次いで、第２工程では第２の試薬により第１の測定対象物由来の反応中間物から特定の波長に吸光を有する第１の測定対象物由来の反応生成物が生成し、さらに第２の測定対象物から特定の波長に吸光を有する第２の測定対象物由来の反応生成物が生成する。第２の測定対象物から第２の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応が反応中間物を経ない場合、第２工程において、第１の測定対象物由来の反応中間物から第１の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応と第２の測定対象物から第２の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応はほぼ同時に進行し、第１の測定対象物由来の反応生成物と第２の測定対象物由来の反応生成物はほぼ同時に生成する。この場合、第１の測定対象物と第２の測定対象物を一度に分別定量するためには、第１の測定対象物由来の反応生成物と、第２の測定対象物由来の反応生成物の吸光波長は異なっている必要がある。すなわち、第２工程において第１の測定（測定１）と第２の測定（測定２）は異なる波長の光を用いて行われ、測定１および測定２ともに第２工程の最後に行われる。一方、第２の測定対象物から第２の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応が反応中間物を経る場合、第２工程において第１の測定対象物由来の反応中間物から第１の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応が第２の測定対象物から第２の測定対象物由来の反応生成物が生成する反応よりも先に進み、第１の測定対象物由来の反応生成物の生成が第２の測定対象物由来の反応生成物の生成に先んじる。この場合、第１の測定対象物由来の反応生成物と、第２の測定対象物由来の反応生成物の吸光波長は異なっていても同じでもよく、第２工程において第１の測定（測定１）が第２の測定（測定２）に先んじて行われる。本発明の方法において、好ましくは第１の測定（測定１）が第２の測定（測定２）に先んじて行われる条件で定量を行う。
例えば、本発明の方法において第１の測定対象物→（反応A）→第１の反応中間物→（反応B）→第１の反応生成物および第２の測定対象物→（反応C）→第２の反応中間物→（反応D）→第２の反応生成物という一連の反応を利用する。ここで、矢印は化学反応を示し、各反応は例えば酵素を利用した酸化還元反応である。本発明の方法においては、一例として反応A、B、CおよびDの４種類の化学反応が起こり、反応Aと反応Cは同じ反応でもよく、反応Bと反応Dは同じ反応でもよい。ここで、同じ反応とは、同じ試薬により同じ化学原理で起こる反応をいう。また、反応A、B、CおよびDは複数の反応ステップを含んでいてもよく、この場合、上記の第１の測定対象物→第１の反応中間物→第１の反応生成物および第２の測定対象物→第２の反応中間物→第２の反応生成物の矢印で表される反応ステップにおいて、さらに他の反応中間物が生成し得る。本発明の方法においては、２工程のうち、第１工程で第１の反応中間物が生じるのに対し第２の測定対象物は反応を起こさず、第２工程で第１の反応中間物から第１の反応生成物が生成しかつ第２の測定対象物から第２の反応中間物を経て第２の反応生成物が生成する。この際、第１の反応中間物から第１の反応生成物が生成する速度よりも、第２の測定対象物から第２の反応生成物が生成する速度が遅いことを要件とする。典型的には第１の反応中間物から第１の反応生成物が生成する反応の反応ステップより第２の測定対象物から第２の反応生成物が生成する反応の反応ステップの数が多いことが望ましい。ある物質から他の物質が生成する反応速度は反応の種類によって異なり、反応条件を変えることにより、反応速度を調節することができる。しかしながら、第１の反応中間物→第１の反応生成物および第２の測定物質→第２の反応生成物という２つの反応において、第２の測定対象物→第２の反応生成物という反応が反応中間物を経ない場合、第２の測定対象物→第２の反応生成物という反応の速度を第１の反応中間物→第１の反応生成物という反応の速度よりも常に遅くなるように調節することは必ずしも容易ではない。この場合、第２の測定対象物→第２の反応生成物という反応を第２の反応中間物を経る２ステップの反応により進行させれば、第２の測定対象物→第２の反応生成物という反応の速度を第１の反応中間物→第１の反応生成物という反応の速度より遅くなるように調節するのは容易である。例えば、全ての化学反応がほぼ同一の速度になるように、各反応の試薬成分濃度等を調節すれば、反応全体の速度は単純に反応全体の反応ステップ数に依存する。従って、上記の要件を満たしている限り第１の反応中間物および第２の反応中間物以外の反応中間物が存在していてもいなくてもよい。また、第１の反応中間物と第２の反応中間物は同じ物質であってもよく、第１の反応生成物と第２の反応生成物は同じ物質であってもよい。本発明の方法は２種類の試薬を用い、２工程で行われる。１つの工程とは、１種類の試薬を添加して一連の反応が進む工程をいい、第１工程は第１の試薬を添加し第２の試薬を添加するまでをいい、第２工程は第２の試薬を添加し、定量が終了するまでをいう。本発明の方法において、第１工程で第１の測定対象物が第１の試薬に含まれる試薬組成物と反応し第１の反応中間物が生成する。次いで第２工程で第１の反応中間物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応し第１の反応生成物が生成し第２の測定対象物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応し第２の反応中間物を経て第２の反応生成物が生成する。なお、第１測定対象物→第１反応中間物という反応と第２測定対象物→第２反応中間物という反応が同じ原理で進行する場合、少なくとも第１試薬にその反応のための試薬組成物が含まれる。
第１工程では第１の測定対象物→（反応A）→第１の反応中間物という反応のみが起こり、第２工程では、第１の反応中間物→（反応B）→第１の反応生成物という反応、第２の測定対象物→（反応C）→第２の反応中間物という反応および第２の反応中間物→（反応D）→第２の反応生成物という反応が起こる。第２工程において、第１の反応生成物および第２の反応生成物が測定される。測定は、第１の反応生成物および第２の反応生成物に特異的な吸光波長の光を用いて光学的に行うことができる。この際、第１の反応生成物と第２の反応生成物の吸光波長が同じであるならば、第１の反応生成物と第２の反応生成物を同じ波長の光を用いて測定することができる。
第２工程において、第２試薬を添加した場合、最初に第１の反応中間物→（反応B）→第１の反応生成物という反応が進み、その時点で第１の測定（測定１）を行う。測定１により第１の測定対象物由来の第１の反応生成物が測定され、第１の測定対象物が定量できる。第２工程では、第１の反応中間物→（反応B）→第１の反応生成物という反応に遅れて、第２の反応中間物→（反応D）→第２の反応生成物という反応が起こる。第２工程の最後に第２の測定（測定２）を行う。測定２により第２の測定対象物が定量できる。この際、第１の反応生成物および第２の反応生成物が同じ物質である場合のように同じ吸光波長を有する場合、測定２の測定値には、測定１の測定値が上乗せされる。この場合、第２の測定で第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物の両方を測定することになり、測定２の測定値から測定１の測定値を減じることにより、第２の測定対象物を定量することができる。従って、第２工程において第１の測定対象物と第２の測定対象物を一度に分別して定量することができる。
２項目を一度に定量するとは、２項目の測定値を一度の測定で得ることをいい、この場合の「一度の測定」とは、生体試料を測定に供してから必要な複数の測定値を得るまでの連続的な一連の処理を含む。一度の測定の間には複数回の試薬の添加や測定値の獲得が含まれるが、遠心分離等による分離操作や複合体形成による分離操作は含まれない。好適には単独の測定用チューブまたはウェル中で一度に測定が完了する。例えば、本発明の原理を示す図１において、第２工程で測定１および測定２の２回の測定が行われるが、本発明においては、この２回の測定を一度の測定という。測定１および測定２の一度の測定により、２項目の測定対象物を一度に定量することができる。
以下、主に測定対象物がリポ蛋白質中のコレステロールまたはトリグリセリド成分等の脂質成分である場合を例にとって、本発明の方法を具体的に説明する。当業者ならば、以下の脂質成分の測定についての説明から他の測定対象物を測定する場合に用いる試薬および測定波長等を適宜設定することができる。
本発明は被検体試料である生体試料中の特定脂質成分中における異なる２項目をリポ蛋白の処理により生じた色素の吸光度を指標に一度の測定で定量する、生体試料の異なる２項目を同時に測定する方法である。さらに本発明は、試薬が空気酸化により自然に発色するのを防止して、試薬または試薬組成物の安定性を高め、かつ試薬を長期間置いても安定した結果が得られる方法である。本発明の方法においては、生体試料中のリポ蛋白を処理し過酸化水素を発生させ、次いで該過酸化水素をキノン色素に転化し、キノン色素の吸光度を測定することにより生体試料中のリポ蛋白に含まれる成分濃度を測定する。本発明の方法は、生体試料中の測定対象となる特定のリポ蛋白（第１の測定対象物）を処理し、過酸化水素を生成させる第１工程と、第１工程で得られた過酸化水素（第１の反応中間物）をキノン色素（第１の反応生成物）に転化させるとともに、他の測定対象となるリポ蛋白（第２の測定対象物）を処理し、過酸化水素（第２の反応中間物）を生成させ、該過酸化水素をキノン色素（第２の反応生成物）に転化させる第２工程からなる。すなわち、本発明の方法において、２種類の測定対象物を別々の工程で処理し、該処理によって生成した過酸化水素のキノン色素への転化および生成されたキノン色素の検出を一つの工程で行う。この場合、第１の反応中間物と第２の反応中間物は同一物質であり、第１の反応生成物と第２の反応生成物は同一物質である。
