ES2248856T3 - Procedimiento para determinar el contenido en colesterol de lipoproteinas de alta densidad. - Google Patents
Procedimiento para determinar el contenido en colesterol de lipoproteinas de alta densidad.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA CUANTIFICAR EL COLESTEROL EN HDL, QUE NO REQUIERE OPERACIONES DE SEPARACION Y FRAGMENTACION COMPLEJAS, Y MEDIANTE EL CUAL SE PUEDE CUANTIFICAR DE FORMA SELECTIVA, SIMPLE Y PRECISA, EL COLESTEROL HDL EN MUESTRAS EXPERIMENTALES QUE CONTIENEN HDL Y OTRAS LIPOPROTEINAS, COMO LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD (LDL), LIPOPROTEINAS DE DENSIDAD MUY BAJA (VLDL) Y QUILOMICRONES. DICHO METODO COMPRENDE UNA PRIMERA FASE DE ELIMINACION DEL COLESTEROL PRESENTE EN LIPOPROTEINAS DISTINTAS DE LAS LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD, EN UNA MUESTRA EXPERIMENTAL; Y UNA SEGUNDA FASE DE ADICION DE UN TENSIOACTIVO QUE ACTUA ESPECIFICAMENTE SOBRE LAS LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD, AL PRODUCTO DE LA PRIMERA FASE, Y CUANTIFICAR ENZIMATICAMENTE EL COLESTEROL EXISTENTE EN LAS LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD.
Description
Procedimiento para determinar el contenido en
colesterol de lipoproteínas de alta densidad.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para cuantificar el colesterol en las lipoproteínas de
elevada densidad (a partir de ahora denominadas "HDL").
Se sabe que las HDL se relacionan con la retirada
del colesterol acumulado en las células, porque reciben el
colesterol a partir de varios tejidos, incluyendo las paredes de los
vasos sanguíneos con esclerosis arterial, de forma que las HDL son
útiles para estimar el riesgo respecto varias esclerosis arteriales,
incluyendo la esclerosis arterial coronaria; y que su nivel en
sangre es un indicador del riesgo de inicio de la esclerosis
arterial.
Los procedimientos para medir el colesterol en
las HDL incluyen un procedimiento en el cual se separan las HDL de
otras lipoproteínas mediante centrifugación y, a continuación, se
miden las HDL; y un procedimiento en el cual se separa el colesterol
en las HDL mediante centrifugación, a continuación se tiñe el
lípido, y se mide la intensidad del color generado. No obstante,
estos procedimientos son complejos, o un cierto número de muestras
no pueden ensayarse, de forma que no se usan comúnmente.
El procedimiento para medir el colesterol en las
HDL que se usa generalmente en el campo del ensayo clínico, es un
procedimiento en el cual se añade un agente de precipitación a la
muestra con objeto de coagular las lipoproteínas distintas de las
HDL, retirándose mediante centrifugación las lipoproteínas
coaguladas, y se mide el colesterol en el sobrenadante resultante
que contiene las HDL. Aunque este procedimiento es más sencillo que
el procedimiento de la ultracentrifugación y el procedimiento de la
electroforesis, no es satisfactoriamente sencillo, puesto que
comprende la adición del agente de precipitación y la subsiguiente
separación, y, en comparación, se necesita una gran cantidad de
muestra.
Por otra parte, se han propuesto procedimientos
en los que el colesterol en las HDL se cuantifica separadamente
usando enzimas. Por ejemplo, se conoce un procedimiento que
comprende los pasos de, coagular de forma preliminar las
lipoproteínas distintas de las HDL mediante un anticuerpo y
polianión, hacer reaccionar enzimáticamente sólo el colesterol en
las HDL, inactivar el enzima y simultáneamente redisolver la masa
coagulada, y medir la absorbancia de la solución resultante
(Solicitud de patente japonesa hecha pública (Kokai) nº
6-242110). No obstante, este procedimiento tiene un
problema, puesto que es necesario añadir reactivos al menos tres
veces, de forma que este procedimiento sólo puede ser practicado por
limitados aparatos de análisis. Por tanto, este procedimiento no se
usa ampliamente.
