JP3288033B2 - 高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬Info
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- JP3288033B2 JP3288033B2 JP2000262727A JP2000262727A JP3288033B2 JP 3288033 B2 JP3288033 B2 JP 3288033B2 JP 2000262727 A JP2000262727 A JP 2000262727A JP 2000262727 A JP2000262727 A JP 2000262727A JP 3288033 B2 JP3288033 B2 JP 3288033B2
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- hdl
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- lipoproteins
- density lipoprotein
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、高密度リポ蛋白
（以下、「ＨＤＬ」ということがある）中のコレステロ
ールの定量用試薬に関する。
（以下、「ＨＤＬ」ということがある）中のコレステロ
ールの定量用試薬に関する。
【０００２】ＨＤＬは、動脈硬化壁を含めた各組織から
コレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレス
テロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめと
する各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レ
ベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となるこ
とが知られている。
コレステロールを受け取るので細胞内に蓄積したコレス
テロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめと
する各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レ
ベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となるこ
とが知られている。
【０００３】ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法とし
ては、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポ蛋白
と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電
気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその
発色強度を測定する方法等が知られている。しかしなが
ら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、
多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的には
ほとんど用いられていない。
ては、例えば超遠心分離によってＨＤＬを他のリポ蛋白
と分離した後、コレステロール測定に供する方法や、電
気泳動によって分離した後に脂質の染色を行なってその
発色強度を測定する方法等が知られている。しかしなが
ら、これらの方法は、いずれも操作が煩雑であったり、
多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的には
ほとんど用いられていない。
【０００４】ＨＤＬ中のコレステロールの測定方法とし
て現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、
検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集さ
せ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤ
Ｌのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法で
ある。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡
便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むた
め、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量
の検体量を必要とする。
て現在臨床検査の領域で一般に用いられている方法は、
検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集さ
せ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤ
Ｌのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法で
ある。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡
便であるものの、沈殿剤を加えて分離する操作を含むた
め、簡便性で満足できるものでなく、また、比較的多量
の検体量を必要とする。
【０００５】一方、酵素的にＨＤＬ中のコレステロール
を分別定量する方法も既に検討されている。例えば、Ｈ
ＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集さ
せておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反
応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶
解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２
１１０号公報）がある。しかしながら、この方法は少な
くとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定さ
れた分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があ
った。
を分別定量する方法も既に検討されている。例えば、Ｈ
ＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集さ
せておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反
応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶
解して吸光度を測定するという方法（特開平６−２４２
１１０号公報）がある。しかしながら、この方法は少な
くとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定さ
れた分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があ
った。
【０００６】また、他の方法としては胆汁酸塩又は非イ
オン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特
開昭６３−１２６４９８号公報）、さらに近年ではコレ
ステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ
酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物
存在下においてＨＤＬ中のコレステロールを特異的に捕
える方法（特開平７−３０１６３６号公報）やＨＤＬ以
外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にＨ
ＤＬ中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特
開平８−１３１１９７号公報及び特開平８−２０１３９
３号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部
のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で
問題となっている。