「脂質成分」とはリポ蛋白の構成要素となっているコレステロールやトリグリセリドをいう。
測定対象物が２種類のリポ蛋白からなる脂質成分の２項目である場合、第１工程においては、第１の測定対象物に基づく反応により過酸化水素が生じ、第２工程においては第１工程で生じた過酸化水素による反応液の吸光度変化があり、その後第２の測定対象物に基づく反応が生じ該反応による反応液の吸光度変化が測定される。第２工程の全体の吸光度変化量は第１の測定対象物と第２の測定対象物の和に対応し、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量は第２の測定対象物に対応する。この吸光度変化を自動分析装置により測定する際の分析条件を変えることにより、一度の測定で同時に２つの測定をすることができる。第１の測定対象物の測定値は第２工程の全体の吸光度変化量から求められる測定値から、第２試薬添加後の２点間の吸光度変化量により求められた一方の測定対象の測定値を差し引くことにより求めることができる。測定対象物が特定のリポ蛋白中の脂質成分１項目と脂質成分の総量である場合、第１工程においては特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白に基づく反応により過酸化水素が生じ、第２工程においては第１工程で生じた過酸化水素による反応液の吸光度変化があり、その後特定のリポ蛋白に基づく反応が生じ該反応による反応液の吸光度変化が測定される。第２工程の全体の吸光度変化量は脂質成分の総量に対応し、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量は特定のリポ蛋白に対応する。
ここで、リポ蛋白の処理とは、リポ蛋白を界面活性剤やその他の添加剤および酵素で処理することをいう。リポ蛋白を界面活性剤で処理するとリポ蛋白中の脂質成分が遊離し、さらに酵素で処理すると過酸化水素が生成する。すなわち、リポ蛋白の処理は、リポ蛋白から脂質成分が遊離し、さらに過酸化水素が生成する一連の処理を含む。また、脂質成分の処理とは遊離したコレステロールまたはトリグリセリドを酵素で処理し過酸化水素を生成させることをいう。生成した過酸化水素を次いでペルオキシダーゼによりキノン色素に転化させる。
本発明では第１工程において、生体試料中の第１の測定対象物となるリポ蛋白あるいは第２工程で反応する特定のリポ蛋白（第２の測定対象物）以外のリポ蛋白に反応する試薬組成物の作用により、過酸化水素を生成させる。しかし、第１工程に用いる第１試薬にキノン色素生成に関わる試薬組成物のセットが含まれていないので、生成した過酸化水素がキノン色素に転化されることはない。第２工程においては、少なくとも第２の測定対象物となるリポ蛋白に反応する試薬組成物で処理し、該反応により新たに過酸化水素が発生する。第２工程において用いる第２試薬を測定系に添加したとき、キノン色素生成に関わる試薬組成物のセットが測定系中に含まれるようになり、第２の測定対象物となるリポ蛋白の処理と同時に、測定系に存在する第１工程において生じた過酸化水素をキノン色素に転化させる反応が生じる。第２工程が開始されるときに、第１工程で生成した第１の測定対象物中あるいは第２工程で反応する特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白の脂質成分から生成した過酸化水素が測定系中に存在しており、該過酸化水素は第２工程の開始と同時にキノン色素に転化される。一方、第２工程における第２の測定対象物の処理により生じた過酸化水素は、生成と同時にキノン色素に転化される。第２工程において、第２の測定対象物の処理により生成する過酸化水素は、脂質成分の酵素による処理が進むにつれ経時的に増加する。従って、第２工程の第２の測定対象物の処理により生じた過酸化水素はキノン色素に転化されるため、キノン色素も経時的に増加する。第２工程開始直後に生じたキノン色素による吸光度変化は、第１工程で生じた過酸化水素の量、すなわち第１の測定対象物中の脂質成分あるいは第２工程で反応する特定のリポ蛋白以外のリポ蛋白の存在量を反映し、第２工程が終了するときのキノン色素による全体の吸光度の変化は、第１工程で生じた過酸化水素の量の他に第２工程で生じた過酸化水素の量、すなわち第２の測定対象物中の脂質成分の存在量を反映する。言い換えれば、第２工程における全体の吸光度変化量が生体試料中の第１の測定対象物と第２の測定対象物中の脂質成分存在量の和または脂質成分の総量を反映した測定値となり、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量が第２の測定対象物中の脂質成分の存在量を反映した測定値となる。前記２つの吸光度変化量、すなわち第２工程における全体の吸光度変化量および第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量に基づいて生体試料中の特定脂質成分における異なる２項目の存在量を同時に測定することができる。第１の測定対象物の測定値は第２工程の全体の吸光度変化量から求められる測定値から、第２試薬添加後の２点間の吸光度変化量により求められた一方の測定対象の測定値を差し引くことにより求めることができる。本発明の方法において、第１工程と第２工程において、異なる試薬が用いられるが、２つの試薬の組成、主としてキノン色素生成に関わる試薬組成物の組分けを工夫することにより試薬自体の安定化が図られるとともに、コレステロールを測定する方法においても安定した結果が得られる。試薬組成物とは、特定の化学反応に関係する試薬および／または緩衝液等の化学反応を行わせるのに必要とされる試薬の組成物をいう。本発明の方法においては、液体で供給される液状試薬の安定化を図ることができる。試薬組成物の作用により生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物の存在下で有色キノン（キノン色素）を生成する。試薬中にペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物が混合した液体状態で存在している場合、過酸化水素が存在しなくても空気酸化の影響により経時的にキノン色素が生成し、試薬が自然発色してしまう。従って、脂質成分を測定するための試薬または試薬組成物の安定性を保つことができず、また測定安定性も保証できなくなる。本発明においては、２つの試薬の一方に、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物の全てを混在させず、最終的に測定系に２つの試薬を添加したときに初めてペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物のすべてが系に添加されるようにする。
本発明の方法の測定対象であるリポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（コレステロールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明細書において、単に、「コレステロール」という場合には、これらの両者を包含する。
「脂質成分の存在量に反映した測定値」とは、生体試料中のリポ蛋白中のコレステロールまたはトリグリセリドの濃度または絶対量を定量した場合に得られる値をいう。測定方法は限定されず、複数の測定を組み合わせて最終的に生体試料中のリポ蛋白中の脂質成分濃度または絶対量に応じた値、例えば比例または反比例した値が得られる場合、その値をいう。例えば、リポ蛋白のコレステロールを特定の薬剤で一連の処理をすることにより生じる化合物に起因する吸光度が測定値の一例として挙げられる。また、この場合の測定値は絶対量も変化量も含まれる。
例えば、図１で示される第２工程における吸光度変化は第１工程の処理により生じる過酸化水素をキノン色素に転化させることにより生じる吸光度に、第２工程の処理により生じる過酸化水素をキノン色素に転化させることにより生じる吸光度が上乗せされている。図１において第２工程の測定２と測定１の吸光度差から得られる吸光度変化量より第２の測定対象物中の脂質成分の存在量に反映した吸光度が得られる。また、第２工程の測定２において得られる総吸光度は、第１の測定対象物中に第２の測定対象物中の脂質成分の存在量に対応した吸光度が上乗せされた値または脂質成分の総量に対応した吸光度である。但し、実際には、正確な測定値を得るために、測定２で得られる吸光度から第２試薬を添加する前の吸光度を差し引いた値に基づいて算出する。
一度の測定で得られる２種類の測定値のうち、片方が生体試料中の特定脂質成分の総量（総コレステロールまたは総トリグリセリド）である場合には、第２工程の測定２において得られる総吸光度がこれらの存在量を反映した吸光度となる。
第１工程における処理は、特定のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、酵素反応により脂質成分を分解することにより行われる。該処理により生じた過酸化水素は第２工程まで消去、検出されること無く保持されている。界面活性剤が作用するとは、界面活性剤がリポ蛋白を分解しリポ蛋白中のコレステロールを遊離させることをいう。
（１）測定系がコレステロールの測定でLDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する場合
第１工程において、生体試料中のLDL以外のリポ蛋白に反応する界面活性剤およびコレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素で処理し、過酸化水素を生成させる。ここで「LDL以外のリポ蛋白」とは、HDL、VLDL、CM等をいう。