Otros procedimientos incluyen un procedimiento en
el que se lleva a cabo una reacción enzimática en presencia de una
sal de bilis o de un tensioactivo no iónico (Solicitud de Patente
Japonesa (Kokai), nº 63-126498); un procedimiento
desarrollado más recientemente en el cual el colesterol en las HDL
es atrapado mediante esterasa de colesterol y/o oxidasa de
colesterol, en presencia de un compuesto clatrato tal como la
ciclodextrina (Solicitud de Patente Japonesa (Kokai), nº
7-301636); y un procedimiento en el cual las
lipoproteínas distintas de las HDL se convierten en agregados o
complejos, y a continuación se atrapa el colesterol en las HDL
mediante una reacción enzimática (Solicitud de Patente Japonesa
(Kokai), nº 8-131197 y 8-201393).
Sin embargo, con estos procedimientos, los resultados para ciertas
muestras son diferentes de los resultados mediante el procedimiento
de la precipitación, de forma que sus especificidades son
problemáticas.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para cuantificar el colesterol en HDL,
el cual no requiere complejas operaciones de fragmentación y
separación, y mediante el cual podría cuantificarse selectiva,
simple y precisamente el colesterol de HDL en muestras de ensayo que
contienen HDL y otras lipoproteínas como las lipoproteínas de baja
densidad (LDL), las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y los
quilomicrones.
Los presentes inventores estudiaron intensamente
con objeto de descubrir que existen tensioactivos que actúan sobre
las HDL pero que no actúan sustancialmente sobre otras
lipoproteínas. Los presentes inventores descubrieron además que el
colesterol de las HDL, en muestras de ensayo que contenían HDL y
otras lipoproteínas, podía cuantificarse selectiva, simple y
precisamente, mediante la eliminación selectiva del colesterol en
las lipoproteínas distintas de la lipoproteína de elevada densidad
en la muestra de ensayo, y a continuación cuantificar el colesterol
procedente de las HDL en presencia del tensioactivo antes
mencionado, completándose de ese modo la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona un
procedimiento para cuantificar el colesterol en lipoproteínas de
elevada densidad, el cual comprende un primer paso de eliminación
del colesterol en proteínas distintas de las lipoproteínas de
elevada densidad en una muestra de ensayo, y un segundo paso de
adición de un tensioactivo, el cual específicamente actúa sobre las
lipoproteínas de elevada densidad, al producto del primer paso, y
cuantificar enzimáticamente el colesterol en las lipoproteínas de
elevada densidad.
Mediante el procedimiento de la presente
invención, el colesterol en las HDL, en una muestra de ensayo que
contiene HDL y otras lipoproteínas tales como las LDL, VLDL y los
CM, podría cuantificarse selectiva, simple y precisamente, sin
complejas operaciones de fragmentación y separación.
La Figura 1 muestra la correlación entre las
cantidades de colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento de
un ejemplo acorde con la presente invención, y las cantidades de
colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento convencional de
la precipitación.
La Figura 2 muestra la correlación entre las
cantidades de colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento de
otro ejemplo acorde con la presente invención, y las cantidades de
colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento convencional de
la precipitación.
La Figura 3 muestra la correlación entre las
cantidades de colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento de
aún otro ejemplo acorde con la presente invención, y las cantidades
de colesterol en HDL medidas mediante el procedimiento convencional
de la precipitación.
Los colesteroles contenidos en las lipoproteínas
incluyen el colesterol del tipo éster (éster de colesterol) y el
colesterol libre. En esta especificación, el término
"colesterol" incluye ambos de estos a menos que se indique lo
contrario.
La muestra de ensayo sometida al procedimiento de
la presente invención podría ser cualquier muestra que pueda
contener lipoproteínas tales como las HDL, LDL, VLDL y CM. Los
ejemplos de estas muestras de ensayo incluyen los fluidos corporales
tales como el suero, así como diluciones de los mismos, aunque las
muestras de ensayo no están restringidas a éstos.
En el primer paso en el procedimiento de la
presente invención, se elimina selectivamente el colesterol en las
lipoproteínas distintas de las HDL en la muestra de ensayo. El
término "elimina" en ésta significa descomponer el colesterol y
hacer que los productos descompuestos no sean detectables en el
subsiguiente segundo paso. Los procedimientos para eliminar
selectivamente el colesterol en las lipoproteínas distintas de las
HDL, es decir, en las LDL, VLDL, y CM, y similares, incluyen los
siguientes procedimientos.
