JP5112861B2 - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5112861B2 JP5112861B2 JP2007514809A JP2007514809A JP5112861B2 JP 5112861 B2 JP5112861 B2 JP 5112861B2 JP 2007514809 A JP2007514809 A JP 2007514809A JP 2007514809 A JP2007514809 A JP 2007514809A JP 5112861 B2 JP5112861 B2 JP 5112861B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- carbon atoms
- cholesterol
- linear
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。その中で、ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
【０００３】
従来のＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと略記する）の測定法は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。
【０００４】
近年、上記の問題を解決するために、種々の測定法が報告されている。例えば、血清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、および、胆汁酸塩または胆汁酸誘導体またはジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ中のコレステロールをＨＤＬコレステロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリオキシエチレンオキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、ＨＤＬコレステロールと当該酵素とを反応させ、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別定量する方法（特許文献１参照）、血清を、特定のｐＨおよび特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献２参照）が知られている。特許文献２に記載の測定法では、まず、ＬＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、次いで、ＨＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、ＨＤＬコレステロールの測定が可能となる。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要し、また、必ずしも、ＨＤＬコレステロールに特異的な測定法ではなかった。
【０００５】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えばデキストラン硫酸等のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法（特許文献３参照）、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特許文献４参照）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特許文献５参照）、血清または血漿を、リポ蛋白分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価陽イオンとの組み合わせ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献６参照）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるＨＤＬコレステロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等の問題がある。
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させずにＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えば生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとを、胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン存在下に反応させ、当該酵素反応により消費または生成する化合物を測定することによる生体試料中のＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献７参照）、ＨＤＬ画分に対して反応選択性をもつＨＬＢ値が１６以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼならびにコレステロール酸化酵素とを反応させて、検体中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献８参照）等が知られている。また、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、ＨＤＬコレステロールを酵素的に測定する方法（特許文献９参照）も知られている。
【０００７】
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロールの測定法においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールの不完全な消去や、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
また、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロールの測定法として、検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中のＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献１０参照）や、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献１１参照）が知られている。
【特許文献１】
特開昭６２−６９９９９号公報
【特許文献２】
特開昭６３−１２６４９８号公報
【特許文献３】
特開平８−１３１１９７号公報
【特許文献４】
特開平８−２０１３９３号公報
【特許文献５】
特開平９−２８５２９８号公報
【特許文献６】
特開平８−１１６９９６号公報
【特許文献７】
国際公開第９７／４０３７６号パンフレット
【特許文献８】
国際公開第００／５２４８０号パンフレット
【特許文献９】
特開平９−２９９号公報
【特許文献１０】
国際公開第２００４／０３５８１６号パンフレット
【特許文献１１】
国際公開第２００４／０３５８１７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な測定ができるＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討し、アミンまたはアンモニウム塩の構造を有する特定の含窒素界面活性剤およびポリアニオンの共存下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素がＨＤＬに特異的に作用するという知見を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１３）に関する。
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
（２）水性媒体が、さらにアルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する前記（１）記載の方法。
（３）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（１）または（２）記載の方法。
（４）一般式（Ｉ）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００１６】
【化４】
【００１７】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（５）一般式（Ｉ）
【００１８】
【化５】
【００１９】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２０】
【化６】
【００２１】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、および、酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（６）さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する前記（５）記載の試薬。
（７）さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する前記（４）〜（６）のいずれかに記載の試薬。
（８）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（４）〜（７）のいずれかに記載の試薬。
（９）第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
【００２２】
【化７】
【００２３】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２４】
【化８】
【００２５】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリアニオンを第一試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキット。
（１０）第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
【００２６】
【化９】
【００２７】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基、または、炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２８】
【化１０】
【００２９】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリアニオンを第一試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキット。
（１１）さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する前記（１０）記載のキット。
（１２）さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する前記（９）〜（１１）のいずれかに記載のキット。
（１３）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（９）〜（１２）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、簡便で、かつ、正確なＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬、および、測定用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、かつ、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを凝集させることなく、ＨＤＬコレステロールを測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿および血清が好ましい。
【００３２】
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
【００３３】
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ３１１；東洋紡製社製）、リポプロテインリパーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、４３ｋＤａエステラーゼ（天野エンザイム社製）、４０ｋＤａエステラーゼ（天野エンザイム社製）、ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２（天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ［ＣＯＥ３１３（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製］等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３４】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
【００３５】
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。
【００３６】
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（ＤＴＰＡ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）等が挙げられる。
【００３７】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
【００３８】