第１工程において、生体試料中のLDL以外のリポ蛋白に反応する界面活性剤およびコレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素で処理し、過酸化水素を生成させる。ここで「LDL以外のリポ蛋白」とは、HDL、VLDL、CM等をいう。
第２工程においては、少なくともLDLに反応する界面活性剤および酵素で処理し、該反応により新たに過酸化水素が発生する。第２工程における全体の吸光度変化量が生体試料中の総コレステロールの存在量を反映した測定値となり、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量がLDL中のコレステロールの存在量を反映した測定値となる。前記２つの吸光度変化量、すなわち第２工程における全体の吸光度変化量および第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量に基づいて生体試料中のLDL中のコレステロールと総コレステロールの存在量を同時に測定することができる。
LDL以外のリポ蛋白、すなわち、HDL、VLDL、CM等に含まれるコレステロールを選択的に反応させる具体的な方法としては以下のものを挙げることができる。
すなわち、LDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、過酸化水素を生じさせる。
第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は0.2〜2.0IU/mL程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。またコレステロールオキシダーゼ濃度は0.1〜0.7IU/mL程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。
第１工程で用いられるLDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、HLB値が13以上14以下、好ましくは13以上14以下であるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。なお界面活性剤のHLB値の算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載されている。
HLB値が13以上14以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でHLB値が13以上14以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
第１工程で用いられる界面活性剤として、例えばポリオキシエチレン誘導体で、HLB値は13.2であるエマルゲンB66（花王社製）が挙げられる。
第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃度は、0.1〜10g/L程度が好ましく、さらに好ましくは0.5〜5.0g/L程度である。
また、第１工程ではLDL以外のリポ蛋白に作用する試薬組成物として炭素数6〜32の1-オレフィンとマレイン酸、アクリル酸またはメタクリル酸の重合体、もしくはそれらの酸アミドまたはエステル類からなる高分子化合物の共存下において胆汁酸誘導体および／または両性界面活性剤を用いることができる。この場合、前記高分子化合物の分子量は5,000〜500,000ダルトンが好ましく、高分子化合物の濃度は0.001〜1％が好ましい。胆汁酸誘導体および両性界面活性剤の濃度は選択した界面活性剤の種類に応じて決められる。
第１工程は、pH５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グッドの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグッド緩衝液であるBis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES及びPOPSOが好ましく、緩衝液の濃度は10〜500mM程度が好ましい。
第１工程の反応温度は30〜40℃程度が適当であり、37℃が最も好ましい。また反応時間（第１試薬を添加してから、第２試薬を添加するまでの時間）は２から10分間程度でよく、５分間が好ましい。
本発明の方法では、第１工程をアルブミンの存在下で行うことが望ましい。アルブミンは、アルブミンであれば何ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを好適に用いることができる、特に脂肪酸フリーのものが好ましい。アルブミンの起源は何ら限定されるものではなく、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ等いずれの動物であっても良く、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度は0.1〜5.0g/dLが好ましく、0.3〜3.0g/dLがさらに好ましい。
以上のように、第１工程で用いられる第１試薬は、少なくとも界面活性剤、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが含まれる。該試薬は、さらに適当な緩衝液およびアルブミンおよび／または高分子化合物が含まれていてもよい。また、第１工程で用いられる試薬は、キノン色素生成に関与する試薬組成物の全てを含むことはなく、４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかを含む。また、第１工程で用いられる第１試薬は、ペルオキシダーゼを含まない。
第１工程では、生体試料中に存在していたLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの量に対応して過酸化水素が生じ、該過酸化水素は消失、検出されることなく第２工程に持ち越される。
続く第２工程では第１工程において処理したLDL以外のリポ蛋白中のコレステロールより生じた過酸化水素の定量と第１工程終了時に残存していたLDL中のコレステロールを処理し定量する。
LDL中のコレステロールの処理は、LDLを少なくともLDLに作用する界面活性剤で処理することにより行う。LDL中のコレステロールは該界面活性剤ならびにコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により過酸化水素を生成する。ここで、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは第１工程において用いられる第１試薬に含まれており第１工程において測定系に添加されたものを利用すればよい。また、第２工程に用いられる第２試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが含まれていてもよい。少なくともLDLに作用する界面活性剤は、LDLのみに選択的に作用する界面活性剤が好ましいが、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
LDLの測定値は第２試薬添加後の吸光度変化量より算出されるため、その反応速度、つまり使用される界面活性剤の反応強度が測定値における正確性を左右することになる。そのため適切な反応強度を持ち合わせた界面活性剤を選択することが好ましい。
LDLのみに選択的に作用するか、または全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、第１試薬で用いられていないポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
ポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等で第１試薬に用いられていない化合物を挙げることができる。第２工程で用いられるポリアルキレンオキサイド誘導体として、例えばポリオキシエチレンラウリルアルコールで、HLB値が13.3であるPolidocanol（Thesit）（ロッシュ・ダイアノスティックス社製）が挙げられる。また、前記ポリアルキレンオキサイド誘導体にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をさらに加えることができる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体はポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのランダム共重合体でもブロック重合体でも良い。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の分子量は2,750ダルトン以上が好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のHLBは1〜6が好ましい。第２工程で用いられるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の例としてはプルロニックL-121、プルロニックL-122、プルロニックL-101、プルロニックP-103、プルロニックF-108（いずれも旭電化社製）が挙げられる。
第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、0.1〜100g/L程度が好ましく、さらに好ましくは１〜50g/L程度である。