En el primer procedimiento, se dejan actuar la
esterasa de colesterol y la oxidasa de colesterol sobre la muestra
de ensayo, en ausencia de un tensioactivo que actúa sobre las HDL, y
se retira el peróxido de hidrógeno generado. Por la acción de la
esterasa de colesterol, el colesterol del tipo éster en las
lipoproteínas es hidrolizado para rendir colesterol libre y ácidos
grasos. El colesterol libre generado de este modo, y el colesterol
libre que existe de forma inherente en las lipoproteínas, son
oxidados por la acción de la oxidasa de colesterol para rendir
colestenona y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno
generado de este modo se elimina. Los procedimientos para eliminar
el peróxido de hidrógeno incluyen un procedimiento en el que el
peróxido de hidrógeno se descompone en agua y oxígeno mediante una
catalasa; y un procedimiento en el cual un compuesto donante de
hidrógeno, basado en fenol o basado en anilina, tal como el DAOS
(N-etil-N-(2-hidroxisulfopropil)-3,5-dimetoxianilina),
que reacciona con el peróxido de hidrógeno para rendir una quinona
incolora, se hace reaccionar con el peróxido de hidrógeno para
convertir el peróxido de hidrógeno en la quinona incolora, aunque
los procedimientos para eliminar el peróxido de hidrógeno no están
limitados a estos procedimientos.
En el primer paso antes mencionado, llevando a
cabo el paso en ausencia de un tensioactivo que actúa sobre las HDL,
el colesterol en las HDL no reacciona sustancialmente, mientras que
el colesterol en las otras lipoproteínas, tales como las LDL, VLDL y
CM, reacciona y es eliminado. Gracias a esto, en el subsiguiente
segundo paso, el colesterol en las HDL es cuantificado
selectivamente.
La concentración de la esterasa de colesterol en
la mezcla de reacción en el primer paso preferiblemente podría ser
aproximadamente de 0,2 a 1,0 U/ml, y la concentración de oxidasa de
colesterol preferiblemente podría ser aproximadamente de 0,1 a 0,7
U/ml. La concentración de la catalasa preferiblemente podría ser
aproximadamente de 40 a 100 U/ml, y la concentración de la
peroxidasa preferiblemente podría ser aproximadamente de 0,4 a 1,0
U/ml. La concentración del compuesto que rinde la quinona incolora a
partir de la reacción con peróxido de hidrógeno preferiblemente
podría ser aproximadamente de 0,4 a 0,8 mmol/l.
La reacción en el primer paso podría realizarse
preferiblemente en un tampón con un pH de 5 a 8, y el tampón podría
ser preferiblemente un tampón fosfato, un tampón glicina, tampón
Tris o tampón de Good. Son especialmente preferidos el
Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES y POPSO, los
cuales son tampones de Good. La concentración del tampón
preferiblemente podría ser aproximadamente de 10 a 500 mM.
Para incrementar el grado de eliminación de las
lipoproteínas distintas de las HDL, la mezcla de reacción podría
contener iones metálicos divalentes. Los ejemplos preferidos de
iones metálicos divalentes incluyen el ion de cobre, el ion de
hierro, y el ion de magnesio. Entre estos, el ion de magnesio es
especialmente preferido. La concentración del ion metálico divalente
podría estar preferiblemente entre aproximadamente de 5 a 200
mM.
Óptimamente, podría añadirse una hidrolasa de
lipoproteínas a la mezcla de reacción en el primer paso. Se prefiere
la adición de este enzima porque especialmente el colesterol en las
VLDL reacciona fácilmente. La concentración de este enzima en la
mezcla de reacción podría ser de forma preferible aproximadamente de
5,0 a 10,0 U/ml.
La temperatura de reacción en el primer paso
podría ser de forma preferible aproximadamente de 25ºC a 40ºC, y
37ºC es la más preferida. El tiempo de reacción podría ser
aproximadamente de 2 a 10 minutos.