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Ａｍａｎｏ”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＰＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ協和（協和醗酵社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
【００４０】
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Ａｍａｎｏ”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４１】
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ等が挙げられる。
【００４２】
本発明においては、ポリアニオンと共に、一般式（Ｉ）
【００４３】
【化１１】
【００４４】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質［以下、化合物（Ｉ）という］、または、一般式（ＩＩ）
【００４５】
【化１２】
【００４６】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基としては、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等の基が挙げられ、炭素数８〜２４のアルキル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルキル基であることがより好ましい。
【００４７】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルケニル基としては、例えばヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられ、炭素数８〜２４のアルケニル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルケニル基であることがより好ましい。
【００４８】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数１〜２４のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜１８のアルキル基であることがより好ましい。
【００４９】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、メチル、エチル、プロピル基のいずれかであることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数２〜３０のアルケニル基としては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられ、炭素数２〜２４のアルケニル基であることが好ましく、炭素数２〜１８のアルケニル基であることがより好ましい。
【００５０】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基としては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられ、ビニル、プロペニル基のいずれかであることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。
化合物（Ｉ）における陰イオンとしては、例えば水酸イオン、ハロゲンイオン、無機酸由来の陰イオン、有機酸由来の陰イオン等があげられる。ハロゲンイオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等が挙げられる。無機酸由来の陰イオンとしては、例えば硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン等が挙げられる。有機酸由来の陰イオンとしては、例えばギ酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、グルタミン酸イオン等のカルボン酸イオン等が挙げられる。
【００５１】
なお、一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４が共にメチルを表し、Ｘは陰イオンを表す化合物が好ましい。
化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えばカチオンＡＢ、カチオンＢＢ、カチオン２ＡＢＴ、カチオン２ＤＢ−５００Ｅ、カチオン２−ＯＬＲ（いずれも日本油脂社製）等が挙げられる。化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばアミンＢＢ、アミンＡＢ、アミン２−ＯＬＲ、３級アミンＢＢ、３級アミンＦＢ（いずれも日本油脂社製）等が挙げられる。
【００５２】
化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．００１〜０．１％がより好ましい。
本発明において用いられるポリアニオンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸またはその塩、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が４万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを２種以上用いてもよい。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるポリアニオンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
【００５３】
本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
【００５４】
本発明において使用されるポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンとしては、例えば一般式（ＩＩＩ）
【００５５】
【化１３】
【００５６】
［式中、Ｒ８は直鎖または分岐状のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ９は水素原子または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨを表し、ｍおよびｎは同一または異なって、１〜１００の整数を表し、ｍ＋ｎは２〜２００の整数である］で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が挙げられる。化合物（ＩＩＩ）におけるアルキル基およびアルケニル基としては、それぞれ、例えば前述の直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基、前述の直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルケニル基等が挙げられ、炭素数８〜２４のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルキル基またはアルケニル基であることがより好ましい。
【００５７】
ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの具体例（製品）としては、例えばナイミーンＬ２０１（オキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＬ２０７（ポリオキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＳ２０４、ナイミーンＳ２１０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本油脂社製）、ニューコールＯＤ４２０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ３１０４（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３１１０（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３６０５［ポリオキシエチレンアルキル（大豆）アミン；竹本油脂社製］、パイオニンＤ３６１５Ｔ［ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；竹本油脂社製］、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｏ２０９（ポリオキシエチレンオレイルアミノエーテル；青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５（ポリオキシエチレンラウリルアミノエーテル；青木油脂社製）等が挙げられる。
【００５８】
ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるオキシエチレン鎖の重合度は、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜６０である。本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンを２種類以上用いても良い。ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．００１〜０．１％がより好ましい。
【００５９】
本発明のＨＤＬコレステロール測定方法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００６０】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００６１】
以下に、本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを具体的に説明する。
（ＨＤＬコレステロールの測定方法）
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法が挙げられる。
【００６２】
測定方法
（１）検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、化合物（Ｉ）もしくは化合物（ＩＩ）およびポリアニオンを含有し、必要に応じ、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する水性媒体中で反応させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
【００６３】
本測定法においては、（１）の反応は、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。
生成した過酸化水素の量は、例えば直接過酸化水素電極で測定することもできるが、過酸化水素測定用試薬により測定することもできる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等があげられる。
【００６４】
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。
【００６５】
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００６６】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。
２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００６７】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００〜５００ｎｍが好ましく、３３０〜４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
【００６８】
還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
【００６９】
（ＨＤＬコレステロール測定用試薬）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有し、必要に応じて、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を含有する。
【００７０】
該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬や、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬が好ましい。
【００７１】
また、該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬が特に好ましい。
【００７２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有し、必要に応じて、還元型補酵素測定用試薬、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を含有する。
【００７３】
該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬や、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬が好ましい。
【００７４】
また、該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有するものが特に好ましい。
【００７５】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬が挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、便宜上、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を以下「化合物Ａ」といい、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を以下「化合物Ｂ」という。本発明の測定用試薬においては、化合物Ａを１つまたは複数用いることができ、化合物Ｂを１つまたは複数用いることができる。