オン界面活性剤の存在下に、酵素反応を行なう方法（特
開昭６３−１２６４９８号公報）、さらに近年ではコレ
ステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ
酵素を化学修飾し、シクロデキストリン等の包接化合物
存在下においてＨＤＬ中のコレステロールを特異的に捕
える方法（特開平７−３０１６３６号公報）やＨＤＬ以
外のリポ蛋白と凝集体や複合体を形成させ、その後にＨ
ＤＬ中のコレステロールを酵素的反応で捕える方法（特
開平８−１３１１９７号公報及び特開平８−２０１３９
３号公報）が知られているが、いずれも臨床検体の一部
のもので沈殿法との乖離が認められる等、特異性の点で
問題となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、煩雑
な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びに低密度リポ
蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）及びカ
イロミクロン（ＣＭ）等の他のリポ蛋白を含む被検試料
中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に
定量することができる、ＨＤＬ中のコレステロールの定
量方法に用いられる高密度リポ蛋白中のコレステロール
定量用試薬を提供することである。
な分画分離操作を必要とせず、ＨＤＬ並びに低密度リポ
蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）及びカ
イロミクロン（ＣＭ）等の他のリポ蛋白を含む被検試料
中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便かつ正確に
定量することができる、ＨＤＬ中のコレステロールの定
量方法に用いられる高密度リポ蛋白中のコレステロール
定量用試薬を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ＨＤＬに作用するが他のリポ蛋白にはほとん
ど作用しない界面活性剤が存在することを見出した。そ
して、先ず、第１工程において被検試料中の高密度リポ
蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去
した後、第２工程において上記界面活性剤及び、少なく
ともコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼの存在下で酵素的にＨＤＬ由来のコレステロー
ルを定量することにより、ＨＤＬ及び他のリポ蛋白を含
む被検試料中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便
かつ正確に定量することができることを見出し本発明を
完成した。
究の結果、ＨＤＬに作用するが他のリポ蛋白にはほとん
ど作用しない界面活性剤が存在することを見出した。そ
して、先ず、第１工程において被検試料中の高密度リポ
蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを選択的に消去
した後、第２工程において上記界面活性剤及び、少なく
ともコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼの存在下で酵素的にＨＤＬ由来のコレステロー
ルを定量することにより、ＨＤＬ及び他のリポ蛋白を含
む被検試料中のＨＤＬコレステロールを選択的に、簡便
かつ正確に定量することができることを見出し本発明を
完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、コレステロールエス
テラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び、高密度リ
ポ蛋白中のコレステロールに特異的に作用する、ＨＬＢ
が１３〜１４の界面活性剤を組み合わせてなることを特
徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬
を提供する。
テラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び、高密度リ
ポ蛋白中のコレステロールに特異的に作用する、ＨＬＢ
が１３〜１４の界面活性剤を組み合わせてなることを特
徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬
を提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】リポ蛋白中に含まれるコレステロ
ールとしては、エステル型コレステロール（コレステロ
ールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明
細書において、単に「コレステロール」という場合に
は、これらの両者を包含する。本発明の方法に供される
被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ
等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれの
ものでもよく、例えば、血清等の体液やその希釈物を挙
げることができるがこれらに限定されるものではない。
ールとしては、エステル型コレステロール（コレステロ
ールエステル）及び遊離型コレステロールがある。本明
細書において、単に「コレステロール」という場合に
は、これらの両者を包含する。本発明の方法に供される
被検試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ
等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれの
ものでもよく、例えば、血清等の体液やその希釈物を挙
げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００１１】本発明の方法における第１工程では、被検
試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを選
択的に消去する。ここで、「消去」とは、コレステロー
ルを分解し、かつ、その分解物が次の第２工程で検出さ
れないようにすることを意味する。ＨＤＬ以外のリポ蛋
白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等に含まれる
コレステロールを選択的に消去する方法としては以下の
方法を挙げることができる。
試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを選
択的に消去する。ここで、「消去」とは、コレステロー
ルを分解し、かつ、その分解物が次の第２工程で検出さ
れないようにすることを意味する。ＨＤＬ以外のリポ蛋
白、すなわち、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ等に含まれる
コレステロールを選択的に消去する方法としては以下の
方法を挙げることができる。
【００１２】すなわち、ＨＤＬに作用する界面活性剤の
非存在下において、被検試料にコレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じ
た過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼ
の作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロール
が加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ
る。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リ
ポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロ
ールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過
酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。
過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用
させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼ
の作用により、例えばＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシ
アニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノン
を生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物
と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等
を挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。
非存在下において、被検試料にコレステロールエステラ
ーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じ
た過酸化水素を除去する。コレステロールエステラーゼ
の作用により、リポ蛋白中のエステル型コレステロール
が加水分解されて遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ
る。次いで、この生じた遊離型コレステロールと元々リ
ポ蛋白中に存在する遊離型コレステロールがコレステロ
ールオキシダーゼの作用で酸化されてコレステノンと過
酸化水素が生じる。この生じた過酸化水素を除去する。
過酸化水素を除去する方法としては、カタラーゼを作用
させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼ
の作用により、例えばＤＡＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメチオキシ
アニリン）のような、過酸化水素と反応して無色キノン
を生じるフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物
と反応させて過酸化水素を無色キノンに転化する方法等
を挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。
【００１３】上記第１工程は、ＨＤＬに作用する界面活
性剤の非存在下において行うことにより、ＨＤＬ中のコ
レステロールはほとんど反応せず、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、
ＣＭ等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消
去される。これにより、次の第２工程においてＨＤＬ中
のコレステロールが選択的に定量される。
性剤の非存在下において行うことにより、ＨＤＬ中のコ
レステロールはほとんど反応せず、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、
ＣＭ等の他のリポ蛋白中のコレステロールが反応して消
去される。これにより、次の第２工程においてＨＤＬ中
のコレステロールが選択的に定量される。
【００１４】第１工程の反応液中のコレステロールエス
テラーゼの濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
く、また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１
〜０．７Ｕ単位／ｍｌ程度が好ましい。さらに、カタラ
ーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、ペ
ルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が
好ましい。また、過酸化水素と反応して無色キノンを生
じる化合物の濃度は０．４〜０．８mmol/l程度が好まし
い。
テラーゼの濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
く、また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１
〜０．７Ｕ単位／ｍｌ程度が好ましい。さらに、カタラ
ーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍｌ程度が好ましく、ペ
ルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍｌ程度が
好ましい。また、過酸化水素と反応して無色キノンを生
じる化合物の濃度は０．４〜０．８mmol/l程度が好まし
い。
【００１５】第１工程の反応は、ｐＨ５〜８の緩衝液中
で行なうことが好ましく、緩衝液としてはリン酸、グリ
シン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッ
ドの緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯ
ＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好まし
く、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
で行なうことが好ましく、緩衝液としてはリン酸、グリ
シン、トリス及びグッドの緩衝液が好ましい。特にグッ
ドの緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯ
ＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯが好まし
く、緩衝液の濃度は１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。
【００１６】第１工程で、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の消去
をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを
含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、
鉄イオン及びマグネシウムイオンを好ましく使用するこ
とができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２
価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好まし
い。
をさらに高めるために、反応液中に２価の金属イオンを
含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、
鉄イオン及びマグネシウムイオンを好ましく使用するこ
とができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２
価の金属イオンの濃度は５〜２００ｍＭ程度が好まし
い。
【００１７】なお、第１工程の反応液中には、任意的
に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この
酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロ
ールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液
中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
い。
に、リポ蛋白加水分解酵素を加えることもできる。この
酵素を加えることにより、特にＶＬＤＬ中のコレステロ
ールが反応し易くなるので好ましい。この酵素の反応液
中の濃度は、５．０〜１０．０Ｕ／ｍｌ程度が好まし
い。
【００１８】第１工程の反応温度は２５℃〜４０℃程度
が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間
は２〜１０分間程度でよい。
が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間
は２〜１０分間程度でよい。
【００１９】続く第２工程では、前記第１工程の産物
に、ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密
度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。こ
こで、「ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤」とは、
当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステ
ラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ等の酵素を作用
