JP2001224397A

JP2001224397A - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法

Info

Publication number: JP2001224397A
Application number: JP2000039992A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Matsui; 寛史松井; Kazue Mizuno; 和重水野; Kazuhiko Arai; 一彦新井; Katsuhiko Nishimura; 雄彦西村
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2001-08-21
Anticipated expiration: 2020-02-17
Also published as: JP4519239B2

Abstract

(57)【要約】【課題】第１工程でＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステ
ロールを消去し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定
量する測定方法において試料中の高ＴＧの影響を回避す
る方法を提供すること。【解決手段】被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ
蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次い
で、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工
程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレス
テロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミ
ンの存在下で行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、被検試料中の低密
度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】低密度リポ蛋白中のコレステロール（以
下、「ＬＤＬコレステロール」という）は血液中におけ
るコレステロール運搬の主役であり、特に粥状動脈硬化
において血管壁に沈着したコレステロールは主にＬＤＬ
に由来している。ＬＤＬの増加は動脈硬化性疾患の主要
な危険因子の１つであり、分別定量することは臨床上有
用である。

【０００３】従来からのＬＤＬコレステロールの定量方
法は、分画とコレステロール定量の２つの操作から求め
る方法と総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ト
リグリセリド値より求めるＦｒｉｅｄｅｗａｌｄ式によ
る演算方法がある。

【０００４】分画操作としては超遠心法、沈殿法、免疫
法等があるが、試料を遠心処理またはフィルター処理に
よる操作が必要となり、臨床検査の場において簡便性や
経済性において普及しにくい状況にあった。また、Ｆｒ
ｉｅｄｅｗａｌｄ式による演算方法もその使用に制限が
あり、かつ個体差を加味していないため正確性に問題が
あった。

【０００５】しかしながら、近年になり分画操作を要し
ないＬＤＬコレステロール定量方法（公開番号特開平1
1−318496）が報告され、現在、臨床検査用試薬として
検査の場で適用されつつある。この方法は、第１工程で
試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを選択
的に消去（消去とはエステル型コレステロールと遊離型
コレステロールを分解し、その分解物が第２工程で検出
されないようにすることを意味する）し、第２工程でＬ
ＤＬコレステロールを定量するものである。

【０００６】しかし、特殊な臨床検体においては、トリ
グリセリド（ＴＧ）値が異常高値を示すものについて負
の測定誤差を生じるという問題点があった。それ故に、
この問題点を回避することが測定法としての有用性を高
めることとなり、その方法が望まれている状況にあっ
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、第１
工程でＬＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールを消去
し、第２工程でＬＤＬコレステロールを定量する測定方
法において試料中の高ＴＧの影響を回避する方法を提供
することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは負の測定
誤差の原因について調査した結果、第１工程の消去時に
おいて試料中に高濃度のＴＧが存在すると、本来消去さ
れてはいけないＬＤＬ中コレステロールが消去され始め
ることを突き止めた。さらに高濃度ＴＧの存在はＴＧを
多く含むカイロミクロン(ＣＭ）、超低密度リポ蛋白
（ＶＬＤＬ）等のリポ蛋白が多く存在することを意味
し、これらが、ＬＤＬコレステロールの消去を誘発して
いることがわかった（ＬＤＬを含むこれらリポ蛋白は、
コレステロールやＴＧ、リン脂質、蛋白の集合体として
粒子系を形成しており、それぞれのリポ蛋白によって蛋
白の種類やコレステロール、ＴＧ量の違いがある）。

【０００９】具体的には、ＣＭとＶＬＤＬが試料中に存
在すると第１工程においてＣＭ、ＶＬＤＬ中のコレステ
ロールは分解し消去されるが、他の蛋白、リン脂質等の
残骸物は残る。そのため試料中のＣＭ、ＶＬＤＬ濃度が
高くなるにつれて、これら残骸物濃度も高くなり、一部
の残骸物のＬＤＬへの吸着も起こり始める。そして、吸
着したＬＤＬが、ＬＤＬ以外のリポ蛋白と認識され消去
が起こり始めることが明らかとなってきた。

【００１０】そこで、残骸物のＬＤＬへの吸着を抑える
方法について検討した結果、第１工程中にアルブミンを
添加することにより、残骸物がアルブミンに吸着され、
ＬＤＬへの影響を回避する事ができた。

【００１１】すなわち、本発明は、被検試料中の低密度
リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する
第１工程と、次いで、被検試料中の残存コレステロール
を定量する第２工程とから成る、被検試料中の低密度リ
ポ蛋白中のコレステロールの定量方法において、前記第
１工程をアルブミンの存在下で行うことを特徴とする方
法を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】リポ蛋白中に含まれるコレステロ
ールとしては、エステル型コレステロール（コレステロ
ールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明
細書において、単に「コレステロール」という場合に
は、これらの両者を包含する。