【００７６】
試薬１
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
【００７７】
試薬３
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
試薬４
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【００７８】
試薬５
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬６
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
【００７９】
（ＨＤＬコレステロール測定用キット）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれであってもよいが、２試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好ましい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
【００８０】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質（化合物Ａ）は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬に含有されることが好ましい。ポリアニオンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬に含有されることが好ましい。
アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質（化合物Ｂ）は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
【００８１】
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様、すなわち、過酸化水素測定用試薬が第一試薬および第二試薬の両方に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。
【００８２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット２
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８３】
キット３
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット４
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８４】
キット５
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
化合物Ｂ、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット６
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
化合物Ｂ、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８５】
キット７
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット８
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８６】
キット９
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット１０
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８７】
キット１１
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
化合物Ｂ、コレステロール脱水素酵素
キット１２
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８８】
キット１３
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット１４
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８９】
キット１５
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット１６
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００９０】
キット１７
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素第二試薬
化合物Ｂ、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット１８
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
化合物Ｂ、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００９１】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬およびキットにおいては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法において挙げられた、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、ポリアニオン、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
【００９２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
【００９３】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＨＤＬコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１２００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．０２〜６００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
【００９４】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜３％となる含量が好ましく、０．００１〜０．３％となる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリアニオンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜３０％となる含量が好ましく、０．０１〜３％となる含量がより好ましい。
【００９５】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜３０％となる含量が好ましく、０．０１〜３％となる含量がより好ましい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜３％となる含量が好ましく、０．００１〜０．３％となる含量がより好ましい。
【００９６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および酵素を使用した。
ＨＥＰＥＳ（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、アミンＢＢ（ドデシルアミン；日本油脂社製）、３級アミンＢＢ（ドデシルジメチルアミン；日本油脂社製）、カチオンＢＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド；日本油脂社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（ファルマシア社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；プロライアント社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、４３ｋＤａエステラーゼ（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＣＨＯＰＥ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５（ポリオキシエチレンラウリルアミノエーテル；青木油脂社製）。
【実施例１】
【００９７】
以下の第一試薬（試薬Ａ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
アミンＢＢ ０．１ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例２】
【００９８】
以下の第一試薬（試薬Ｂ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
３級アミンＢＢ ０．０３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例３】
【００９９】
以下の第一試薬（試薬Ｃ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例４】
【０１００】
以下の第一試薬（試薬Ｄ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例５】
【０１０１】
以下の第一試薬（試薬Ｃ）および第二試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ｇ／Ｌ
【実施例６】
【０１０２】
以下の第一試薬（試薬Ｄ）および第二試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ｇ／Ｌ
【０１０３】
比較例１
以下の第一試薬（試薬Ｅ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例７】
【０１０４】
実施例１のキットを用いて、ヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＨＤＬコレステロール濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）および血清（ＨＤＬコレステロール濃度：８０．０ｍｇ／ｄＬ）を、実施例１のキットを用いて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置により、ＨＤＬコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
【０１０５】
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１およびＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（２μＬ）と第一試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体と実施例１のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
（３）ヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度の測定
（２）で算出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。
【実施例８】
【０１０６】
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例９】
【０１０７】
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１０】
【０１０８】
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１１】
【０１０９】
実施例１のキットの代わりに実施例５のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１２】
【０１１０】
実施例１のキットの代わりに実施例６のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【０１１１】
比較例２
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【０１１２】
次に、実施例７〜１２および比較例２の測定において用いたヒト血清３０検体を用いて、クリニカルケミストリー第４５巻、１０号（１９９９年）に記載されたＤＣＭ法（ＤｅｓｉｇｎａｔｅｄＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）により当該検体中のＨＤＬコレステロールを測定し、各実施例および比較例での測定値と比較した。各実施例および比較例それぞれの測定と、ＤＣＭ法による測定との相関係数を第１表に示す。
【０１１３】
【表１】
【０１１４】
第１表の比較例２と実施例７〜１２との比較から、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）とポリアニオンとを含有するキットを用いた測定において、ＤＣＭとの良好な相関関係が認められることが判明した。さらに、実施例９と実施例１０〜１２との比較から、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）とポリアニオンの他に、アルブミンまたはポリオキシエチレンアルキルアミンを共存させることによりＤＣＭとの相関係数がより向上することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、動脈硬化などの疾患の診断に有用なＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットが提供される。