させた場合に、ＨＤＬ中のコレステロールは反応する
（反応率７０％以上、好ましくは９０％以上）が、ＨＤ
Ｌ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応し
ない（反応率３０％以下、好ましくは２０％以下）こと
となる界面活性剤を言う。ここで用いる界面活性剤の親
水性親油性バランス(HLB)は１３〜１４である。中で
も、ＨＬＢが１３〜１４の非イオン界面活性剤、とりわ
け、ポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることがで
きる。ここでいう、誘導体の例としては高級アルコール
縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、
高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン
縮合物、アルキルフェノール縮合物等を挙げることがで
きる。また、ポリアルキレンオキサイド誘導体の中でも
ポリエチレンオキサイド誘導体が最も好ましい。また、
複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の
範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活
性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤
のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性
剤」、堀口博著、昭和６１年、三共出版に記載されてい
る。
に、ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤を加え、高密
度リポ蛋白中のコレステロールを酵素的に定量する。こ
こで、「ＨＤＬに特異的に作用する界面活性剤」とは、
当該界面活性剤の存在下においてコレステロールエステ
ラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ等の酵素を作用
させた場合に、ＨＤＬ中のコレステロールは反応する
（反応率７０％以上、好ましくは９０％以上）が、ＨＤ
Ｌ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど反応し
ない（反応率３０％以下、好ましくは２０％以下）こと
となる界面活性剤を言う。ここで用いる界面活性剤の親
水性親油性バランス(HLB)は１３〜１４である。中で
も、ＨＬＢが１３〜１４の非イオン界面活性剤、とりわ
け、ポリアルキレンオキサイド誘導体を挙げることがで
きる。ここでいう、誘導体の例としては高級アルコール
縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、
高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン
縮合物、アルキルフェノール縮合物等を挙げることがで
きる。また、ポリアルキレンオキサイド誘導体の中でも
ポリエチレンオキサイド誘導体が最も好ましい。また、
複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の
範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活
性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤
のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性
剤」、堀口博著、昭和６１年、三共出版に記載されてい
る。
【００２０】好ましい界面活性剤の具体例として、ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン
セチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４〜３
５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等
を挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。
オキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン
セチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４〜３
５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエ
ーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等
を挙げることができるがこれらに限定されるものではな
い。
【００２１】第２工程における界面活性剤の濃度は、特
に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．０５〜
３重量％が好ましく、さらには０．１〜１．５重量％が
好ましい。
に限定されないが、反応混合物全体に対し、０．０５〜
３重量％が好ましく、さらには０．１〜１．５重量％が
好ましい。
【００２２】上記界面活性剤の存在下において、被検試
料中のＨＤＬコレステロールを酵素的に定量することが
できる。すなわち、第１工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋
白中のコレステロールが大部分消去されるが第２工程で
の反応との相乗効果によりＨＤＬ中のコレステロールの
みが定量される。
料中のＨＤＬコレステロールを酵素的に定量することが
できる。すなわち、第１工程では、ＨＤＬ以外のリポ蛋
白中のコレステロールが大部分消去されるが第２工程で
の反応との相乗効果によりＨＤＬ中のコレステロールの
みが定量される。
【００２３】コレステロールの酵素的な定量方法自体は
この分野において周知であり、例えば第１工程と同様、
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシ
ダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型
コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過
酸化水素を定量することにより行なうことができる。過
酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下
で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物
と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等によ
り測定することにより行なうことができる。キノン色素
は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びＤ
ＡＯＳ又はＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプ
ロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）を反応させ
ることにより形成される。これにより形成されるキノン
色素は、ＤＡＯＳを用いた場合には波長５９３ｎｍに最
大吸収を有し、ＨＤＡＯＳを用いた場合には波長５８３
ｎｍに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物
の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対
し、例えば４−アミノアンチピリンでは好ましくは０．
１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭ
であり、ＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳでは好ましくは０．１
〜１．５ｍＭ、さらに好ましくは０．４〜１．０ｍＭで
ある。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定され
ないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍｌが
好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温