En el paso segundo siguiente, se añade al
producto de la reacción del primer paso un tensioactivo que actúa
específicamente sobre las HDL, y el colesterol el las lipoproteínas
de elevada densidad se cuantifica enzimáticamente. El término
"tensioactivo que actúa específicamente sobre las HDL"
significas un tensioactivo mediante el cual el colesterol en las HDL
reacciona debido a la acción de un enzima tal como la esterasa de
colesterol o la oxidasa de colesterol (la proporción de reacción no
es menor del 70%, preferiblemente no es menor del 90%), mientras que
el colesterol en las lipoproteínas distintas de las HDL no reacciona
sustancialmente (la proporción de reacción no es superior al 30%,
preferiblemente no más del 20%). Los ejemplos de tales tensioactivos
incluyen los tensioactivos que tienen un equilibrio de
hidrofilicidad-lipofilicidad (HLB) de 13 a 14,
especialmente los tensioactivos no iónicos con un HLB de 13 a 14,
especialmente los derivados del óxido de polialquileno. Los ejemplos
preferidos de los derivados en ésta incluyen los productos de
condensación con alcoholes superiores, los productos de condensación
con ácidos grasos, los productos de condensación con amidas de
ácidos grasos, los productos de condensación con alquilaminas
superiores, los productos de condensación con alquilmercaptanos
superiores, y los productos de condensación con alquilfenoles. Entre
los derivados polialquilenóxidos, los derivados del óxido de
polietileno son los más preferidos. El rango de HLB mencionado más
arriba podría conseguirse mezclando una diversidad de tensioactivos,
y una mezcla tal de una diversidad de tensioactivos también podría
usarse. El procedimiento para calcular el HLB de los tensioactivos
es bien conocido, y se describe en, por ejemplo, Hiroshi Horiguchi,
"New Surfactants", 1986, Sankyo
Shuppan.
Shuppan.
Los ejemplos específicos preferidos de
tensioactivo incluyen el lauriléter de polioxietileno, el oleiléter
de polioxietileno, el éter de alcohol superior
(C_{4}-C_{35}) y polioxietileno, el
feniloctiléter de polioxietileno, el nonfeniléter de polioxietileno,
y similares, aunque el tensioactivo no está restringido a los
mismos.
Aunque la concentración del tensioactivo en el
segundo paso no está restringida, podría ser preferiblemente del
0,05 al 3% en peso, más preferiblemente del 0,1 al 1,5% en peso, en
base a la mezcla de reacción total.
En presencia del tensioactivo antes mencionado,
el colesterol de las HDL en la muestra de ensayo podría
cuantificarse enzimáticamente. Es decir, en el primer paso, se
elimina la mayoría del colesterol en lipoproteínas distintas de las
HDL, y, con el efecto sinergético con la reacción del segundo paso,
se cuantifica sólo el colesterol en las
HDL.
HDL.
El procedimiento para cuantificar enzimáticamente
el colesterol es bien conocido per se en el campo. Por
ejemplo, como en el primer paso, el colesterol podría cuantificarse
generando peróxido de hidrógeno a partir del éster de colesterol y
del colesterol libre por la acción de la esterasa de colesterol y de
la oxidasa de colesterol, y cuantificando el peróxido de hidrógeno
generado. La cuantificación del peróxido de hidrógeno podría
llevarse a cabo, por ejemplo, haciendo reaccionar el peróxido de
hidrógeno con un compuesto que forma un pigmento de quinona, y
midiendo la cantidad del pigmento de quinona generado midiendo la
absorbancia, etc. El pigmento de quinona podría formarse, por
ejemplo, haciendo reaccionar el peróxido de hidrógeno y la
4-aminoantipirina y el DAOS o HDAOS
(N-(2-hidroxisulfopropil)-3,5-dimetioxianilina).
El pigmento de quinona generado de este modo tiene la máxima
absorbancia a 593 nm cuando se usa el DAOS, y tiene la máxima
absorbancia a 583 nm cuando se usa el HDAOS. Aunque la concentración
del compuesto que rinde el pigmento de quinona no está restringida,
la concentración de 4-aminoantipirina, por ejemplo,
podría ser preferiblemente de 0,1 a 2,0 mM, más preferiblemente de
0,5 a 1,5 mM, y la concentración de DAOS o HDAOS podría ser
preferiblemente de 0,1 a 1,5 mM, más preferiblemente de 0,4 a 1,0
mM. Aunque la concentración de la peroxidasa no está restringida,
podría ser preferiblemente de 0,4 a 5 U/ml en la mezcla de reacción
total. Las condiciones de reacción preferidas (temperatura de
reacción, tiempo de reacción, tampón y pH) son las mismas que las
condiciones de reacción preferidas en el primer
paso.
paso.
En los casos en los que el peróxido de hidrógeno
generado se descompone con catalasa, en el segundo paso se usa un
inhibidor de catalasa, tal como la azida sódica, para inhibir la
catalasa, puesto que es necesario inhibir la catalasa en el segundo
paso.
La presente invención se describirá ahora más
concretamente por medio de ejemplos de la misma. Debería destacarse,
sin embargo, que la presente invención no está restringida a los
ejemplos siguientes. En los ejemplos siguientes, todos los "%"
están en peso, a menos que se especifique de otro modo.
Ejemplo de referencia
1
Usando muestras que contenían respectivamente
cantidades conocidas de HDL, LDL, VLDL y CM, se cuantificó
enzimáticamente el colesterol en cada una de las lipoproteínas en
presencia de un tensioactivo no iónico Emulgen 911 (noniléter de
polioxietileno, HLB 13,7), Emulgen B66 (derivado de polioxietileno,
HLB 13,2) o una mezcla de Emulgen B66 y Emulgen A90 (derivado de
polioxietileno, HLB 13,2), todos los cuales están disponibles
comercialmente en KAO CORPORATION. Esta operación se realizó como
sigue.
A una solución que contenía 0,5 U/ml de esterasa
de colesterol, 0,4 U/ml de oxidasa de colesterol, 0,5 U/ml de
peroxidasa, 1,0 mmol/l de 4-aminoantipirina y 0,5
mmol/l de HDAOS en tampón PIPES 50 mM, pH 7,0, se le añadió Emulgen
911 o Emulgen B66 hasta una concentración del 0,1% en peso, o se
añadió una mezcla de Emulgen B66/Emulgen A90 (9/1) hasta una
concentración del 1,3% en peso. Se mezclaron veinte microlitros de
cada muestra con 2,0 ml de la mezcla preparada de este modo, y la
mezcla resultante se dejó reaccionar a 37ºC durante 10 minutos,
seguida por la medición de la absorbancia a 600 nm.
Como resultado, la proporción de reacción (es
decir, la proporción de colesterol cuantificado del colesterol
total) era de aproximadamente el 95% para el colesterol en las HDL,
y aproximadamente del 18 al 22% para los colesteroles en otras
lipoproteínas.
A partir de esto, puede observarse que el Emulgen
911, el Emulgen B66 y la mezcla de Emulgen B66/Emulgen A90 se hallan
dentro del ámbito del término "tensioactivo que específicamente
actúa sobre lipoproteínas de elevada densidad".
Se prepararon los reactivos primeros y reactivos
segundos que tienen respectivamente las composiciones
siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
| Primeros reactivos | |
| Tampón PIPES, pH 7,0 | 100 mmol/l |
| HDAOS | 0,7 mmol/l |
| Esterasa de colesterol | 0,8 U/ml |
| Oxidasa de colesterol | 0,5 U/ml |
| Catalasa | 80 U/ml |
| Cloruro magnésico | 10 mmol/l |
| Segundos reactivos | |
| Tampón PIPES, pH 7,0 | 100 mmol/l |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l |
| Peroxidasa | 2,4 U/ml |
| Azida sódica | 0,1% |
| Emulgen B66 (HLB 13,2), disponible | |
| comercialmente en KAO CORPORATION | 0,3% |
\vskip1.000000\baselineskip
A cada una de las 4 muestras, que tenía un
volumen de 4 \mul y contenía respectivamente HDL, LDL, VLDL y CM
purificados a una concentración de 100 mg/dl, se les añadieron 300
\mul de los primeros reactivos antes mencionados, los cuales se
habían calentado previamente a 37ºC, y cada una de las mezclas
resultantes se dejó reaccionar a 37ºC durante 5 minutos. A
continuación, se añadieron 100 \mul de los segundos reactivos a
cada mezcla, y cada una de las resultantes se dejó reaccionar
durante 5 minutos, seguidos por la medición de la absorbancia de
cada mezcla de reacción a 600 nm. En base a las absorbancias
medidas, se calcularon las cantidades de colesterol, y se calculó la
proporción de la cantidad calculada de este modo respecto la
cantidad de colesterol en la muestra, la cual se define como
proporción de captura.
Mediante este procedimiento, el peróxido de
hidrógeno producido en el primer paso es descompuesto por la
catalasa. Por otra parte, el peróxido de hidrógeno generado en el
segundo paso forma un pigmento de quinona mediante la reacción con
HDAOS y 4-aminoantipirina. Los resultados de
muestran en la Tabla 1.
| Proporción de captura | |||
| CM | VLDL | LDL | HDL |
| < 1,0% | < 1,0% | < 1,0% | 86,6% |
Tal como se muestra en la Tabla 1, mediante el
procedimiento descrito más arriba, se cuantifica la mayoría del
colesterol. Por otra parte, el colesterol en las lipoproteínas
distintas de las HDL no es cuantificado sustancialmente. Por tanto,
puede observarse que el colesterol en las HDL puede cuantificarse
selectivamente mediante el procedimiento de la presente
invención.
El colesterol en las HDL en las muestras de
ensayo se cuantificó mediante el misma procedimiento que en el
Ejemplo 1, excepto que las muestras de ensayo eran sueros
procedentes de individuos normales. Por otra parte, el colesterol de
las HDL en las mismas muestras de ensayo se cuantificó mediante el
procedimiento de precipitación descrito en Clinical Tests,
23:121 (1979). La correlación entre los resultados obtenidos por
estos procedimientos se muestra en la Figura 1.
Tal como se muestra en la Figura 1, los
resultados de la cuantificación mediante estos procedimientos se
correspondían bien, por tanto, se probó que el colesterol en las HDL
puede cuantificarse con precisión mediante el procedimiento de la
presente invención.
Se repitió el mismo procedimiento que en el
Ejemplo 1, excepto que los reactivos primeros y segundos tenían
respectivamente las composiciones siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
| Primeros reactivos | |
| Tampón HEPES, pH 7,0 | 50 mmol/l |
| DAOS | 1,5 mmol/l |
| Esterasa de colesterol | 0,8 U/ml |
| Oxidasa de colesterol | 0,5 U/ml |
| Peroxidasa | 1,0 U/ml |
| Segundos reactivos | |
| Tampón HEPES, pH 7,0 | 50 mmol/l |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l |
| Emulgen 911 (HLB 13,7), disponible | |
| comercialmente en KAO CORPORATION | 0,3% |
Mediante este procedimiento, el peróxido de
hidrógeno producido en el primer paso reacciona con el DAOS, por
acción de la peroxidasa, para formar una quinona incolora. Por otra
parte, el peróxido de hidrógeno generado en el segundo reacciona con
el DAOS restante, procedente del primer paso, y con la
4-aminoantipirina añadida en el segundo paso, por
acción de la peroxidasa, para formar un pigmento de quinona. Los
resultados de muestran en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Proporción de captura | |||
| CM | VLDL | LDL | HDL |
| < 1,0% | < 1,0% | < 1,0% | 85,3% |
Tal como se muestra en la Tabla 2, mediante el
procedimiento descrito más arriba, se cuantifica la mayoría del
colesterol. Por otra parte, el colesterol en las lipoproteínas
distintas de las HDL no es cuantificado sustancialmente. Por tanto,
puede observarse que el colesterol en las HDL puede cuantificarse
selectivamente mediante el procedimiento de la presente
invención.
El colesterol en las HDL en muestras de ensayo se
cuantificó mediante el mismo procedimiento que en el Ejemplo 3,
excepto que las muestras de ensayo eran sueros de individuos
normales. Al igual que en el Ejemplo 2, el colesterol de las HDL en
las mismas muestras de ensayo se cuantificó mediante el
procedimiento de la precipitación. La correlación entre los
resultados obtenidos mediante estos procedimientos se muestra en la
Figura 2.
Tal como se muestra en la Figura 2, los
resultados de la cuantificación según estos procedimientos se
corresponden bien, por tanto, se probó que el colesterol en las HDL
puede cuantificarse con precisión mediante el procedimiento de la
presente invención.
Se prepararon reactivos primeros y segundos que
tenían respectivamente las composiciones siguientes.
| Primeros reactivos | |
| Tampón BES, pH 7,0 | 100 mmol/l |
| HDAOS | 0,7 mmol/l |
| Esterasa de colesterol | 0,8 U/ml |
| Oxidasa de colesterol | 0,5 U/ml |
| Catalasa | 100 U/ml |
| Cloruro magnésico | 18 mmol/l |
| Segundos reactivos | |
| Tampón BES, pH 7,0 | 100 mmol/l |
| 4-aminoantipirina | 4,0 mmol/l |
| Peroxidasa | 2,4 U/ml |
| Azida sódica | 0,1% |
| Emulgen B66 (HLB 13,2), disponible | |
| comercialmente en KAO CORPORATION | 1,17% |
| Emulgen A90 (HLB 14,5), disponible | |
| comercialmente en KAO CORPORATION | 0,13% |
A cada una de las 4 muestras, que tenía un
volumen de 4 \mul y contenía respectivamente HDL, LDL, VLDL y CM
purificados a una concentración de 100 mg/dl, se les añadieron 300
\mul de los primeros reactivos antes mencionados, los cuales se
habían calentado previamente a 37ºC, y cada una de las mezclas
resultantes se dejó reaccionar a 37ºC durante 5 minutos. A
continuación, se añadieron 100 \mul de los segundos reactivos a
cada mezcla, y cada una de las resultantes se dejó reaccionar
durante 5 minutos, seguidos por la medición de la absorbancia de
cada mezcla de reacción a 600 nm. En base a las absorbancias
medidas, se calcularon las cantidades de colesterol, y se calculó la
proporción de la cantidad calculada de este modo respecto la
cantidad de colesterol en la muestra, la cual se define como
proporción de captura.
Mediante este procedimiento, el peróxido de
hidrógeno producido en el primer paso es descompuesto por la
catalasa. Por otra parte, el peróxido de hidrógeno generado en el
segundo paso forma un pigmento de quinona mediante la reacción con
HDAOS y 4-aminoantipirina. Los resultados de
muestran en la Tabla 3.
| Proporción de captura | |||
| CM | VLDL | LDL | HDL |
| < 1,0% | < 1,0% | < 1,0% | 98,0% |
Tal como se muestra en la Tabla 3, mediante el
procedimiento descrito más arriba, se cuantifica la mayoría del
colesterol. Por otra parte, el colesterol en las lipoproteínas
distintas de las HDL no es cuantificado sustancialmente. Por tanto,
puede observarse que el colesterol en las HDL puede cuantificarse
selectivamente mediante el procedimiento de la presente
invención.
El colesterol en las HDL en las muestras de
ensayo se cuantificó mediante el misma procedimiento que en el
Ejemplo 5, excepto que las muestras de ensayo eran sueros
procedentes de individuos normales. Por otra parte, el colesterol de
las HDL en las mismas muestras de ensayo se cuantificó mediante el
procedimiento de precipitación descrito en Clinical Tests,
23:121 (1979). La correlación entre los resultados obtenidos por
estos procedimientos se muestra en la Figura 3.
Tal como se muestra en la Figura 3, los
resultados de la cuantificación mediante estos procedimientos se
correspondían bien, por tanto, se probó que el colesterol en las HDL
puede cuantificarse con precisión mediante el procedimiento de la
presente invención.
Claims (6)
1. Procedimiento para cuantificar el colesterol
en lipoproteínas de densidad elevada, que comprende un primer paso
de eliminación del colesterol en las lipoproteínas distintas de las
lipoproteínas de densidad elevada en una muestra de ensayo, y un
segundo paso de adición de un tensioactivo, el cual actúa
específicamente sobre las lipoproteínas de densidad elevada, al
producto de dicho primer paso, y cuantificar enzimáticamente el
colesterol en las lipoproteínas de densidad elevada.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde dicho primer paso comprende poner en contacto la muestra
de ensayo con colesterol esterasa y colesterol oxidasa en ausencia
de un tensioactivo que actúa sobre las lipoproteínas de densidad
elevada, y eliminar el peróxido de hidrógeno generado.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde dicho segundo paso comprende añadir dicho
tensioactivo que actúa específicamente sobre las lipoproteínas de
densidad elevada al producto de dicho primer paso, y cuantificar el
peróxido de hidrógeno generado por la acción del colesterol esterasa
y colesterol oxidasa.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
3, en donde dicho tensioactivo que actúa específicamente sobre las
lipoproteínas de densidad elevada tiene un HLD de
13-14.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4, en donde dicho tensioactivo que actúa específicamente sobre las
lipoproteínas de densidad elevada es un derivado óxido de
polialquileno.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en donde dicho primer paso se
lleva a cabo a un pH de 5-8.
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