【０００１】
本発明は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、カイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。その中で、ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
【０００３】
従来のＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと略記する）の測定法は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。
【０００４】
近年、上記の問題を解決するために、種々の測定法が報告されている。例えば、血清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、および、胆汁酸塩または胆汁酸誘導体またはジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、ＶＬＤＬおよびＬＤＬ中のコレステロールをＨＤＬコレステロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリオキシエチレンオキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、ＨＤＬコレステロールと当該酵素とを反応させ、ＨＤＬコレステロールを特異的に分別定量する方法（特許文献１参照）、血清を、特定のｐＨおよび特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献２参照）が知られている。特許文献２に記載の測定法では、まず、ＬＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、次いで、ＨＤＬコレステロールと当該酵素との反応が進行し、ＨＤＬコレステロールの測定が可能となる。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要し、また、必ずしも、ＨＤＬコレステロールに特異的な測定法ではなかった。
【０００５】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えばデキストラン硫酸等のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法（特許文献３参照）、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特許文献４参照）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特許文献５参照）、血清または血漿を、リポ蛋白分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価陽イオンとの組み合わせ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献６参照）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるＨＤＬコレステロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等の問題がある。
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させずにＨＤＬコレステロールを測定する方法としては、例えば生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとを、胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン存在下に反応させ、当該酵素反応により消費または生成する化合物を測定することによる生体試料中のＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献７参照）、ＨＤＬ画分に対して反応選択性をもつＨＬＢ値が１６以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼならびにコレステロール酸化酵素とを反応させて、検体中のＨＤＬコレステロールを測定する方法（特許文献８参照）等が知られている。また、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、ＨＤＬコレステロールを酵素的に測定する方法（特許文献９参照）も知られている。
【０００７】
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロールの測定法においては、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中コレステロールの不完全な消去や、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
また、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させないＨＤＬコレステロールの測定法として、検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中のＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献１０参照）や、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの測定方法（特許文献１１参照）が知られている。
【特許文献１】
特開昭６２−６９９９９号公報
【特許文献２】
特開昭６３−１２６４９８号公報
【特許文献３】
特開平８−１３１１９７号公報
【特許文献４】
特開平８−２０１３９３号公報
【特許文献５】
特開平９−２８５２９８号公報
【特許文献６】
特開平８−１１６９９６号公報
【特許文献７】
国際公開第９７／４０３７６号パンフレット
【特許文献８】
国際公開第００／５２４８０号パンフレット
【特許文献９】
特開平９−２９９号公報
【特許文献１０】
国際公開第２００４／０３５８１６号パンフレット
【特許文献１１】
国際公開第２００４／０３５８１７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な測定ができるＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討し、アミンまたはアンモニウム塩の構造を有する特定の含窒素界面活性剤およびポリアニオンの共存下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素がＨＤＬに特異的に作用するという知見を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１３）に関する。
（１）検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化２】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ならびに、ポリアニオンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
（２）水性媒体が、さらにアルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する前記（１）記載の方法。
（３）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（１）または（２）記載の方法。
（４）一般式（Ｉ）
【００１４】
【化３】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００１６】
【化４】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（５）一般式（Ｉ）
【００１８】
【化５】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２０】
【化６】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、および、酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
（６）さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する前記（５）記載の試薬。
（７）さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する前記（４）〜（６）のいずれかに記載の試薬。
（８）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（４）〜（７）のいずれかに記載の試薬。
（９）第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
【００２２】
【化７】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２４】
【化８】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリアニオンを第一試薬に含有し、コレステロール酸化酵素を第二試薬に含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキット。
（１０）第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
【００２６】
【化９】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基、または、炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質、および、一般式（ＩＩ）
【００２８】
【化１０】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、および、ポリアニオンを第一試薬に含有し、コレステロール脱水素酵素を第二試薬に含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有し、コレステロールエステル加水分解酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とするキット。
（１１）さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する前記（１０）記載のキット。
（１２）さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する前記（９）〜（１１）のいずれかに記載のキット。
（１３）ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である前記（９）〜（１２）のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００３０】
本発明により、簡便で、かつ、正確なＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬、および、測定用キットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、かつ、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを凝集させることなく、ＨＤＬコレステロールを測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿および血清が好ましい。
【００３２】
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
【００３３】
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ３１１；東洋紡製社製）、リポプロテインリパーゼ“Ａｍａｎｏ”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、４３ｋＤａエステラーゼ（天野エンザイム社製）、４０ｋＤａエステラーゼ（天野エンザイム社製）、ＥＳＴ“Ａｍａｎｏ”２（天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ［ＣＯＥ３１３（化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製］等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３４】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。
【００３５】
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。
【００３６】
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（ＤＴＰＡ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学社製）等が挙げられる。
【００３７】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝液）に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
【００３８】