度、反応時間、緩衝液、ｐＨ）は、第１工程の好ましい
反応条件と同じである。
この分野において周知であり、例えば第１工程と同様、
コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシ
ダーゼの作用によりコレステロールエステル及び遊離型
コレステロールから過酸化水素を発生させ、発生した過
酸化水素を定量することにより行なうことができる。過
酸化水素の定量は、例えば、ペルオキシダーゼの存在下
で、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物
と反応させ、生じたキノン色素の量を吸光度測定等によ
り測定することにより行なうことができる。キノン色素
は、例えば過酸化水素と４−アミノアンチピリン及びＤ
ＡＯＳ又はＨＤＡＯＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプ
ロピル）−３，５−ジメチオキシアニリン）を反応させ
ることにより形成される。これにより形成されるキノン
色素は、ＤＡＯＳを用いた場合には波長５９３ｎｍに最
大吸収を有し、ＨＤＡＯＳを用いた場合には波長５８３
ｎｍに最大吸収を有する。キノン色素を生成する化合物
の濃度は、特に限定されないが、反応混合物全体に対
し、例えば４−アミノアンチピリンでは好ましくは０．
１〜２．０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１．５ｍＭ
であり、ＤＡＯＳ又はＨＤＡＯＳでは好ましくは０．１
〜１．５ｍＭ、さらに好ましくは０．４〜１．０ｍＭで
ある。また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定され
ないが、反応混合物全体に対し、０．４〜５Ｕ／ｍｌが
好ましい。なお、第２工程の好ましい反応条件（反応温
度、反応時間、緩衝液、ｐＨ）は、第１工程の好ましい
反応条件と同じである。
【００２４】なお、第１工程において、生じた過酸化水
素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこの
カタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程におい
て例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を
用いてカタラーゼを阻害する。
素をカタラーゼで分解する場合には、第２工程ではこの
カタラーゼを阻害する必要があるので、第２工程におい
て例えばアジ化ナトリウムのようなカタラーゼ阻害剤を
用いてカタラーゼを阻害する。
【００２５】実施例 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限
り「重量％」を示す。
もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではな
い。なお、下記例において、「％」は特に断りがない限
り「重量％」を示す。
【００２６】実施例１ 既知濃度の精製ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はＣＭを含
む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤エマ
ルゲン９１１（ポリオキシエチレンノニルエーテル、Ｈ
ＬＢ１３．７）、エマルゲンＢ６６（ポリオキシエチレ
ン誘導体、ＨＬＢ１３．２）、又はエマルゲンＢ６６と
エマルゲンＡ９０（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ
１４．５）の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステ
ロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のよ
うに行なった。
む試料を用い、花王（株）製非イオン性界面活性剤エマ
ルゲン９１１（ポリオキシエチレンノニルエーテル、Ｈ
ＬＢ１３．７）、エマルゲンＢ６６（ポリオキシエチレ
ン誘導体、ＨＬＢ１３．２）、又はエマルゲンＢ６６と
エマルゲンＡ９０（ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ
１４．５）の混合物の存在下で各リポ蛋白中のコレステ
ロールを酵素的に定量した。この操作は具体的に次のよ
うに行なった。
【００２７】５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０、
コレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍｌ、コレステ
ロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ
０．５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．０ｍｍｏ
ｌ／ｌ、ＨＤＡＯＳ ０．５ｍｍｏｌ／ｌに、エマルゲ
ン９１１若しくはエマルゲンＢ６６を０．１重量％、又
はエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物（９／
１）１．３重量％を含む試薬を調整し、試料２０μｌに
試薬２．０ｍｌを混和し、３７℃、１０分間反応させた
後、６００ｎｍの吸光度を測定した。
コレステロールエステラーゼ０．５Ｕ／ｍｌ、コレステ
ロールオキシダーゼ０．４Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ
０．５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン１．０ｍｍｏ
ｌ／ｌ、ＨＤＡＯＳ ０．５ｍｍｏｌ／ｌに、エマルゲ
ン９１１若しくはエマルゲンＢ６６を０．１重量％、又
はエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０混合物（９／
１）１．３重量％を含む試薬を調整し、試料２０μｌに
試薬２．０ｍｌを混和し、３７℃、１０分間反応させた
後、６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００２８】その結果、コレステロールの反応率（コレ
ステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、
ＨＤＬ中のコレステロールが約９５％、その他のリポ蛋
白中のコレステロールが約１８〜２２％であった。
ステロール中の定量されたコレステロールの割合）は、
ＨＤＬ中のコレステロールが約９５％、その他のリポ蛋
白中のコレステロールが約１８〜２２％であった。
【００２９】このことから、エマルゲン９１１、エマル
ゲンＢ６６、及びエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０
混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作
用する界面活性剤」に該当する。
ゲンＢ６６、及びエマルゲンＢ６６／エマルゲンＡ９０
混合物は、本発明で言う「高密度リポ蛋白に特異的に作
用する界面活性剤」に該当する。
【００３０】実施例２ 次の組成から成る第１及び第２試薬を調製した。 第１試薬 ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 100 mmol/l ＨＤＡＯＳ 0.7 mmol/l コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/ml カタラーゼ 80 U/ml 塩化マグネシウム 10 mmol/l 第２試薬 ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 100 mmol/l ４−アミノアンチピリン 4.0 mmol/l ペルオキシダーゼ 2.4 U/ml アジ化ナトリウム 0.1% 花王（株）製エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ１３．２） 0.3%
【００３１】濃度100 mg/dl の精製したＨＤＬ、ＬＤ
Ｌ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４
μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌ
を混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１