【００１３】本発明の方法に供される被検試料として
は、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等のリポ蛋白を
含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、
例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げ
ることができるがこれらに限定されるものではない。

【００１４】本発明の方法は、第１工程及び第２工程か
ら成り、第１工程では被検試料中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ及
びＣＭ中のコレステロールを消去し、続く第２工程で
は、被検試料中の残存コレステロールを定量する。第１
工程でＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールが
消去されているので、第２工程で定量されるコレステロ
ールは、主として被検試料中のＬＤＬ中のコレステロー
ルである。

【００１５】第１工程における「消去」とは、コレステ
ロールを分解し、かつ、その分解産物が次の第２工程で
検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外の
リポ蛋白、すなわち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等に含ま
れるコレステロールを選択的に消去する方法としては以
下の方法を挙げることができる。

【００１６】すなわち、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白
に作用する界面活性剤の存在下において、コレステロー
ルエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用
させ、生じた過酸化水素を消去する。

【００１７】過酸化水素を消去する方法としては、カタ
ラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペル
オキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素
供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転
化する方法を挙げることができるが、これらに限定され
るものではない。

【００１８】第１工程の反応液中のコレステロールエス
テラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好まし
く、由来としてはシュードモナス属細菌から生成される
ものが効果的である。また、コレステロールオキシダー
ゼの濃度は０．１〜０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、
細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さら
に、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好
ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合
のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが
好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合
物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好まし
い。

【００１９】第１工程で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ
蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ
値が１３以上１５以下、好ましくは１３以上１４以下で
あるポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることがで
きる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級
脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキル
アミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アル
キルフェノール縮合物を挙げることができる。なお、界
面活性剤のＨＬＢ算出方法は周知であり、例えば「新界
面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版に記載さ
れている。

【００２０】ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキ
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例としては、ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン
セチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリ
オキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシ
エチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以
上１５以下の化合物を挙げることができるがこれらに限
定されるものではない。

【００２１】第１工程で用いられる上記界面活性剤の濃
度は、０．１〜１０ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ま
しくは０．５〜５．０ｇ／ｌ程度である。

【００２２】第１工程は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行う
ことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノー
ルアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好
ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｐ
ＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰ
ＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度
が好ましい。

【００２３】第１工程で、ＬＤＬとの反応を抑え、他の
リポ蛋白の消去をさらに高めるために、反応液中に２価
の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとし
ては銅イオン、鉄イオン及びマグネシウムイオンを使用
することができるが、特にマグネシウムイオンが好まし
い。２価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好
ましい。

【００２４】なお、第１工程の反応液中には、任意的
に、リポ蛋白分解酵素を加えることもできる。この酵素
を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロール
が反応しやすくなるので好ましい。この酵素の反応液中
濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。

【００２５】第１工程の反応温度は３０〜４０℃程度が
適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は
２〜１０分間程度でよい。

【００２６】本発明の方法では、第１工程をアルブミン
の存在下で行う。アルブミンは、アルブミンであれば何
ら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販の
アルブミンを好適に用いることができる。アルブミンの
起源は何ら限定されるものではなく、ヒト、ウシ、ブ
タ、ウマ等いずれの動物であってもよく、特に、広く用
いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることが
できる。第１工程の反応溶液中の前記アルブミンの濃度
は0.1〜5.0 g/dLが好ましく、0.3〜3.0 g/dLがさらに好
ましい。

【００２７】続く第２工程では、被検試料中の残存コレ
ステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬ
ＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコ
レステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することによ
り行なうことができる。ここで、少なくともＬＤＬに作
用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界
面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活
性剤であってもよい。

【００２８】全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好
ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上１３未満、好まし
くは１２以上１３未満であるポリアルキレンオキサイド
誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級
アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミ
ド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメ
ルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げる
ことができる。

【００２９】ＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキ
レンオキサイド誘導体の好ましい具体例として、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセ
チルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、
ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキ
シエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１
３未満の化合物を挙げることができるがこれらに限定さ
れるものではない。

【００３０】また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面
活性剤として、陰イオン界面活性剤を挙げることができ
る。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、特
に限定されないが、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状又
は分枝状アルキル基が結合したものを有するものが好ま
しい。ここで、芳香環は、ベンゼン、ナフタレン、ジフ
ェニール等のように炭素と水素のみから成るものが好ま
しい。さらに、上記芳香環にスルホン酸塩のような親水
基が結合したものが好ましい。このような好ましい陰イ
オン界面活性剤の例を下記式（I）ないし（V）に示す。

【００３１】

【化１】

【００３２】

【化２】

【００３３】

【化３】

【００３４】

【化４】

【００３５】

【化５】

【００３６】但し、式（I）〜（V）において、Ｒは炭素
数４〜１８の直鎖状又は分枝状アルキル基を示す。ま
た、第２工程で用いられる好ましい陰イオン界面活性剤
として、高級アルコール硫酸ナトリウム等を挙げること
ができる。第２工程で用いられる界面活性剤の濃度は、
０．１〜１００ｇ／ｌ程度が好ましく、さらに好ましく
は１〜５０ｇ／ｌ程度である。