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Ａｍａｎｏ”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯＰＥ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ協和（協和醗酵社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
【００３９】
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
【００４０】
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Ａｍａｎｏ”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
【００４１】
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤＰ等が挙げられる。
【００４２】
本発明においては、ポリアニオンと共に、一般式（Ｉ）
【００４３】
【化１１】
（式中、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なって、それぞれ直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基または炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘは陰イオンを表す）で表される物質［以下、化合物（Ｉ）という］、または、一般式（ＩＩ）
【００４５】
【化１２】
（式中、Ｒ５は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される物質［以下、化合物（ＩＩ）という］が使用される。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基としては、例えばヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等の基が挙げられ、炭素数８〜２４のアルキル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルキル基であることがより好ましい。
【００４７】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルケニル基としては、例えばヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられ、炭素数８〜２４のアルケニル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルケニル基であることがより好ましい。
【００４８】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられ、炭素数１〜２４のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜１８のアルキル基であることがより好ましい。
【００４９】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、メチル、エチル、プロピル基のいずれかであることが好ましく、メチル基であることがより好ましい。
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数２〜３０のアルケニル基としては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、エイコセニル、ヘンエイコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニル等が挙げられ、炭素数２〜２４のアルケニル基であることが好ましく、炭素数２〜１８のアルケニル基であることがより好ましい。
【００５０】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）における直鎖または分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基としては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル等が挙げられ、ビニル、プロペニル基のいずれかであることが好ましく、ビニル基であることがより好ましい。
化合物（Ｉ）における陰イオンとしては、例えば水酸イオン、ハロゲンイオン、無機酸由来の陰イオン、有機酸由来の陰イオン等があげられる。ハロゲンイオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等が挙げられる。無機酸由来の陰イオンとしては、例えば硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン等が挙げられる。有機酸由来の陰イオンとしては、例えばギ酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、グルタミン酸イオン等のカルボン酸イオン等が挙げられる。
【００５１】
なお、一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ２は、直鎖または分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基または炭素数２〜３０のアルケニル基を表し、Ｒ３およびＲ４が共にメチルを表し、Ｘは陰イオンを表す化合物が好ましい。
化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えばカチオンＡＢ、カチオンＢＢ、カチオン２ＡＢＴ、カチオン２ＤＢ−５００Ｅ、カチオン２−ＯＬＲ（いずれも日本油脂社製）等が挙げられる。化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばアミンＢＢ、アミンＡＢ、アミン２−ＯＬＲ、３級アミンＢＢ、３級アミンＦＢ（いずれも日本油脂社製）等が挙げられる。
【００５２】
化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）の濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．００１〜０．１％がより好ましい。
本発明において用いられるポリアニオンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、例えばデキストラン硫酸もしくはその塩、ヘパリンもしくはその塩、リンタングステン酸またはその塩、硫酸化シクロデキストリンまたはその塩、硫酸化オリゴ糖またはその塩等が挙げられるが、デキストラン硫酸もしくはその塩が好ましい。デキストラン硫酸としては、例えば分子量が４万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万等のデキストラン硫酸が挙げられる。硫酸化オリゴ糖としては、例えば硫酸化アガロース、硫酸化トレハロース、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。また、本発明においては、ポリアニオンを２種以上用いてもよい。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるポリアニオンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
【００５３】
本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のＨＤＬコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜１％がより好ましい。
【００５４】
本発明において使用されるポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンとしては、例えば一般式（ＩＩＩ）
【００５５】
【化１３】
［式中、Ｒ８は直鎖または分岐状のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ９は水素原子または（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨを表し、ｍおよびｎは同一または異なって、１〜１００の整数を表し、ｍ＋ｎは２〜２００の整数である］で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ）という］が挙げられる。化合物（ＩＩＩ）におけるアルキル基およびアルケニル基としては、それぞれ、例えば前述の直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基、前述の直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルケニル基等が挙げられ、炭素数８〜２４のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましく、炭素数１０〜１８のアルキル基またはアルケニル基であることがより好ましい。
【００５７】
ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの具体例（製品）としては、例えばナイミーンＬ２０１（オキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＬ２０７（ポリオキシエチレンドデシルアミン；日本油脂社製）、ナイミーンＳ２０４、ナイミーンＳ２１０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本油脂社製）、ニューコールＯＤ４２０（ポリオキシエチレンオクタデシルアミン；日本乳化剤社製）、パイオニンＤ３１０４（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３１１０（ポリオキシエチレンラウリルアミン；竹本油脂社製）、パイオニンＤ３６０５［ポリオキシエチレンアルキル（大豆）アミン；竹本油脂社製］、パイオニンＤ３６１５Ｔ［ポリオキシエチレンアルキル（牛脂）アミン；竹本油脂社製］、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｏ２０９（ポリオキシエチレンオレイルアミノエーテル；青木油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５（ポリオキシエチレンラウリルアミノエーテル；青木油脂社製）等が挙げられる。
【００５８】
ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるオキシエチレン鎖の重合度は、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜６０である。本発明においては、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンを２種類以上用いても良い。ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンの濃度としては、本発明のＨＤＬコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．００１〜０．１％がより好ましい。
【００５９】
本発明のＨＤＬコレステロール測定方法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
【００６０】
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００６１】
以下に、本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを具体的に説明する。
（ＨＤＬコレステロールの測定方法）
本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法が挙げられる。
【００６２】
測定方法
（１）検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、化合物（Ｉ）もしくは化合物（ＩＩ）およびポリアニオンを含有し、必要に応じ、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する水性媒体中で反応させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、
（２）生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
（３）（２）で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のＨＤＬコレステロール濃度を算出することにより、検体中のＨＤＬコレステロールを測定することができる。
【００６３】
本測定法においては、（１）の反応は、例えば１０〜５０℃で、好ましくは２０〜４０℃で、１〜６０分間、好ましくは２〜３０分間行う。
生成した過酸化水素の量は、例えば直接過酸化水素電極で測定することもできるが、過酸化水素測定用試薬により測定することもできる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等があげられる。
【００６４】
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。
【００６５】
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。
【００６６】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。
２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
