JP2600065C - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】 本発明は、臨床診断の分野において脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白（Ｈ
ＤＬ）中のコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）の定量法に関
する。 【０００２】 【従来の技術】 ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に
蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種
動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知 に有用な指針となることが知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。分画操
作法には、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心
法を用いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤＬを分離し、その
コレステロール量を測定する。しかしながら、定量性、簡便性、経済性などの面
で欠点がある。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡散法（ＳＲＩ
Ｄ法）、オクタロニー法などがあるが、これらの方法を用いる場合にはアポ蛋白
を認識しており、正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。電気泳
動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体
として分離し、酵素法によりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合には、低密度リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存
在するアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リンタングステン酸、
デキストラン硫酸などのポリアニオンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿
物を形成させ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤＬコレステロ
ールを定量する（臨床検査法提要、第２９版、金井泉著、金原出版、４７１頁、
１９８３年）。この方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離操作を
行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野で多く使用されている
自動分析装置には不向きである。さらに、従来の分画法では、分離したＨＤＬ画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人為的誤差も生じ易い。以上のように
、ＨＤＬコレステロール測定の煩雑さは、その分画操作にある。しかしながら、
単純にＨＤＬを分画せずに血清検体を直接コレステロールエステラーゼとコレス
テロールオキシダーゼが含有された試薬に添加しても、総コレステロールを定量
する系と変わりがなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に定量できない。特開昭
６３−１２６４９８には、コール酸類を添加してその特異性を高めることが記載
されているが、この方法では、ＨＤＬのみならずＬＤＬ、ＶＬＤＬなども徐々に
反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、特異性が必ずしも充分でない
。 【０００３】 【発明が解決しようとする課題】 本発明の目的は、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの
定量法を提供することにある。 【０００４】 【課題を解決するための手段】 本発明者らは、ＨＤＬ以外のリポ蛋白すなわちＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭを
凝集させる試薬の存在下、コレステロール反応試薬を用いてコレステロール定量
の酵素反応をさせることにより、特に生成した凝集物を分離することなくＨＤＬ
を含有する試料中のＨＤＬコレステロールを特異的に定量できることを見い出し
、本発明に至った。 【０００５】 本発明は、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬の存在下、ＨＤＬを含有す
る試料にコレステロール加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素またはコレ
ステロール脱水素酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素を定
量することを特徴とするＨＤＬ中のコレステロールの定量法に関する。 【０００６】 本発明方法は、血液、尿などのＨＤＬを含有する体液に適用できる。 次に、本発明の定量法の一例について説明する。 第一試薬として、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬を含む中性付近の緩
衝液を調製する。また、第二試薬として、コレステロールエステラーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ（またはコレステロールデヒドロゲナーゼ）、パーオキシ
ダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびトリンダー試薬〔またはＮＡＤ（Ｐ）〕
を含む緩衝液を調製する（トリンダー試薬は第一試薬中に入れてもよい）。体液
検体を一定量第一試薬に添加し、例えば３７℃で数分間加温してＬＤＬ、ＶＬＤ
ＬおよびＣＭを凝集させる。これに第二試薬を添加、攪拌して酵素反応させた後
、コレステロールオキシダーゼにより過酸化水素が発生する場合には４−アミノ
アンチピリンおよびトリンダー試薬から過酸化水素とパーオキシダーゼによって
生成する色素の極大波長における吸光度を測定し、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼを用いる場合にはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を３００〜５００ｎｍ、好ましくは ３３０〜４００ｎｍ、例えば３４０ｎｍでの吸光度で測定する（ジアホラーゼ、
テトラゾリウム塩を添加してホルマザン色素の発色に導き、ホルマザン色素を比
色定量することも可能である）。ＨＤＬコレステロール量は、別途一定量のコレ
ステロールを含む標準液で同じ操作を行い、比較計算する。なお、第一試薬と第
二試薬とを最初からまとめ、これに体液検体を添加して例えば３７℃で数分間加