第２工程のその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。但し、本発明の方法の第２工程においては、第２工程開始直後に測定系に含まれていたLDL以外のリポ蛋白中のコレステロール由来の過酸化水素をキノン色素に転化させ、一方でLDL中のコレステロールは第２工程の進行と共に過酸化水素を生成し該過酸化水素をキノン色素に転化させる。LDL以外のリポ蛋白の処理により生成したキノン色素による吸光度の増加は第２試薬の添加と同時に開始し大きな速度で進み短時間で終結する。一方、第２試薬を添加後にLDLが処理され過酸化水素が生成し、次いでキノン色素が生成されるため、LDLの存在量を反映する吸光度は第２試薬の添加後少し時間をおいてから増加を始め、その増加速度も大きくない。すなわち第２工程における吸光度の増加は、第２工程開始直後の急激な増加と緩やかな増加の２相性を示す。最初の急激な増加がLDL以外のリポ蛋白の存在量を反映する増加であり後の緩やかな増加がLDLの存在量を反映する増加である。第２工程開始から終了までの反応において、横軸に時間をとり横軸にキノン色素の生成量を取り、全体の平均のキノン色素の生成速度をtとした場合、tより生成速度の大きい反応によるキノン色素の増加を「急激な増加」といい、tより生成速度の小さい反応によるキノン色素の増加を「穏やかな増加」という。「急激な増加」は短時間で起こり、「穏やかな増加」は経時的に比較的時間をかけて起こる。図１において第２試薬添加直後の急激な吸光度の増加が「急激な増加」を示し、測定１から測定２までの吸光度の増加が「穏やかな増加」を示す。「急激な増加」は第２試薬添加後、０〜60秒間で、好ましくは30秒以内に起こる。
従って、LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールに由来するキノン色素とLDL中のコレステロールに由来するキノン色素を別々に測定し、LDL中のコレステロールの存在量を正確に定量できるように、LDL中のコレステロールに由来するキノン色素の生成を第２試薬添加後の30秒以上５分以内に終結させることが望ましい。
LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールは第１工程においてコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行うことができる。また、LDL中のコレステロールは少なくとも第2工程においてLDLに作用する界面活性剤を加え、該界面活性剤と第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行うことができる。過酸化水素の定量は、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ酵素によって４−アミノアンチピリンとフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物との酸化縮合反応により、有色キノンに転化し、波長400〜700nmで測定する方法により行える。この際、第２工程において用いられる第２試薬を測定系に添加したとき、ペルオキシダーゼ酵素、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物のキノン色素の生成に関与する試薬組成物が全て系に含まれることになる。すなわち、第２工程において用いる第２試薬は、LDLに作用する界面活性剤を少なくとも含み、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンおよび水素供与体化合物（フェノール系またはアニリン系）のうち第１工程で用いられる第１試薬に含まれない試薬組成物を含んでいる。さらに、第２工程で用いられる第２試薬は、緩衝液、アルブミン、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼのいずれかを含んでいてもよい。
第２工程の反応において生じた有色キノンの吸光度の測定値は、第１工程の反応において生じた過酸化水素に由来する吸光度に第２工程において生じた過酸化水素に由来する吸光度が上乗せされたものであり、生体試料中の総てのリポ蛋白中のコレステロールの存在量を示す。また第１工程由来の過酸化水素の吸光度を全体の吸光度から差し引いたもの、つまり第２工程において生じた過酸化水素の定量がＬＤＬ中のコレステロールの存在量を示す。
水素供与体化合物のうちアニリン系水素供与体化合物として、N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3，5‐ジメトキシアニリン（HDAOS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3‐メトキシアニリン（ADPS）、N-エチル-N-スルホプロピルアニリン（ALPS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3，5‐ジメトキシアニリン（DAPS）、N‐スルホプロピル‐3，5‐ジメトキシアニリン（HDAPS）、N-エチル-N-スルホプロピル‐3，5‐ジメチルアニリン（MAPS）、N-エチル-N-スルホプロピル-3‐メチルアニリン（TOPS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3‐メトキシアニリン（ADOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）アニリン（ALOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）-3，5‐ジメトキシアニリン（DAOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）-3，5‐ジメチルアニリン（MAOS）、N-エチル-N‐（2‐ヒドロキシ‐3‐スルホプロピル）‐3‐メチルアニリン（TOOS）およびN‐スルホプロピルアニリン（HALPS）等がある。
第２工程の反応液中において過酸化水素をキノン色素に転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は0.1〜3.0IU/mLが好ましく、４-アミノアンチピリンの濃度は0.3〜3.0mmol/Lが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては0.5〜2.0mmol/Lが好ましい。
第２工程において、第２試薬を添加するとキノン色素生成に関わる試薬組成物が全て系に含まれるようになるので、第１工程で生成した過酸化水素を第２工程の早い段階でキノン色素に転化させる。また、同時にLDL中のコレステロールが第２試薬に含まれるLDLに作用する界面活性剤および測定系に含まれるコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼによる処理を受けて過酸化水素を生成する。LDL中のコレステロールに由来する過酸化水素を、生成と同時に測定系に含まれるキノン色素生成に関わる試薬組成物の作用によりキノン色素に転化させるので、経時的にキノン色素の量が増加する。従って、図１に示すように、第２工程において、第２工程の開始と同時に吸光度が急激に増加し、その後経時的に穏やかな増加を続ける。第１の測定では急激に増加した吸光度を測定し、第２の測定では経時的に穏やかに増加した吸光度を測定する。第２測定の測定値は、総コレステロールの存在量を反映し、第２測定の測定値と第１測定の測定値の差は、LDL中のコレステロールの存在量を反映する。
（２）測定系がコレステロールの測定でHDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する場合
前記（１）における第１工程をHDL以外のリポ蛋白に反応する試薬組成物とし、第２工程を少なくてもHDLと反応する試薬生成物にすることにより測定を行うことができる。
前記（１）における第１工程をHDL以外のリポ蛋白に反応する試薬組成物とし、第２工程を少なくてもHDLと反応する試薬生成物にすることにより測定を行うことができる。
第１工程において、生体試料中のHDLに特異的に反応する界面活性剤の非存在下でコレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素で処理し、過酸化水素を生成させる。第２工程においては、少なくともHDLに反応する界面活性剤および酵素で処理し、該反応により新たに過酸化水素が発生する。第２工程における全体の吸光度変化量が生体試料中の総コレステロールの存在量を反映した測定値となり、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量がHDL中のコレステロールの存在量を反映した測定値となる。前記２つの吸光度変化量、すなわち第２工程における全体の吸光度変化量および第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量に基づいて生体試料中のHDL中のコレステロールと総コレステロールの存在量を同時に測定することができる。
具体的には第１工程において、HDLに特異的に反応する界面活性剤の非存在下でコレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素で処理し、過酸化水素を生成させる。また、第１工程中には前記コレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素のほか、生体試料中のHDL以外のリポ蛋白に反応する界面活性剤を用いることができる。第１工程で用いられるHDL以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体やポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の分子量は5,000ダルトン以上が好ましく、疎水基の分子量は3,000ダルトン以下が好ましい。またHDL以外のリポ蛋白を凝集させるため凝集剤および/または2価の金属塩を加えても良い。凝集剤としてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、硫酸化シクロデキストリン、硫酸化オリゴ糖、もしくはそれらの塩、ポリエチレングリコール等があげられる。上記ヘパリンおよびその塩の濃度としては0.02〜10mM、リンタングステン酸およびその塩としては0.1〜10ｍMで分子量が4,000〜8,000ダルトン、デキストラン硫酸およびその塩としては0.01〜5mMで分子量が10,000〜500,000ダルトン、ポリエチレングリコールとしては0.3〜100mMで分子量が4,000から25,000のものが好ましい。第１工程でHDL以外の消去を高めるために試薬組成物としてさらに二価の金属イオンを添加することができる。二価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン、マグネシウムイオンが好ましく、マグネシウムイオンが特に好ましい。二価の金属イオンの濃度は5〜200mmol／Lが好ましい。第１工程の反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は0.2〜2.0IU/mL程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。またコレステロールオキシダーゼ濃度は0.1〜0.7IU/mL程度が好ましく、分子量60キロダルトン以下のものを用いることが好ましい。
第１工程では、生体試料中に存在していたHDL以外のリポ蛋白中コレステロールの量に対応して過酸化水素が生じ、該過酸化水素は消失、検出されることなく第２工程に持ち越される。
また、第１工程で用いられる試薬は、キノン色素生成に関与する試薬組成物の全てを含むことはなく、４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかを含む。また、第１工程で用いられる第１試薬は、ペルオキシダーゼを含まない。
続く第２工程では第１工程において処理したHDL以外のリポ蛋白中のコレステロールより生じた過酸化水素の定量と第１工程終了時に残存していたHDL中のコレステロールを処理し定量する。
HDL中のコレステロールの処理は、HDLを少なくともHDLに作用する界面活性剤で処理することにより行う。HDL中のコレステロールは該界面活性剤ならびにコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により過酸化水素を生成する。ここで、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼは第１工程において用いられる第１試薬に含まれており第１工程において測定系に添加されたものを利用すればよい。また、第２工程に用いられる第２試薬にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが含まれていてもよい。少なくともHDLに作用する界面活性剤は、HDLのみに選択的に作用する界面活性剤が好ましいが、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
上記界面活性剤としてはHLB13〜14の非イオン界面活性剤が好ましく、ポリアルキレンオキサイド誘導体が特に好ましい。誘導体の例としては、高級アルコール縮合物、高級脂肪酸複合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
HLB値が13以上14以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でHLB値が13以上14以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、複数の界面活性剤を混合することによりHLBを上記の範囲内に調整することができる。
第２工程において用いられる第２試薬を測定系に添加したとき、ペルオキシダーゼ酵素、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物のキノン色素の生成に関与する試薬組成物が全て系に含まれることになる。すなわち、第２工程において用いる第２試薬は、HDLに作用する界面活性剤を少なくとも含み、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンおよび水素供与体化合物（フェノール系またはアニリン系）のうち第１工程で用いられる第１試薬に含まれない試薬組成物を含んでいる。
図１に示すように、第２工程において、第２工程の開始と同時に吸光度が急激に増加し、その後経時的に穏やかな増加を続ける。第１の測定では急激に増加した吸光度を測定し、第２の測定では経時的に穏やかに増加した吸光度を測定する。第２測定の測定値は、総コレステロールの存在量を反映し、第２測定の測定値と第１測定の測定値の差は、HDL中のコレステロールの存在量を反映する。
（３）測定系がコレステロールの測定でHDLコレステロールとLDLコレステロールを同時に測定する場合
前記（１）における第１工程をHDLに反応する試薬成分とし、第２工程をLDLに反応する試薬成分にすることにより測定を行うことができる。
前記（１）における第１工程をHDLに反応する試薬成分とし、第２工程をLDLに反応する試薬成分にすることにより測定を行うことができる。
第１工程において、生体試料中のHDLに特異的に反応する界面活性剤やHDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬成分の存在下でコレステロールエステラーゼ酵素およびコレステロールオキシダーゼ酵素で処理し、過酸化水素を生成させる。また、第１工程で用いられる試薬は、キノン色素生成に関与する試薬組成物の全てを含むことはなく、４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかを含む。また、第１工程で用いられる第１試薬は、ペルオキシダーゼを含まない。第２工程においてはLDLに反応する界面活性剤および酵素で処理し、該反応により新たに過酸化水素が発生する。第２工程における全体の吸光度変化量が生体試料中のHDLコレステロールとLDLコレステロールの存在量の和を反映した測定値となり、第２工程における過酸化水素の発生量に対する吸光度変化量がLDL中のコレステロールの存在量を反映した測定値となる。全体の吸光度変化量に基づく存在量から第２工程における吸光度変化量に基づく存在量を差し引くことにより、HDLコレステロールの存在量を求めることができる。
HDLに作用する試薬成分としてHLB13〜14の非イオン界面活性剤が好ましく、ポリアルキレンオキサイド誘導体が特に好ましい。誘導体の例としては、高級アルコール縮合物、高級脂肪酸複合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
HLB値が13以上14以下のポリアルキレンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でHLB値が13以上14以下の化合物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、複数の界面活性剤を混合することによりHLBを上記の範囲内に調整することができる。また、上記HDLに作用するものとしてHDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬やHDL以外のリポ蛋白に対する抗体等を用いることができる。HDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬成分としてリポ蛋白の凝集剤および／または２価の陽イオンを含むものが用いられる。凝集剤としてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、硫酸化シクロデキストリン、硫酸化オリゴ糖、もしくはそれらの塩、ポリエチレングリコール等があげられる。上記ヘパリンおよびその塩の濃度としては0.02〜10mM、リンタングステン酸およびその塩としては0.1〜10mMで分子量が4,000〜8,000ダルトン、デキストラン硫酸およびその塩としては0.01〜5mMで分子量が10,000〜500,000ダルトン、ポリエチレングリコールとしては0.3〜100mMで分子量が4,000から25,000のものが好ましい。これら凝集剤は単独で用いてもよいし、数種類を組み合わせて用いてもよい。また上記HLB値が13以上14以下の界面活性剤と組み合わせて用いてもよい。
２価の陽イオンとしてはマグネシウム、マンガン、ニッケル、カルシウム、およびその塩を用いることができる。これらの濃度は0.1〜50mMが好ましい。
第２工程ではLDLのみの反応する試薬成分を用いる。具体的には、ポリオキシエチレン-ホリオキシプロピレン共重合体とポリアルキレンオキサイド誘導体があげられる。具体的な条件は（１）と同様である。
第２工程において用いられる第２試薬を測定系に添加したとき、ペルオキシダーゼ酵素、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物のキノン色素の生成に関与する試薬組成物が全て系に含まれることになる。すなわち、第２工程において用いる第２試薬は、LDLに作用する界面活性剤を少なくとも含み、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンおよび水素供与体化合物（フェノール系またはアニリン系）のうち第１工程で用いられる第１試薬に含まれない試薬組成物を含んでいる。
図１に示すように、第２工程において、第２工程の開始と同時に吸光度が急激に増加し、その後経時的に穏やかな増加を続ける。第１の測定では急激に増加した吸光度を測定し、第２の測定では経時的に穏やかに増加した吸光度を測定する。第１測定の測定値は、HDL中のコレステロールの存在量を反映し、第２測定の測定値と第１測定の測定値の差は、LDL中のコレステロールの存在量を反映する。
（４）測定系がトリグリセリドの測定の場合
上記（１）〜（３）の使用酵素をコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼからトリグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼに変更する以外は（１）〜（３）と同様の方法によりLDLトリグリセリドと総トリグリセリド、またはHDLトリグリセリドと総トリグリセリド、またはLDLトリグリセリドとHDLトリグリセリドを同時に測定する。尚、本測定系においては上記酵素反応を促進するため反応系にコレステロールエステラーゼを添加してもよい。