【００６７】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてペルオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等が挙げられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、３００〜５００ｎｍが好ましく、３３０〜４００ｎｍがより好ましく、３４０ｎｍ付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬が挙げられる。電子キャリアーとしては、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート等が挙げられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
【００６８】
還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。
【００６９】
（ＨＤＬコレステロール測定用試薬）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有し、必要に応じて、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を含有する。
【００７０】
該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬や、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬が好ましい。
【００７１】
また、該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬が特に好ましい。
【００７２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有し、必要に応じて、還元型補酵素測定用試薬、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を含有する。
【００７３】
該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬や、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬が好ましい。
【００７４】
また、該測定用試薬としては、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる少なくとも一つの物質、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質、ポリアニオン、アルブミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有するものが特に好ましい。
【００７５】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬が挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、便宜上、化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を以下「化合物Ａ」といい、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質を以下「化合物Ｂ」という。本発明の測定用試薬においては、化合物Ａを１つまたは複数用いることができ、化合物Ｂを１つまたは複数用いることができる。
【００７６】
試薬１
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬２
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
【００７７】
試薬３
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
試薬４
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
【００７８】
試薬５
化合物Ａ、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬６
化合物Ａ、ポリアニオン、化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
【００７９】
（ＨＤＬコレステロール測定用キット）
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれであってもよいが、２試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる２試薬系のＨＤＬコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好ましい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
【００８０】
化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの物質（化合物Ａ）は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬に含有されることが好ましい。ポリアニオンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬に含有されることが好ましい。
アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群から選ばれる少なくとも一つの物質（化合物Ｂ）は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
【００８１】
過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様、すなわち、過酸化水素測定用試薬が第一試薬および第二試薬の両方に含有される態様が好ましい。還元性補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、第一試薬、第二試薬の両方に含有されることが好ましい。
【００８２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット２
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８３】
キット３
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット４
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８４】
キット５
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
化合物Ｂ、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
キット６
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
化合物Ｂ、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
【００８５】
キット７
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット８
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８６】
キット９
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット１０
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８７】
キット１１
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
化合物Ｂ、コレステロール脱水素酵素
キット１２
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素
第二試薬
化合物Ｂ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８８】
キット１３
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
コレステロール脱水素酵素
キット１４
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００８９】
キット１５
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット１６
第一試薬
化合物Ａ、化合物Ｂ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００９０】
キット１７
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素第二試薬
化合物Ｂ、還元型補酵素測定用試薬、コレステロール脱水素酵素
キット１８
第一試薬
化合物Ａ、ポリアニオン、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬
第二試薬
化合物Ｂ、還元型補酵素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素
【００９１】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬およびキットにおいては、前述の本発明のＨＤＬコレステロールの測定方法において挙げられた、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、ポリアニオン、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、過酸化水素測定用試薬、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
【００９２】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。
【００９３】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のＨＤＬコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜１２００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．０２〜６００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
【００９４】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜３％となる含量が好ましく、０．００１〜０．３％となる含量がより好ましい。本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリアニオンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜３０％となる含量が好ましく、０．０１〜３％となる含量がより好ましい。
【００９５】
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜３０％となる含量が好ましく、０．０１〜３％となる含量がより好ましい。
本発明のＨＤＬコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜３％となる含量が好ましく、０．００１〜０．３％となる含量がより好ましい。
【００９６】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および酵素を使用した。
ＨＥＰＥＳ（ＢＤＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、アミンＢＢ（ドデシルアミン；日本油脂社製）、３級アミンＢＢ（ドデシルジメチルアミン；日本油脂社製）、カチオンＢＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド；日本油脂社製）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（ファルマシア社製）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；プロライアント社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）、４３ｋＤａエステラーゼ（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＣＨＯＰＥ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５（ポリオキシエチレンラウリルアミノエーテル；青木油脂社製）。
【実施例１】
【００９７】
以下の第一試薬（試薬Ａ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
アミンＢＢ ０．１ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例２】
【００９８】
以下の第一試薬（試薬Ｂ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
３級アミンＢＢ ０．０３ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例３】
【００９９】
以下の第一試薬（試薬Ｃ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例４】
【０１００】
以下の第一試薬（試薬Ｄ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例５】
【０１０１】