温し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭを凝集させてさらに酵素反応させることもで
きる。 【０００７】 リポ蛋白を凝集させる試薬には凝集剤および２価の金属塩が含まれる。凝集剤
としては、ヘパリンまたはその塩、リンタングステン酸またはその塩、デキスト
ラン硫酸またはその塩、ポリエチレングリコール、硫酸化オリゴ糖またはその塩
、もしくはこれらの混合物などがあげられ、オリゴ糖としては、マルトトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘ
プタオースなどがあげられ、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム
塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩などがあげられる。２価の金属塩としては
、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩などがあげられる。 【０００８】 凝集剤としては、０．０２〜１０ｍＭの分子量５０００〜２００００のヘパリ
ンまたはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量４０００〜８０００のリンタングス
テン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量１００００〜５０００００のデ
キストラン硫酸またはその塩、０．１〜２０ｍＭの分子量１０００〜１００００
のデキストラン硫酸またはその塩、０．３〜１００ｍＭの分子量４０００〜２５
０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、０．１〜５０ｍＭの分子量４００
〜３０００の硫酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが好ま
しく用いられる。さらに好ましくは、０．０３〜１ｍＭの分子量１４０００〜１
６０００のヘパリンまたはその塩、０．１〜３ｍＭの分子量５０００〜７０００
のリンタングステン酸またはその塩、０．０１〜５ｍＭの分子量１５００００〜
２５００００のデキストラン硫酸またはその塩、０．１〜１０ｍＭの分子量１０
００〜５０００のデキストラン硫酸またはその塩、１．０〜５０ｍＭの分子量５ ０００〜２２０００のＰＥＧ、０．１〜１０ｍＭの分子量４００〜２０００の硫
酸化オリゴ糖またはその塩、もしくはそれらの混合物などが用いられる。 【０００９】 ２価の金属塩としては、０．１〜５０ｍＭのマグネシウム塩、カルシウム塩、
マンガン塩、ニッケル塩などがあげられ、好ましくは、０．１〜５０ｍＭのマグ
ネシウム塩が用いられる。 【００１０】 トリンダー試薬としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−
サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェ
ニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン
、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプ
ロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，
５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン
、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン
、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリ
ヨード安息香酸、フェノールなどがあげられる。 【００１１】 酵素としては、通常市販されている、コレステロールエステルを加水分解する
能力を有する微生物または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプロテ
インリパーゼ、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する微生物由来のコ
レステロールオキシダーゼ、微生物または動物由来のコレステロールデヒドロゲ
ナーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、安定性をさらにあげるために ポリエチレングリコールを主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロ
ピル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝子操
作により得られる酵素も用いられる。 【００１２】 本発明の系は、通常のコレステロールを測定する系を含んでいるため、コレス
テロールオキシダーゼを活性化するためによく使用される界面活性剤あるいはコ
ール酸類も使用可能であり、また、グロブリンなどを可溶化するための種々の塩
類を使用することもできる。界面活性剤としては、ノニオン系、アニオン系、カ
チオン系の界面活性剤が０〜１％の範囲で使用され、コール酸類としては、コー
ル酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸などが０〜５
％の範囲で使用され、塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウ
ム、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸
マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１００ｍＭの範囲で使用される。 【００１３】 緩衝剤としては、５〜５００ｍＭのトリス、グッドの緩衝剤などが好適に使用
される。ｐＨは５〜９の範囲がよい。 次に、実施例によって本発明の態様を説明する。 【００１４】 【実施例】 実施例１ リンタングステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法〔デタミナーＨＤＬ（協
和メデックス社製）で沈澱〕（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、
１９８７年）、直接ＨＤＬコレステロールを測定する本法および特開昭６３−１
２６４９８に記載のコール酸を用いる方法（以下、Ａ法という）を比較した。 【００１５】 本法の組成 本法では、検体５０μｌを第一試薬２．２５ｍｌに添加し、３７℃で５分間イ
ンキュベーションし、この時点で一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１）。
次いで、第二試薬を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分後の同波長における吸光
度を測定した（Ｅ２）。ＨＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール濃度２
００ｍｇ／ｄｌの標準液を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較
することにより算出した。 【００１６】 沈澱法では遠心分離後日立７２５０自動分析機を用いてデタミナーＬＴＣ（協
和メデックス社製）で測定した。 結果を第１表に示す。 【００１７】 【表１】 【００１８】 本法は、現在ＨＤＬコレステロールの測定法として常用されているリンタング
ステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法とよい相関を示した。 実施例２ 第一試薬に用いる凝集剤および２価の金属塩を種々組み換える以外は実施例１
の本法と同様の操作を行い、血清検体３０検体を日立７２５０自動分析機（検体
４μｌ、第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）でそれぞれ測定した
。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）でみた。 【００１９】 結果を第２表に示す。 第一試薬の組成 【００２０】 【表２】 【００２１】 実施例３ 第一試薬に添加される２価の金属塩の種類を変え添加量を３０ｍＭとして実施
例１の本法と同様の操作を行い、血清検体３０検体を日立７２５０自動分析機（
検体４μｌ、第一試薬３００μｌ、第二試薬１００μｌの条件）でそれぞれ測定
した。沈澱法との相関を相関係数（Ｒ）でみた。 【００２２】 結果を第３表に示す。 組成 【００２３】 【表３】【００２４】 実施例４ サンブライト４００１（日本油脂）を用いコレステロールエステラーゼおよび
コレステロールオキシダーゼをポリエチレングリコール（分子量６０００）で化
学修飾し、これを用いて下記に示す組成で実施例１の本法と同様の操作を行った
。 結果を第４表に示す。 【００２５】 なお、化学修飾は、以下のようにして行った。 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解させて５℃
に冷却後、これに２０倍モルのサンブライト４００１を添加して溶解させ、５℃
で４時間反応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せずそのまま酵素溶液
として用いた。 【００２６】 組成 【００２７】 【表４】 【００２８】 実施例５組成 【００２９】 リンタングステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコレステロール
濃度が３８．９ｍｇ／ｄｌと測定された検体５０μｌを上記試薬３ｍｌに添加し
、２０秒後に一旦５５５ｎｍの吸光度を測定した（Ｅ１）。次いで、３７℃で５
分間インキュベーションし、直ちに同波長における吸光度を測定した（Ｅ２）。
ＨＤＬコレステロールの濃度は、コレステロール濃度２００ｍｇ／ｄｌの標準液
を用いて同様の操作を行い、（Ｅ２−Ｅ１）の値を比較することにより算出した
。その結果、ＨＤＬコレステロール濃度は３９．１ｍｇ／ｄｌと算出され、沈澱
法で得られた結果とほぼ一致した。 【００３０】 実施例６ （１）デキストランを修飾する試薬であるＴ４０，ＴＣＴ−ａｃｔｉｖａｔｅ
ｄ（ベーリンガー社製）でコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオ
キシダーゼを化学修飾したもの、（２）ポリウレタンを修飾する試薬であるポリ
ウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（ベーリンガー社製）でコレステロー
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを化学修飾したもの、および （３）１，３−プロパンサルトンでコレステロールエステラーゼおよびコレステ
ロールオキシダーゼを化学修飾したものを用い、また、検体としてリンタングス
テン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法でＨＤＬコレステロール濃度が３８．９
ｍｇ／ｄｌと測定された検体５０μｌを用いて、実施例４と同様の操作を行った
。その結果、ＨＤＬコレステロール濃度はそれぞれ（１）３９．７ｍｇ／ｄｌ、
（２）３８．２ｍｇ／ｄｌおよび（３）３９．０ｍｇ／ｄｌと算出され、沈澱法
で得られた結果とほぼ一致した。 【００３１】 なお、化学修飾は、以下のようにして行った。 （１），（２） ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）
を溶解させて５℃に冷却後、これに２０倍モルのＴ４０，ＴＣＴ−ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄまたはポリウレタンＰ４０００−ａｃｔｉｖａｔｅｄを添加して溶解させ
、５℃で４時間反応させた。得られた化学修飾酵素は、精製分離せずそのまま酵
素溶液として用いた。 【００３２】 （３） ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）に酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）を溶解さ
せ、これに２０倍モルの１，３−プロパンサルトンのジメチルホルムアミド溶液
（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２４時間反応させた。得られた化学修飾
酵素は、精製分離せずそのまま酵素溶液として用いた。 【００３３】 【発明の効果】 本発明により、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの定
量法が提供される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）以外のリポ蛋白を凝集させる試薬を
   含む緩衝液の存在下、ＨＤＬを含有する試料にコレステロールエステル加水分解
   酵素およびコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を作用させ
   て、生成した凝集物を分離することなく、凝集物が存在したまま緩衝液中に生成
   する過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とするＨＤＬ中のコレ
   ステロールの定量法。 【請求項２】 ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬がヘパリンまたはその
   塩、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ポリエ
   チレングリコール、硫酸化オリゴ糖またはその塩もしくはこれらの混合物、およ
   び２価の金属塩からなる請求項１記載のＨＤＬ中のコレステロールの定量法。 【請求項３】 コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵
   素またはコレステロール脱水素酵素が化学修飾されたコレステロールエステラー
   ゼ、化学修飾されたコレステロールオキシダーゼまたは化学修飾されたコレステ
   ロールデヒドロゲナーゼである請求項１記載のＨＤＬ中のコレステロールの定量
   法。