【００３７】第２工程のその他の好ましい反応条件は、
第１工程における好ましい反応条件と同様である。

【００３８】以下、本発明の実施例に基づき具体的に説
明する。もっとも本発明は下記実施例に限定されるもの
ではない。

【００３９】（試薬）次の組成からなるＬＤＬコレステ
ロール定量試薬を調製した。さらに第１試薬にウシ血清
由来のアルブミンを１．０ｇ/ｄＬ添加した試薬も調製
し、２種類の試薬で効果の確認を行った（第２試薬は共
通に使用）。

【００４０】第１試薬 PIPES緩衝液 pH7.0 50 mmol/L HDAOS 0.7 mmol/L コレステロールエステラーゼ 0.8 U/mL コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/mL カタラーゼ 80 U/mL 塩化マグネシウム 10 mmol/L 界面活性剤エマルゲンＢ６６(花王社製） 0.2 %

【００４１】第２試薬 PIPES緩衝液 pH7.0 50 mmol/L ４−アミノアンチピリン 4.0 mmol/L ペルオキシダーゼ 2.4 単位/mL アジ化ナトリウム 0.1 % TritonX100 3.0 %

【００４２】（試料）ＣＭ試料として６種類調製、それ
ぞれ６種類の試料は全てＬＤＬコレステロール濃度を同
じとし、ＣＭ濃度だけを変えたものとした（ＣＭの濃度
差はＴＧ値として示した）。ＶＬＤＬ試料もＣＭ試料と
同様に６種類調製した。

【００４３】（測定方法）試料各4μLに、あらかじめ３
７℃に加温した第１試薬３００μLを混和し、３７℃で
５分間反応させた後に、第２試薬１００μLを加え５分
間反応させ６００ｎｍにおける吸光度を測定した。測定
された吸光度から事前に測定していた既知濃度試料の吸
光度と比較を行い、ＬＤＬコレステロール濃度を算出し
た。

【００４４】

【表１】ＣＭの影響 (単位:mg/dL)

【００４５】表1に示されるように、アルブミンを添加
した試薬はＣＭの濃度が上昇しても測定値の低下とはな
らず、影響を回避していることがわかる。

【００４６】

【表２】ＶＬＤＬの影響 (単位:mg/dL)

【００４７】表２のＶＬＤＬについてもＣＭと同様にア
ルブミンの効果が十分に確認できる。

【００４８】

【発明の効果】本発明の方法によれば、アルブミンを添
加することにより、他のリポ蛋白の影響を回避でき、従
来方法に比べより高精度にＬＤＬ中のコレステロールを
定量することができるという効果が奏される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者新井一彦新潟県五泉市大字木越字鏡田1359番１デンカ生研株式会社鏡田工場内 (72)発明者西村雄彦東京都中央区日本橋茅場町三丁目４番２号デンカ生研株式会社内Ｆターム(参考） 2G045 AA13 BA01 BB29 CA25 CA26 DA64 DA69 DB21 FB01 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ76 QQ89 QR03 QR12 QR41 QR48 QR51 QS20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ
蛋白中のコレステロールを消去する第１工程と、次い
で、被検試料中の残存コレステロールを定量する第２工
程とから成る、被検試料中の低密度リポ蛋白中のコレス
テロールの定量方法において、前記第１工程をアルブミ
ンの存在下で行うことを特徴とする方法。
【請求項２】前記第１工程の反応溶液中の前記アルブ
ミンの濃度は0.1〜5.0 g/dLである請求項１記載の方
法。
【請求項３】前記第１工程の反応は、ｐＨ５〜９、温
度３０〜４０℃で行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】前記第１工程は、低密度リポ蛋白以外の
リポ蛋白に作用する界面活性剤の存在下において、コレ
ステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することから成
る、請求項１記載の方法。
【請求項５】前記第２工程は、前記第１工程の産物
に、少なくとも低密度リポ蛋白に作用する界面活性剤を
加え、前記コレステロールエステラーゼ及びコレステロ
ールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量
することから成る、請求項４記載の方法。
【請求項６】前記少なくとも低密度リポ蛋白と作用す
る界面活性剤は、全てのリポ蛋白に作用するものである
請求項５記載の方法。
【請求項７】前記第１工程で用いられる、低密度リポ
蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値
が１３以上１５以下であるポリアルキレンオキサイド誘
導体である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項８】前記第２工程で用いられる、全てのリポ
蛋白に作用する界面活性剤は、ＨＬＢ値が１１以上１３
未満であるポリアルキレンオキサイド誘導体である請求
項５記載の方法。