以下の第一試薬（試薬Ｃ）および第二試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ｇ／Ｌ
【実施例６】
【０１０２】
以下の第一試薬（試薬Ｄ）および第二試薬（試薬ｂ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
カチオンＢＢ ０．１４ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ ２．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ｂ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ２０５ ０．１６ｇ／Ｌ
【０１０３】
比較例１
以下の第一試薬（試薬Ｅ）および第二試薬（試薬ａ）からなるＨＤＬコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬（試薬Ｅ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ ０．３ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム １．０ｇ／Ｌ
第二試薬（試薬ａ）
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０） １０ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ２０ｋＵ／Ｌ
４３ｋＤａエステラーゼ １００ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯＰＥ １．２ｋＵ／Ｌ
【実施例７】
【０１０４】
実施例１のキットを用いて、ヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。（１）検量線の作成
標準液として、生理食塩水（ＨＤＬコレステロール濃度：０．０ｍｇ／ｄＬ）および血清（ＨＤＬコレステロール濃度：８０．０ｍｇ／ｄＬ）を、実施例１のキットを用いて、日立７１７０Ｓ形自動分析装置により、ＨＤＬコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
【０１０５】
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された２つの吸光度（Ｅ１およびＥ２）を基に、Ｅ２からＥ１を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液（２μＬ）と第一試薬（０．１５ｍＬ）とを添加し３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、次いで、この反応液に第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。
（２）ヒト血清検体と実施例１のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
（１）の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、（１）の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
（３）ヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度の測定
（２）で算出した「吸光度」と、（１）で作成した検量線とから、各検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。
【実施例８】
【０１０６】
実施例１のキットの代わりに実施例２のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例９】
【０１０７】
実施例１のキットの代わりに実施例３のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１０】
【０１０８】
実施例１のキットの代わりに実施例４のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１１】
【０１０９】
実施例１のキットの代わりに実施例５のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【実施例１２】
【０１１０】
実施例１のキットの代わりに実施例６のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【０１１１】
比較例２
実施例１のキットの代わりに比較例１のキットを用いる以外は実施例７の測定法と同様にして、日立７１７０形自動分析装置によりヒト血清３０検体中のＨＤＬコレステロールを測定した。
【０１１２】
次に、実施例７〜１２および比較例２の測定において用いたヒト血清３０検体を用いて、クリニカルケミストリー第４５巻、１０号（１９９９年）に記載されたＤＣＭ法（ＤｅｓｉｇｎａｔｅｄＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）により当該検体中のＨＤＬコレステロールを測定し、各実施例および比較例での測定値と比較した。各実施例および比較例それぞれの測定と、ＤＣＭ法による測定との相関係数を第１表に示す。
【０１１３】
【表１】
第１表の比較例２と実施例７〜１２との比較から、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）とポリアニオンとを含有するキットを用いた測定において、ＤＣＭとの良好な相関関係が認められることが判明した。さらに、実施例９と実施例１０〜１２との比較から、化合物（Ｉ）または化合物（ＩＩ）とポリアニオンの他に、アルブミンまたはポリオキシエチレンアルキルアミンを共存させることによりＤＣＭとの相関係数がより向上することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、動脈硬化などの疾患の診断に有用なＨＤＬコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットが提供される。
Claims (13)
- 検体と、ｉ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、ｉｉ）コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）
- 水性媒体が、さらにアルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する請求項１記載の方法。
- ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項１または２記載の方法。
- 一般式（Ｉ）
- 一般式（Ｉ）
- さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項５記載の試薬。
- さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を含有する請求項４〜６のいずれかに記載の試薬。
- ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項４〜７のいずれかに記載の試薬。
- 第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
- 第一試薬および第二試薬を含有する高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キットであって、一般式（Ｉ）
- さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項１０記載のキット。
- さらに、アルブミン、ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンからなる群より選ばれる少なくとも一つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項９〜１１のいずれかに記載のキット。
- ポリアニオンが、デキストラン硫酸またはその塩である請求項９〜１２のいずれかに記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007514809A JP5112861B2 (ja) | 2005-04-27 | 2006-04-27 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005129319 | 2005-04-27 | ||
| JP2005129319 | 2005-04-27 | ||
| JP2007514809A JP5112861B2 (ja) | 2005-04-27 | 2006-04-27 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
| PCT/JP2006/308850 WO2006118199A1 (ja) | 2005-04-27 | 2006-04-27 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2006118199A1 JPWO2006118199A1 (ja) | 2008-12-18 |
| JP5112861B2 true JP5112861B2 (ja) | 2013-01-09 |
Family
ID=37307997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007514809A Active JP5112861B2 (ja) | 2005-04-27 | 2006-04-27 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7811780B2 (ja) |
| EP (1) | EP1876243B1 (ja) |
| JP (1) | JP5112861B2 (ja) |
| KR (1) | KR101153759B1 (ja) |
| CN (1) | CN101166831B (ja) |
| AU (1) | AU2006241793B2 (ja) |
| BR (1) | BRPI0610378A2 (ja) |
| CA (1) | CA2605329C (ja) |
| ES (1) | ES2396143T3 (ja) |
| HK (1) | HK1109916A1 (ja) |
| RU (1) | RU2007143970A (ja) |
| TW (1) | TWI372783B (ja) |
| WO (1) | WO2006118199A1 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008143159A1 (ja) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用キット |
| WO2009048143A1 (ja) * | 2007-10-10 | 2009-04-16 | Denka Seiken Co., Ltd. | small,dense LDLコレステロールの定量方法およびキット |
| JP5313537B2 (ja) * | 2008-04-10 | 2013-10-09 | 富士フイルム株式会社 | 高密度リポ蛋白コレステロール測定用乾式分析素子 |
| WO2011136316A1 (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | 協和メデックス株式会社 | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット |
| JP5737659B2 (ja) * | 2010-08-11 | 2015-06-17 | 協和メデックス株式会社 | ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法 |
| JP5969978B2 (ja) | 2011-03-16 | 2016-08-17 | 協和メデックス株式会社 | Ｈｄｌ亜分画中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット |
| TWI456199B (zh) | 2011-12-29 | 2014-10-11 | Univ Nat Chiao Tung | 生物檢測裝置及檢測方法 |
| CN104603282A (zh) * | 2012-08-31 | 2015-05-06 | 协和梅迪克斯株式会社 | 高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法 |
| US20160208311A1 (en) * | 2013-08-30 | 2016-07-21 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for measuring cholesterol in high-density lipoprotein, and reagent for use in said method |
| WO2015077776A1 (en) * | 2013-11-25 | 2015-05-28 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Methods for calibrated ion mobility analysis and uses thereof |
| JP6582388B2 (ja) * | 2014-10-23 | 2019-10-02 | 東洋紡株式会社 | 高密度リポ蛋白コレステロールの測定方法 |