上記（１）〜（３）の使用酵素をコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼからトリグリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール-3-リン酸オキシダーゼに変更する以外は（１）〜（３）と同様の方法によりLDLトリグリセリドと総トリグリセリド、またはHDLトリグリセリドと総トリグリセリド、またはLDLトリグリセリドとHDLトリグリセリドを同時に測定する。尚、本測定系においては上記酵素反応を促進するため反応系にコレステロールエステラーゼを添加してもよい。
図１に示すように、第２工程において、第２工程の開始と同時に吸光度が急激に増加し、その後経時的に穏やかな増加を続ける。第１の測定では急激に増加した吸光度を測定し、第２の測定では経時的に穏やかに増加した吸光度を測定する。第２測定の測定値は、総グリセリドまたはLDLグリセリドの存在量を反映し、第２測定の測定値と第１測定の測定値の差は、LDLグリセリドまたはHDLグリセリドの存在量を反映する。
（５） 測定系がクレアチニン、尿酸、またはグルコースの測定の場合
（i） クレアチニンの測定法としてクレアチニンデアミナーゼ法とクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）法がある。前者において、クレアチニンに酵素を作用させて、アンモニアを生成しアンモニアを比色法で測定する。後者において、クレアチニンはクレアチニナーゼの作用でクレアチンとなり、さらにクレアチナーゼによってザルコシンを生じ、ついでザルコシンオキシダーゼによって過酸化水素が生成される。次にペルオキシダーゼの共存で各種色原体より生成するキノン色素を定量する。
（i） クレアチニンの測定法としてクレアチニンデアミナーゼ法とクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチナーゼ）法がある。前者において、クレアチニンに酵素を作用させて、アンモニアを生成しアンモニアを比色法で測定する。後者において、クレアチニンはクレアチニナーゼの作用でクレアチンとなり、さらにクレアチナーゼによってザルコシンを生じ、ついでザルコシンオキシダーゼによって過酸化水素が生成される。次にペルオキシダーゼの共存で各種色原体より生成するキノン色素を定量する。
(ii) グルコースの測定法として、グルコース、O2およびH2OにGOD（グルコース酸化酵素）を作用させてグルクロン酸と過酸化水素が生成するGOD反応を利用したGOD-POD法がある。GOD反応にペルオキシダーセ（POD）を共存させ、色素などの酸化、呈色を測定する。
GOD反応で生成したH2O2により、POD存在下で4-アミノアンチピリン（4AA）とフェノー ルを酸化縮合させ生成するキノン型色素（505nmに吸収極大）を比色するアミノアンチピリン-フェノール系とGOD反応で生成したH2O2により、POD存在下で3-メチル-2-ベンゾチアゾリンヒドラゾンとジメチルアニリンを酸化縮合させ生成するindamine色素（600nmに吸収極大）を比色するMBTH-DMA系の測定系がある。
(iii) 尿酸の測定法として、尿酸にウリカーゼを作用させてH2O2を生成させ、生成したH2O2とEHSPT（Ｎ-エチル-2-ヒドロキシ-Ｎ-トルイジン）、4AA（4-アミノアンチピリン）をペルオキシダーゼの存在下で酸化縮合させ赤紫色キノン色素を生成させ、キノン色素を546nmで測光し、尿酸含量を求める、ウリカーゼ-ペルオキシダーゼ法がある。
例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物が尿酸である場合、第１試薬にGODを含ませ、更にキノン色素生成に関わる試薬組成物である４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかを含ませ、第２試薬にウリカーゼを含ませ、更に４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものを試薬組成物として含ませればよい。この場合、第１反応中間物および第２反応中間物は過酸化水素であり、第１反応生成物および第２反応生成物はキノン色素である。
また、例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物がクレアチニンである場合、第１試薬にGODを含ませ、更にキノン色素生成に関わる試薬組成物である４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかを含ませ、第２試薬にクレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ザルコシンオキシダーゼを含ませ、更に４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものを試薬組成物として含ませればよい。この場合、第１反応中間物は過酸化水素、第１反応生成物はキノン色素、第２反応中間物はザルコシン、第２反応生成物はキノン色素である。また、第２試薬に４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものおよびクレアチニンデアミナーゼを含ませてもよい。この場合、第１反応中間物は過酸化水素、第１反応生成物はキノン色素、第２反応生成物はアンモニアである。
（６） 測定系がグルコース、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）（アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT））、乳酸脱水素酵素（LDH）、クレアチンフォスホキナーゼ（CPK）、等の測定の場合、それら測定対象物をNAD（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）および／またはNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下で反応させ、反応に伴うNADおよび／またはNADHの増加量、減少量、増加速度および減少速度のうちいずれか１つ以上を測定することで定量することができる。具体的には、
(i)グルコースの測定として、ヘキソキナーゼ（HK）の作用によりグルコースをグルコース６リン酸に転換し、さらにこのグルコース６リン酸がNADとグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）の存在下でグルコノラクトン６リン酸とNADHになる。このときNADがNADHに還元されることで340nmにおける吸光度が増加し、この増加量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
(i)グルコースの測定として、ヘキソキナーゼ（HK）の作用によりグルコースをグルコース６リン酸に転換し、さらにこのグルコース６リン酸がNADとグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）の存在下でグルコノラクトン６リン酸とNADHになる。このときNADがNADHに還元されることで340nmにおける吸光度が増加し、この増加量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
(ii)GOTの測定として、L-アスパラギン酸とα-ケトグルタル酸をGOTの作用によりグルタミン酸とオキサロ酢酸に転換し、さらにこのオキサロ酢酸がNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）とMDH（リンゴ酸脱水素酵素）の存在下でリンゴ酸とNADになる。このときNADHがNADに酸化されることで340nmにおける吸光度が減少し、この減少量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
（iii)GPTの測定として、L-アラニンとα-ケトグルタル酸をGPTの作用によりグルタミン酸とピルビン酸に転換し、ピルビン酸はNADHの存在下で乳酸脱水素酵素によって乳酸になる。このときNADHはNADに酸化されることで340nmにおける吸光度が減少し、この減少量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
(iv)LDHの測定として、ピルビン酸はNADHの存在下でLDHの作用により乳酸になる。このときNADHはNADに酸化されることで340nmにおける吸光度が減少し、この減少量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
(v)CPKの測定として、CPKの作用によりクレアチンとアデノシン３リン酸（ATP）をクレアチンリン酸とアデノシン２リン酸（ADP)に転換し、さらにこのADPをフォスフェノールピルビン酸（PEP）の存在下でピルビン酸キナーゼ（PK）の作用によりATPとピルビン酸(Pyr)に転換し、このピルビン酸をNADHの存在下で乳酸脱水素酵素の作用により乳酸とNADになる。このときNADHがNADに酸化されることで340nmにおける吸光度が減少し、この減少量や速度を測定することで活性値を求める測定系がある。
その他の測定対象物質として、測定対象物質をNADおよび／またはNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の存在下で反応させ、反応に伴うNADおよび／またはNADHの増加または減少が測定できるものであれば、いずれの測定対象物質も測定可能である。
例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物がGOTである場合、第１試薬にHKとATPを含ませ、更にL-アスパラギン酸とα-ケトグルタル酸の少なくとも一方を含ませ、更にNADとG6PDHのいずれか一方を含ませ、またNADHが第１試薬に含まれていてもよい、第２試薬にMDHおよびL-アスパラギン酸、α-ケトグルタル酸、NADおよびG6PDHのうち第１試薬に含まれなかったものを含ませればよい。
また、例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物がGPTである場合、第１試薬にHKとATPを含ませ、更にL-アラニンとα-ケトグルタル酸の少なくとも一方を含ませ、更にNADとG6PDHのいずれか一方を含ませ、またNADHが第１試薬に含まれていてもよい、第２試薬にLDHおよびL-アラニン、α-ケトグルタル酸、NADおよびG6PDHのうち第１試薬に含まれなかったものを含ませればよい。
また、例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物がLDHである場合、第１試薬にHKとATPを含ませ、更にNADとG6PDHのいずれか一方を含ませ、またNADHが第1試薬に含まれていてもよい、第２試薬にピルビン酸およびLDHを含ませ、更にNADおよびG6PDHのうち第１試薬に含まれなかった方を含ませればよい。
また、例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がグルコースであり第２の測定対象物がCPKである場合、第１試薬にHKとATPを含ませ、更にクレアチン、PEPおよびPKの少なくとも一つを含ませ、更にNADとG6PDHのいずれか一方を含ませ、またNADHが第1試薬に含まれていてもよい、第２試薬にLDHおよびクレアチン、PEP、PKのうち第１試薬に含まれなかったものを含ませ、更に第２試薬LDHを含ませ、更にNADおよびG6PDHのうち第１試薬に含まれなかった方を含ませればよい。
（７） 測定系がアミラーゼ（AMY）、アルカリフォスファターゼ（ALP）等の測定の場合、基質に測定対象物を作用させｐ-ニトロフェノール（PNP）を生成し、その生成速度を測定することで定量することが出来る。また、測定系がγ-GTPの場合5-アミノ-2-ニトロベンゾイドを生成し、その生成速度を測定することで定量することが出来る。これらPNPおよび5-アミノ-2-ニトロベンゾイドは同一波長405nmにおける吸光度で測定することができる。具体的には、
(i)AMYの測定として、4,6-エチリデン-4-ニトロフェニル-α-(1→4)-Ｄ-マルトヘプタオシド（Et-G7-pNP）にAMYを作用させ、α-アミラーゼの作用により生成するG2PNP、G3PNP、G4PNPに共役酵素であるα-グルコシダーゼ（α-GH）を作用させPNPを遊離させ、PNPの生成に伴う吸光度の生成速度を測定することによりアミラーゼ活性値を求める測定系がある。
(i)AMYの測定として、4,6-エチリデン-4-ニトロフェニル-α-(1→4)-Ｄ-マルトヘプタオシド（Et-G7-pNP）にAMYを作用させ、α-アミラーゼの作用により生成するG2PNP、G3PNP、G4PNPに共役酵素であるα-グルコシダーゼ（α-GH）を作用させPNPを遊離させ、PNPの生成に伴う吸光度の生成速度を測定することによりアミラーゼ活性値を求める測定系がある。
(ii)ALPの測定として、ALPをｐ-ニトロフェニルリン酸に作用させｐ-ニトロフェノールを遊離する。このPNPの生成速度を405nmにおける吸光度で測定し血清中のアルカリ性フォスファターゼ活性値を求める測定系がある。
(iii)γ-GTPの測定として、L-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリドとグリシルグリシンにγ-GTPを作用させ、5-アミノ-2-ニトロベンゾイドを生成させ、5-アミノ-2-ニトロベンゾイドの生成速度を405nmにおける吸光度で測定し、γ-GTPの活性値を求める測定系がある。
その他の測定対象物質として、測定対象物質を反応させPNPや5-アミノ-2-ニトロベンゾイドの生成が測定できるものであれば、いずれの測定対象物質も測定可能である。
例えば２項目の測定対象物中、第１の測定対象物がAMYであり第２の測定対象物がALPである場合、第１試薬にEt-G7-pNPを含ませ、第２試薬にα-グルコシダーゼ（α-GH）とｐ-ニトロフェニルリン酸を含ませればよい。
本発明は、さらに被検体試料中の２項目の脂質成分等の測定対象物を一度に定量する方法であって、生体試料中の第１の測定対象物を処理し、過酸化水素を生成させる第１工程および第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化させるとともに第２の測定対象物を処理し発生した過酸化水素をキノン色素に転化させる第２工程からなり、第１工程においてはキノン色素の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来のキノン色素を測定し、第２の測定で第１の測定対象物および第２の測定対象物由来のキノン色素を測定することにより生成したキノン色素の量から２項目の測定対象物を一度に定量する方法を行うためのキットを包含する。本発明のキットは第１試薬および第２試薬を含む。第１試薬はさらに、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物からなるキノン色素生成に関わる試薬組成物を含んでいてよいが、ペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物の全てを同時に含むことはない。また、ペルオキシダーゼを含むことはなく、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物のいずれか一つを含む。さらに、第１試薬は適当な緩衝液、アルブミン等を含んでいてもよい。第２試薬は少なくともペルオキシダーゼ、４-アミノアンチピリンならびにフェノール系またはアニリン系水素供与体化合物からなるキノン色素生成に関わる試薬組成物のうち第１試薬に含まれていないものを含む。第２試薬はさらに適当な緩衝液、アルブミン等を含んでいてもよい。さらに、第１試薬に第１の測定対象物に作用する界面活性剤および酵素が含まれ、第２試薬に少なくとも第２の測定対象物に作用する界面活性剤が含まれていてもよい。該試薬組成物の反応により生じた有色キノンの吸光度を測定することができる。本発明のキットは、さらに濃度既知の標準測定対象物白溶液、緩衝液等を含む。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
測定系がコレステロール測定で、LDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する試薬において、第１工程および第２工程に用いる試薬組成物（それぞれ、第１試薬組成物および第２試薬組成物）を以下の組成になるように調製した。比較対象である測定系１は発色に関与する成分がすべて第１試薬中に存在する試薬、測定系２は本発明の試薬とした。
測定系がコレステロール測定で、LDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する試薬において、第１工程および第２工程に用いる試薬組成物（それぞれ、第１試薬組成物および第２試薬組成物）を以下の組成になるように調製した。比較対象である測定系１は発色に関与する成分がすべて第１試薬中に存在する試薬、測定系２は本発明の試薬とした。
測定系１
測定系２
上記試薬を8℃で一定期間保存し、第１試薬の吸収スペクトルの変動を測定した。
吸収スペクトル測定は分光光度系U-3000（日立社製）を使用。
第１試薬生成物の吸収スペクトルの結果を図２および図３に示す。
図２に示されるように発色剤が第１試薬に集中している測定系１では第１試薬が自然発色し、数時間で吸収スペクトルの変動が認められる。これに対し、図３に示される発色に関与する成分が第１試薬と第２試薬に分かれている本発明では数ヶ月経過後も吸収スペクトルにほとんど変動は認められず液状の状態で安定であることがわかる。
実施例２
実施例１と同様な試薬を用いて、試薬保存におけるキャリブレーション吸光度の変動を調べた。
実施例１と同様な試薬を用いて、試薬保存におけるキャリブレーション吸光度の変動を調べた。
自動分析装置としてTBA-30R(東芝社製)を使用。
（LDL-C、T-CHO同時分析用試薬）
測定条件：多項目自動分析
試料各４μLにあらかじめ37℃に加温した第１試薬300μLを混和し、37℃で５分間反応させた後に、第２試薬100μLを加えさらに５分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。LDLコレステロールの測定は第２試薬添加後30秒後と５分後の吸光度変化量から、総コレステロールの測定は第２試薬添加後の吸光度変化量を算出した。結果を図４および図５に示す。
測定条件：多項目自動分析
試料各４μLにあらかじめ37℃に加温した第１試薬300μLを混和し、37℃で５分間反応させた後に、第２試薬100μLを加えさらに５分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。LDLコレステロールの測定は第２試薬添加後30秒後と５分後の吸光度変化量から、総コレステロールの測定は第２試薬添加後の吸光度変化量を算出した。結果を図４および図５に示す。
図４および図５に示されるように、測定系１では試薬の自然発色に伴いキャリブレーション吸光度が短時間で変動し、安定した性能が得られない。これに対し本発明では長期にわたりキャリブレーション吸光度は安定であり試薬性能が維持されているのがわかる。
実施例３
実施例１と同様の試薬を調製し、ヒト血清30例を測定した。評価対象製品としてLDLコレステロールはLDL-EX N（デンカ生研社製）、総コレステロールはT-CHO(S)N（デンカ生研社製）を使用した。図６に評価対象製品であるLDL-EX Nを用いて測定したLDL中のコレステロール測定値と、本発明の方法で測定した測定値の相関を示す。図７に評価対象製品であるT-CHO(S)Nを用いて測定した総コレステロール測定値と、本発明の方法で測定した測定値の相関を示す。図６および図７に示すように、本法の同時定量によって、それぞれ単独にLDLコレステロールと総コレステロール測定を行った値と同様な測定結果が得られている。
実施例１と同様の試薬を調製し、ヒト血清30例を測定した。評価対象製品としてLDLコレステロールはLDL-EX N（デンカ生研社製）、総コレステロールはT-CHO(S)N（デンカ生研社製）を使用した。図６に評価対象製品であるLDL-EX Nを用いて測定したLDL中のコレステロール測定値と、本発明の方法で測定した測定値の相関を示す。図７に評価対象製品であるT-CHO(S)Nを用いて測定した総コレステロール測定値と、本発明の方法で測定した測定値の相関を示す。図６および図７に示すように、本法の同時定量によって、それぞれ単独にLDLコレステロールと総コレステロール測定を行った値と同様な測定結果が得られている。
実施例４
測定系がコレステロール測定で、HDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する試薬において、第１工程および第２工程に用いる試薬組成物（それぞれ、第１試薬組成物および第２試薬組成物）を以下の組成になるように調製した。
測定系がコレステロール測定で、HDLコレステロールと総コレステロールを同時に測定する試薬において、第１工程および第２工程に用いる試薬組成物（それぞれ、第１試薬組成物および第２試薬組成物）を以下の組成になるように調製した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (19)
- ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の測定対象物を分離操作のない連続的な一連の処理で定量する方法であり、ただし２項目の測定対象物は低密度リポ蛋白中のコレステロールおよび総コレステロールではなく、第１の測定対象物は、第１の試薬に含まれる試薬組成物と反応して第１の反応中間物を生成し第２の測定対象物は第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して第２の反応中間物を生成し、さらに該第１の反応中間物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して光学的に測定可能な第１の反応生成物を生成し前記第２の反応中間物が第２の試薬に含まれる試薬組成物と反応して光学的に測定可能な第２の反応生成物を生成し、前記方法は被検体試料中に第１の試薬を添加して第１の測定対象物を処理し前記第１の反応中間物を生成させる第１の工程および第２の試薬を添加して第１の工程で得られた前記第１の反応中間物から第１の反応生成物を生成させるとともに第２の測定対象物を処理し生成した第２の反応中間物から第２の反応生成物を生成させる第２工程からなり、第１工程においては第１の反応生成物の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来の第１の反応生成物を測定し、第２の測定で第２の測定対象物由来の第２の反応生成物または第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物の両方を測定することにより、生成した第１および第２の反応生成物の量から２項目の測定対象物を分離操作のない連続的な一連の処理で定量する方法。
- 第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物が同じ吸光波長を有する請求項１記載の方法。
- 第１の測定対象物由来の第１の反応生成物および第２の測定対象物由来の第２の反応生成物が同じ物質である請求項２記載の方法。
- さらに、第１の反応中間物および第２の反応中間物が同じ物質である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 第１の測定対象物および第２の測定対象物が被検体試料中の脂質成分、クレアチニン、尿酸、グルコース、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（GOT）（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）（アラニン・アミノトランスフェラーゼ（ALT））、ガンマ・グルタミル・トランス・ペプチダーゼ（γ-GTP）、乳酸脱水素酵素（LDH）、アルカリフォスファターゼ（ALP）、クレアチンフォスホキナーゼ（CPK）およびアミラーゼ（AMY）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 第１の測定対象物および第２の測定対象物が被検体試料中の脂質成分である、請求項５記載の方法。
- 脂質成分がリポ蛋白質中のコレステロールまたはトリグリセリド成分である請求項６記載の方法。
- 第１および第２の測定対象物からの第１および第２の反応生成物の生成および第１および第２の反応中間物からの第１および第２の反応生成物の生成が酸化還元反応により起こる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- ２種類の試薬を用いて被検体試料中の２項目の脂質成分を分離操作のない連続的な一連の処理で定量する方法であって、生体試料中の第１の測定対象物を処理し、過酸化水素を生成させる第１工程および第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化させるとともに第２の測定対象物を処理し発生した過酸化水素をキノン色素に転化させる第２工程からなり、第１工程においてはキノン色素の生成が起こらず、第２工程において２回の測定を行い第１の測定で第１の測定対象物由来のキノン色素を測定し、第２の測定で第１の測定対象物および第２の測定対象物由来のキノン色素を測定することにより生成したキノン色素の量から２項目の測定対象物を分離操作のない連続的な一連の処理で定量する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- キノン色素生成に関わる試薬組成物が４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼからなり、第１工程で４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれか一つが添加され、第２工程では第１工程で添加されなかった試薬組成物が添加される、請求項９記載の方法。
- 上記脂質成分の測定が、リポ蛋白質中のコレステロールまたはトリグリセリド成分の測定である請求項９または１０に記載の方法。
- 上記脂質成分がコレステロールの場合、総コレステロールと高密度リポ蛋白（以下HDL）コレステロール、またはLDLコレステロールとHDLコレステロールである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 上記脂質成分がトリグリセリドの場合、２項目の測定対象物が血中総トリグリセリドとLDLトリグリセリド、総トリグリセリドとHDLトリグリセリド、またはLDLトリグリセリドとHDLトリグリセリドである請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- ２項目の測定対象物が総脂質成分とHDL中の脂質成分の場合、HDL以外のリポ蛋白にのみ作用する酵素および界面活性剤を含む試薬の存在下で過酸化水素を発生させる第１工程と、ついで第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化する反応とHDLのみに反応する試薬の存在下で過酸化水素を発生させ、キノン色素に転化する第２工程からなる請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- ２項目の測定対象物がHDLおよびLDL中の脂質成分の場合、HDLにのみ作用する特定の酵素および界面活性剤を含む試薬の存在下で過酸化水素を発生させる第１工程と、ついで第１工程で得られた過酸化水素をキノン色素に転化する反応とLDLのみに反応する試薬の存在下で過酸化水素を発生させ、キノン色素に転化する第２工程からなる請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 第２工程における吸光度の変化が、第２試薬の添加直後の急激な増加と、その後の緩やかな増加の２相性の増加を示し、後者の緩やかな吸光度変化量より一方の測定対象の定量を行う請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- 第２工程の全体の吸光度変化量より総コレステロールの定量を行う請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- 第１工程および第２工程においてそれぞれ液状状態の試薬１種類を添加する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法において、液状試薬を安定化させる方法であって、第１工程で添加される第１試薬にキノン色素生成に関わる試薬組成物である４−アミノアンチピリンまたはフェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物のいずれかが含まれ、第２試薬には４−アミノアンチピリン、フェノール系もしくはアニリン系水素供与体化合物およびペルオキシダーゼのうち第１試薬に含まれないものが含まれる、液状試薬を安定化させる方法。
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