００μｌを３７℃で５分間反応させ、反応液の６００ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコ
レステロール量を算出し、試料中のコレステロール量と
の比を計算して捕捉率とした。
Ｌ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４
μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌ
を混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１
００μｌを３７℃で５分間反応させ、反応液の６００ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。測定された吸光度からコ
レステロール量を算出し、試料中のコレステロール量と
の比を計算して捕捉率とした。
【００３２】この方法では、第１工程で生じた過酸化水
素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じ
た過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリン
と反応してキノン色素が生じる。結果を下記表１に示
す。
素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じ
た過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリン
と反応してキノン色素が生じる。結果を下記表１に示
す。
【００３３】
【表１】表１
【００３４】表１に示されるように、上記方法によれ
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００３５】実施例３ 被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例
２と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に
記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレス
テロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図１
に示す。
２と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に
記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレス
テロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図１
に示す。
【００３６】図１に示されるように、両方法による定量
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
【００３７】実施例４ 第１試薬及び第２試薬として下記の組成を有するものを
用いることを除き、実施例２と同じ操作を行った。
用いることを除き、実施例２と同じ操作を行った。
【００３８】 第１試薬 ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 50 mmol/l ＤＡＯＳ 1.5 mmol/l コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/ml ペルオキシダーゼ 1.0 U/ml 第２試薬 ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 50 mmol/l ４−アミノアンチピリン 4.0 mmol/l 花王（株）製エマルゲン９１１（ＨＬＢ１３．７） 0.3%
【００３９】この方法では、第１工程で生じた過酸化水
素がペルオキシダーゼの作用でＤＡＯＳと反応して無色
キノンが生じ、第２工程で発生した過酸化水素は同じく
ペルオキシダーゼの作用で第１工程の残存ＤＡＯＳ及び
第２工程で加えた４−アミノアンチピリンと反応してキ
ノン色素を生じる。結果を下記表２に示す。
素がペルオキシダーゼの作用でＤＡＯＳと反応して無色
キノンが生じ、第２工程で発生した過酸化水素は同じく
ペルオキシダーゼの作用で第１工程の残存ＤＡＯＳ及び
第２工程で加えた４−アミノアンチピリンと反応してキ
ノン色素を生じる。結果を下記表２に示す。
【００４０】
【表２】表２
【００４１】表２に示されるように、上記方法によれ
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００４２】実施例５ 被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例
４と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。実施例２と同様に、沈殿法により同じ被
検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。得られた
測定結果の相関図を図２に示す。
４と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。実施例２と同様に、沈殿法により同じ被
検試料中のＨＤＬコレステロールを定量した。得られた
測定結果の相関図を図２に示す。
【００４３】図２に示されるように、両方法による定量
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
【００４４】実施例６ 次の組成から成る第１及び第２試薬を調製した。 第１試薬 ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 100 mmol/l ＨＤＡＯＳ 0.7 mmol/l コレステロールエステラーゼ 0.8 U/ml コレステロールオキシダーゼ 0.5 U/ml カタラーゼ 100 U/ml 塩化マグネシウム 18 mmol/l 第２試薬 ＢＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０ 100 mmol/l ４−アミノアンチピリン 4.0 mmol/l ペルオキシダーゼ 2.4 U/ml アジ化ナトリウム 0.1% 花王（株）製エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ１３．２） 1.17% 花王（株）製エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ１４．５） 0.13%
【００４５】濃度100 mg/dl の精製したＨＤＬ、ＬＤ
Ｌ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４
μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌ
を混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１
００μｌを５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロ
ール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計
算して捕捉率とした。
Ｌ、ＶＬＤＬ又はＣＭをそれぞれ含む４種類の試料各４
μｌに、予め３７℃で加温した上記第１試薬３００μｌ
を混和し、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬１
００μｌを５分間反応させ、反応液の６００ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。測定された吸光度からコレステロ
ール量を算出し、試料中のコレステロール量との比を計
算して捕捉率とした。
【００４６】この方法では、第１工程で生じた過酸化水
素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じ
た過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリン
と反応してキノン色素が生じる。結果を下記表３に示
す。
素がカタラーゼにより分解され、一方、第２工程で生じ
た過酸化水素はＨＤＡＯＳ及び４−アミノアンチピリン
と反応してキノン色素が生じる。結果を下記表３に示
す。
【００４７】
【表３】表３
【００４８】表３に示されるように、上記方法によれ
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
ば、ＨＤＬ中のコレステロールは大部分定量されるが、
それ以外のリポ蛋白中のコレステロールはほとんど又は
全く定量されず、本発明の方法により、ＨＤＬ中のコレ
ステロールを選択的に定量できることがわかる。
【００４９】実施例７ 被検試料として健常人血清を用いることを除き、実施例
６と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に
記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレス
テロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図３
に示す。
６と同じ方法により、被検試料中のＨＤＬコレステロー
ルを定量した。一方、「臨床検査」、23, 121(1979) に
記載された沈殿法により同じ被検試料中のＨＤＬコレス
テロールを定量した。得られた測定結果の相関図を図３
に示す。
【００５０】図３に示されるように、両方法による定量
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
結果は非常によく一致しており、本発明の方法により、
正確にＨＤＬ中のコレステロールが定量できることが明
らかになった。
【００５１】
【発明の効果】本発明の方法によれば、煩雑な分画分離
操作を必要とせず、ＨＤＬ並びにＬＤＬ、ＶＬＤＬ及び
ＣＭ等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬを選択
的に、簡便かつ正確に定量することができる。
操作を必要とせず、ＨＤＬ並びにＬＤＬ、ＶＬＤＬ及び
ＣＭ等の他のリポ蛋白を含む被検試料中のＨＤＬを選択
的に、簡便かつ正確に定量することができる。
【図１】本発明の１実施例の方法により測定したＨＤＬ
中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定され
たＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図であ
る。
中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定され
たＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図であ
る。
【図２】本発明の他の１実施例の方法により測定したＨ
ＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定
されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図
である。
ＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法により測定
されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す相関図
である。
【図３】本発明のさらに他の１実施例の方法により測定
したＨＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法によ
り測定されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す
相関図である。
したＨＤＬ中のコレステロール量と、従来の沈殿法によ
り測定されたＨＤＬ中のコレステロール量の関係を示す
相関図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤原 明 新潟県五泉市大字木越字鏡田1359ー１ デンカ生研株式会社 鏡田工場内 (56)参考文献 特開 昭62−69999（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−201393（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−280812（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/60 G01N 33/92 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 コレステロールエステラーゼ、コレステ
ロールオキシダーゼ及び、高密度リポ蛋白中のコレステ
ロールに特異的に作用する、ＨＬＢが１３〜１４の界面
活性剤を組み合わせてなることを特徴とする高密度リポ
蛋白中のコレステロール定量用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000262727A JP3288033B2 (ja) | 1996-12-09 | 2000-08-31 | 高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34464996 | 1996-12-09 | ||
| JP8-344649 | 1996-12-09 | ||
| JP2000262727A JP3288033B2 (ja) | 1996-12-09 | 2000-08-31 | 高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52647298A Division JP3164829B2 (ja) | 1996-12-09 | 1997-12-04 | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001103998A JP2001103998A (ja) | 2001-04-17 |
| JP3288033B2 true JP3288033B2 (ja) | 2002-06-04 |
Family
ID=26577830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000262727A Expired - Lifetime JP3288033B2 (ja) | 1996-12-09 | 2000-08-31 | 高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3288033B2 (ja) |
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| US20050032141A1 (en) * | 2003-07-17 | 2005-02-10 | Dimagno Theodore John | Dry analytical element for high-density lipoprotein cholesterol quantification |
| US20050037504A1 (en) * | 2003-07-17 | 2005-02-17 | Dimagno Theodore John | One-step assay for high-density lipoprotein cholesterol |
| JP5706418B2 (ja) | 2010-07-23 | 2015-04-22 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法 |
| CN103080748B (zh) | 2010-07-23 | 2015-05-27 | 电化生研株式会社 | 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法 |
| EP2682476B1 (en) | 2011-02-28 | 2017-02-01 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 2, and use of a reagent kit for the method |
| JP6182008B2 (ja) * | 2013-07-24 | 2017-08-16 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法及び定量試薬 |
-
2000
- 2000-08-31 JP JP2000262727A patent/JP3288033B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001103998A (ja) | 2001-04-17 |
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