| CN117491644A (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-02 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种载脂蛋白e的检测试剂盒及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1038888A (ja) * | 1996-04-15 | 1998-02-13 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| JP2000325097A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Showa Denko Kk | リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬 |
| JP2001224397A (ja) * | 2000-02-17 | 2001-08-21 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| JP2002142799A (ja) * | 2000-11-08 | 2002-05-21 | Arkray Inc | 高密度リポタンパク質（ｈｄｌ）コレステロール測定用試験片 |
| WO2004035816A1 (ja) * | 2002-10-16 | 2004-04-29 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3533288A1 (de) | 1985-09-18 | 1987-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von hdl-cholesterin im serum |
| DE3636851A1 (de) | 1986-10-29 | 1988-05-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung des cholesterins der hdl-fraktion |
| JP2600065B2 (ja) | 1994-03-08 | 1997-04-16 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| JP2653755B2 (ja) * | 1994-03-08 | 1997-09-17 | 協和メデックス株式会社 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 |
| JPH08116996A (ja) | 1994-10-26 | 1996-05-14 | Toyobo Co Ltd | 血清または血漿中のｈｄｌ−コレステロールを測定する方法 |
| JP2799835B2 (ja) | 1995-01-31 | 1998-09-21 | 第一化学薬品株式会社 | コレステロールの定量方法 |
| JP3614514B2 (ja) | 1995-06-21 | 2005-01-26 | 国際試薬株式会社 | 高比重リポ蛋白分画中のコレステロールの定量方法及び定量用試薬キット |
| EP0754948B1 (en) * | 1995-07-21 | 2001-10-17 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd | Method for measuring the amount of constituent contained in specific lipotrotein |
| WO1997040376A1 (fr) | 1996-04-22 | 1997-10-30 | Iatron Laboratories, Inc. | Procede specifique de dosage du cholesterol des lphd et composition utilisee pour le dosage. |
| JPH09285298A (ja) | 1996-04-22 | 1997-11-04 | Iatron Lab Inc | Ｈｄｌ−コレステロールの測定方法及び測定用試薬 |
| JP3193634B2 (ja) * | 1996-05-29 | 2001-07-30 | 第一化学薬品株式会社 | Ｌｄｌコレステロールの定量方法 |
| CN1232496A (zh) * | 1996-08-12 | 1999-10-20 | 藤泽药品工业株式会社 | 制备生物反应器的方法 |
| US5925534A (en) * | 1998-06-08 | 1999-07-20 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for measuring LDL-cholesterol |
| JP4547095B2 (ja) | 1999-03-01 | 2010-09-22 | シスメックス株式会社 | 生体試料成分の測定方法 |
| AU2003301324A1 (en) | 2002-10-16 | 2004-05-04 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for measuring cholesterol in high-density lipoproteins |
| CA2508674C (en) * | 2002-12-06 | 2012-12-04 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantitatively measuring small particle low density lipoproteins |
-
2006
- 2006-04-25 TW TW095114621A patent/TWI372783B/zh active
- 2006-04-27 BR BRPI0610378A patent/BRPI0610378A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-04-27 JP JP2007514809A patent/JP5112861B2/ja active Active
- 2006-04-27 RU RU2007143970/13A patent/RU2007143970A/ru not_active Application Discontinuation
- 2006-04-27 ES ES06732406T patent/ES2396143T3/es active Active
- 2006-04-27 CA CA2605329A patent/CA2605329C/en active Active
- 2006-04-27 US US11/911,029 patent/US7811780B2/en active Active
- 2006-04-27 EP EP06732406A patent/EP1876243B1/en active Active
- 2006-04-27 AU AU2006241793A patent/AU2006241793B2/en active Active
- 2006-04-27 WO PCT/JP2006/308850 patent/WO2006118199A1/ja active Application Filing
- 2006-04-27 KR KR1020077024676A patent/KR101153759B1/ko active IP Right Grant
- 2006-04-27 CN CN2006800142148A patent/CN101166831B/zh active Active
-
2008
- 2008-04-11 HK HK08104126.1A patent/HK1109916A1/xx unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1038888A (ja) * | 1996-04-15 | 1998-02-13 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| JP2000325097A (ja) * | 1999-05-21 | 2000-11-28 | Showa Denko Kk | リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬 |
| JP2001224397A (ja) * | 2000-02-17 | 2001-08-21 | Denka Seiken Co Ltd | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
| JP2001346598A (ja) * | 2000-06-07 | 2001-12-18 | Internatl Reagents Corp | Ｈｄｌ亜画分の分析方法 |
| JP2002142799A (ja) * | 2000-11-08 | 2002-05-21 | Arkray Inc | 高密度リポタンパク質（ｈｄｌ）コレステロール測定用試験片 |
| WO2004035816A1 (ja) * | 2002-10-16 | 2004-04-29 | Kyowa Medex Co., Ltd. | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0610378A2 (pt) | 2016-11-08 |
| EP1876243B1 (en) | 2012-10-17 |
| TW200720436A (en) | 2007-06-01 |
| JPWO2006118199A1 (ja) | 2008-12-18 |
| US7811780B2 (en) | 2010-10-12 |
| EP1876243A4 (en) | 2010-06-30 |
| AU2006241793A1 (en) | 2006-11-09 |
| HK1109916A1 (en) | 2008-06-27 |
| CA2605329C (en) | 2014-08-05 |
| KR20080012854A (ko) | 2008-02-12 |
| KR101153759B1 (ko) | 2012-06-13 |
| US20090280514A1 (en) | 2009-11-12 |
| TWI372783B (en) | 2012-09-21 |
| EP1876243A1 (en) | 2008-01-09 |
| CN101166831B (zh) | 2011-07-20 |
| ES2396143T3 (es) | 2013-02-19 |
| AU2006241793B2 (en) | 2011-03-24 |
| RU2007143970A (ru) | 2009-06-10 |
| CN101166831A (zh) | 2008-04-23 |
| WO2006118199A1 (ja) | 2006-11-09 |
| CA2605329A1 (en) | 2006-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5112861B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 | |
| JP4498143B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬 | |
| JP5111389B2 (ja) | 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 | |
| JP5027648B2 (ja) | レムナント様リポ蛋白（ｒｌｐ）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット | |
| JP5534644B2 (ja) | レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット | |
| JP4796489B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 | |
| JPWO2005073401A1 (ja) | 超低密度リポ蛋白レムナント（ｖｌｄｌレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット | |
| JP5864858B2 (ja) | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット | |
| JP5534809B2 (ja) | 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用キット | |
| JP6372921B2 (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090403 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090403 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20100225 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111214 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20121002 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20121011 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151019 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5112861 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |