JPH07301636A - 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 - Google Patents
高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法Info
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- JPH07301636A JPH07301636A JP6089431A JP8943194A JPH07301636A JP H07301636 A JPH07301636 A JP H07301636A JP 6089431 A JP6089431 A JP 6089431A JP 8943194 A JP8943194 A JP 8943194A JP H07301636 A JPH07301636 A JP H07301636A
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- alkyl
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 煩雑な分画分離操作の不要な簡便な高密度リ
ポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロールの定量法を提供す
る。 【構成】 糖化合物および／または蛋白可溶化剤存在
下、試料中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ
蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）中のコ
レステロール量を測定し、試料中の総コレステロール量
との差を求めることを特徴とするＨＤＬ中のコレステロ
ールの定量法、および糖化合物および／または蛋白可溶
化剤存在下、試料中のＨＤＬ中のコレステロール量を測
定することを特徴とするＨＤＬ中のコレステロールの定
量法。
ポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロールの定量法を提供す
る。 【構成】 糖化合物および／または蛋白可溶化剤存在
下、試料中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ
蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）中のコ
レステロール量を測定し、試料中の総コレステロール量
との差を求めることを特徴とするＨＤＬ中のコレステロ
ールの定量法、および糖化合物および／または蛋白可溶
化剤存在下、試料中のＨＤＬ中のコレステロール量を測
定することを特徴とするＨＤＬ中のコレステロールの定
量法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床診断の分野におい
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）に含
まれるコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと
いう）の定量法に関する。
て脂質代謝の面で重要な高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）に含
まれるコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールと
いう）の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコ
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤ
Ｌを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（Ｖ
ＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在す
るアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤ
Ｌコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９
版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したＨＤＬ画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人的誤差も生
じ易い。以上のように、ＨＤＬコレステロール測定の煩
雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純にＨ
ＤＬを分画せずに血清検体を直接コレステロールエステ
ラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試薬
に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わり
がなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭６３−１２６４９８には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、ＨＤＬのみならずＬＤＬ、ＶＬＤＬなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
レステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステ
ロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとす
る各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベ
ルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となること
が知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法
は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の
２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学
的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用
いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤ
Ｌを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかし
ながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点があ
る。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡
散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、こ
れらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、
正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。
電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜
やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法に
よりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、
経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合に
は、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（Ｖ
ＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在す
るアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リ
ンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオ
ンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成さ
せ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤ
Ｌコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９
版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。こ
の方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離
操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検
査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向き
である。さらに、従来の分画法では、分離したＨＤＬ画
分を定量ピペットではかり取る場合などに人的誤差も生
じ易い。以上のように、ＨＤＬコレステロール測定の煩
雑さは、その分画操作にある。しかしながら、単純にＨ
ＤＬを分画せずに血清検体を直接コレステロールエステ
ラーゼとコレステロールオキシダーゼが含有された試薬
に添加しても、総コレステロールを定量する系と変わり
がなく、ＨＤＬコレステロールを特異的に定量できな
い。特開昭６３−１２６４９８には、コール酸類を添加
してその特異性を高めることが記載されているが、この
方法では、ＨＤＬのみならずＬＤＬ、ＶＬＤＬなども徐
々に反応し完全な反応終点が得られにくいことにより、
特異性が必ずしも充分でない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、煩雑
な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの
定量法を提供することにある。
な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの
定量法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、糖化合物
および／または蛋白可溶化剤を存在させたコレステロー
ル測定試薬の系により超遠心で分画されたＨＤＬ、ＬＤ
Ｌ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各リポ蛋白を用いて測定した
ところ、糖化合物および／または蛋白可溶化剤の組み合
わせにより各リポ蛋白との反応性が異なり、その結果Ｈ
ＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬ
コレステロール、ＣＭコレステロールの反応性が異なる
ことを見い出し、本発明に至った。
および／または蛋白可溶化剤を存在させたコレステロー
ル測定試薬の系により超遠心で分画されたＨＤＬ、ＬＤ
Ｌ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各リポ蛋白を用いて測定した
ところ、糖化合物および／または蛋白可溶化剤の組み合
わせにより各リポ蛋白との反応性が異なり、その結果Ｈ
ＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬ
コレステロール、ＣＭコレステロールの反応性が異なる
ことを見い出し、本発明に至った。
【０００５】本発明は、糖化合物および／または蛋白可
溶化剤存在下、試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中
のコレステロール量を測定し、試料中の総コレステロー
ル量との差を求めることを特徴とするＨＤＬコレステロ
ールの定量法に関する。また、本発明により、糖化合物
および／または蛋白可溶化剤存在下、試料中のＨＤＬ中
のコレステロール量を測定することを特徴とするＨＤＬ
コレステロールの定量法を提供することができる。
溶化剤存在下、試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中
のコレステロール量を測定し、試料中の総コレステロー
ル量との差を求めることを特徴とするＨＤＬコレステロ
ールの定量法に関する。また、本発明により、糖化合物
および／または蛋白可溶化剤存在下、試料中のＨＤＬ中
のコレステロール量を測定することを特徴とするＨＤＬ
コレステロールの定量法を提供することができる。
【０００６】糖化合物としては、一般式（Ｉ）
【０００７】
【化１０】
【０００８】〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一また
は異なって水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換
もしくは非置換のアルカノイル、スルホ、−（グルコシ
ル）p−Ｈ（式中、ｐは１または２を表す）または−
（マルトシル）q −Ｈ（式中、ｑは１または２を表す）
を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表される化合物ま
たは一般式（II）
は異なって水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換
もしくは非置換のアルカノイル、スルホ、−（グルコシ
ル）p−Ｈ（式中、ｐは１または２を表す）または−
（マルトシル）q −Ｈ（式中、ｑは１または２を表す）
を表し、ｍは６〜８の整数を表す〕で表される化合物ま
たは一般式（II）
【０００９】
【化１１】
【００１０】（式中、Ｒ4 は水素またはＮａを表し、ｎ
は５〜２０００の整数を表す）で表される化合物が好ま
しく用いられる。また、試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよ
びＣＭ中のコレステロール量を測定する際の蛋白可溶化
剤としては、一般式（III ）
は５〜２０００の整数を表す）で表される化合物が好ま
しく用いられる。また、試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよ
びＣＭ中のコレステロール量を測定する際の蛋白可溶化
剤としては、一般式（III ）
【００１１】
【化１２】
【００１２】〔式中、ａは１〜２００の整数を表し、ｂ
は０または１を表し、Ｒ5 はＲ14−Ｘ−Ｏ−（式中、Ｒ
14はアルキルまたはアルケニルを表し、Ｘは単結合また
はＣＯを表す）またはＨ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）c −Ｎ
（Ｒ15）−（式中、ｃは１〜２００の整数を表し、Ｒ15
はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、Ｒ6 はア
ルキルまたはアルケニルを表す〕で表される化合物、一
般式（IV）
は０または１を表し、Ｒ5 はＲ14−Ｘ−Ｏ−（式中、Ｒ
14はアルキルまたはアルケニルを表し、Ｘは単結合また
はＣＯを表す）またはＨ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）c −Ｎ
（Ｒ15）−（式中、ｃは１〜２００の整数を表し、Ｒ15
はアルキルまたはアルケニルを表す）を表し、Ｒ6 はア
ルキルまたはアルケニルを表す〕で表される化合物、一
般式（IV）
【００１３】
【化１３】
【００１４】（式中、Ｒ7 、Ｒ8 、Ｒ9 、Ｒ10、Ｒ11お
よびＲ12は同一または異なってアルカノイルを表す）で
表される化合物または一般式（Ｖ）
よびＲ12は同一または異なってアルカノイルを表す）で
表される化合物または一般式（Ｖ）
【００１５】
【化１４】
【００１６】〔式中、Ｒ13はアルキルまたはアルケニル
を表し、Ｙは
を表し、Ｙは
【００１７】
【化１５】
【００１８】−Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ16）−（式中、Ｒ16は
アルキルまたはアルケニルを表す）、−ＣＨ2 ＣＨ（Ｏ
Ｈ）（ＣＨ2 ）d −（式中、ｄは１〜２２の整数を表
す）、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）e −（式中、ｅは１〜２
２の整数を表す）、−ＯＣＯＣＨ（ＣＨ2 ＣＯＯＲ17）
−（式中、Ｒ17はアルキルまたはアルケニルを表す）ま
たはこれらの混合物を表す〕で表される化合物が、試料
中のＨＤＬ中のコレステロール量を測定する際の蛋白可
溶化剤としては、一般式（VI）
アルキルまたはアルケニルを表す）、−ＣＨ2 ＣＨ（Ｏ
Ｈ）（ＣＨ2 ）d −（式中、ｄは１〜２２の整数を表
す）、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2 ）e −（式中、ｅは１〜２
２の整数を表す）、−ＯＣＯＣＨ（ＣＨ2 ＣＯＯＲ17）
−（式中、Ｒ17はアルキルまたはアルケニルを表す）ま
たはこれらの混合物を表す〕で表される化合物が、試料
中のＨＤＬ中のコレステロール量を測定する際の蛋白可
溶化剤としては、一般式（VI）
【００１９】
【化１６】
【００２０】（式中、Ｒ18はアルキルまたはアルケニル
を表す）で表される化合物、一般式（VII ）
を表す）で表される化合物、一般式（VII ）
【００２１】
【化１７】
【００２２】（式中、Ｒ19はアルキルまたはアルケニル
を表す）で表される化合物、一般式（VIII）
を表す）で表される化合物、一般式（VIII）
【００２３】
【化１８】
【００２４】（式中、ｆは１〜１００の整数を表し、Ｒ
20はアルキルを表す）で表される化合物または胆汁酸類
が好ましく用いられる。以下、一般式（Ｉ）〜一般式
（VIII）で表される化合物をそれぞれ化合物（Ｉ）〜化
合物（VIII）という。一般式（Ｉ）〜一般式（VIII）の
各基の定義において、アルキルおよびアルカノイルのア
ルキル部分としては、直鎖または分枝状の炭素数１〜２
２の、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘ
プチル、デシル、ペンタデシル、イコサニル、ドコサニ
ルなどがあげられ、アルケニルとしては、炭素数２〜２
２の、例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテ
ニル、ヘキセニル、ヘプテニル、デセニル、ペンタデセ
ニル、イコセニル、ドコセニルなどがあげられる。
20はアルキルを表す）で表される化合物または胆汁酸類
が好ましく用いられる。以下、一般式（Ｉ）〜一般式
（VIII）で表される化合物をそれぞれ化合物（Ｉ）〜化
合物（VIII）という。一般式（Ｉ）〜一般式（VIII）の
各基の定義において、アルキルおよびアルカノイルのア
ルキル部分としては、直鎖または分枝状の炭素数１〜２
２の、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert- ブチル、
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘ
プチル、デシル、ペンタデシル、イコサニル、ドコサニ
ルなどがあげられ、アルケニルとしては、炭素数２〜２
２の、例えば、ビニル、プロペニル、ブテニル、ペンテ
ニル、ヘキセニル、ヘプテニル、デセニル、ペンタデセ
ニル、イコセニル、ドコセニルなどがあげられる。
【００２５】置換アルキルおよび置換アルカノイルの置
換基としては、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スル
ホなどがあげられる。胆汁酸類としては、例えば一般式
（IX）
換基としては、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スル
ホなどがあげられる。胆汁酸類としては、例えば一般式
（IX）
【００２６】
【化１９】
【００２７】〔式中、Ｒ21およびＲ22は同一または異な
って水素、−ＯＲ25（式中、Ｒ25は水素、スルホまたは
ＳＯ3 Ｎａを表す）またはオキソを表し、Ｒ23は水素ま
たは−ＯＲ25（式中、Ｒ25は前記と同義である）を表
し、Ｒ24は水素、アルキル、アルケニルまたは金属を表
す〕で表される化合物があげられる。金属としては、ナ
トリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウ
ム、カルシウムなどのアルカリ土類金属などがあげら
れ、アルキルおよびアルケニルは前記と同義である。
って水素、−ＯＲ25（式中、Ｒ25は水素、スルホまたは
ＳＯ3 Ｎａを表す）またはオキソを表し、Ｒ23は水素ま
たは−ＯＲ25（式中、Ｒ25は前記と同義である）を表
し、Ｒ24は水素、アルキル、アルケニルまたは金属を表
す〕で表される化合物があげられる。金属としては、ナ
トリウム、カリウムなどのアルカリ金属、マグネシウ
ム、カルシウムなどのアルカリ土類金属などがあげら
れ、アルキルおよびアルケニルは前記と同義である。
【００２８】糖化合物としては、化合物（Ｉ）または化
合物（II）の中でもシクロデキストリン誘導体が、特に
メチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられ
る。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シ
クロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリ
ン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−
ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２−ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−
シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキスト
リン、マルトシル−β−シクロデキストリン、パーシャ
リーメチル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキ
ストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフ
ェートなどがあげられる。
合物（II）の中でもシクロデキストリン誘導体が、特に
メチル化シクロデキストリンなどが好ましく用いられ
る。例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキ
ストリン、γ−シクロデキストリン、ジメチル−β−シ
クロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリ
ン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−
ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、２−ヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、カルボキ
シメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−
シクロデキストリン、マルトシル−α−シクロデキスト
リン、マルトシル−β−シクロデキストリン、パーシャ
リーメチル−β−シクロデキストリン、α−シクロデキ
ストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフ
ェートなどがあげられる。
【００２９】試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中の
コレステロール量を測定する際の蛋白可溶化剤として
は、化合物（III ）、化合物（IV）または化合物（Ｖ）
などの界面活性剤の中でも、特にノニオン系界面活性
剤、アニオン系界面活性剤などが好ましく用いられる。
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエ
チレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエ
ーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン
ベヘニルエーテル、ポリオキシエチレンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオキシ
エチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンラウリル
アミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン、しょ糖
脂肪酸エステルなどがあげられ、アニオン系界面活性剤
としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウム、高級アルコール硫酸エス
テルソーダなどがあげられる。
コレステロール量を測定する際の蛋白可溶化剤として
は、化合物（III ）、化合物（IV）または化合物（Ｖ）
などの界面活性剤の中でも、特にノニオン系界面活性
剤、アニオン系界面活性剤などが好ましく用いられる。
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエ
チレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエ
ーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリ
オキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン
ベヘニルエーテル、ポリオキシエチレンモノラウレー
ト、ポリオキシエチレンモノステアレート、ポリオキシ
エチレンモノオレエート、ポリオキシエチレンラウリル
アミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン、しょ糖
脂肪酸エステルなどがあげられ、アニオン系界面活性剤
としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、ノルマルドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、ラウリル硫酸ナトリウム、高級アルコール硫酸エス
テルソーダなどがあげられる。
【００３０】試料中のＨＤＬ中のコレステロール量を測
定する際の蛋白可溶化剤としては、化合物（VI）、化合
物（VII ）、化合物（VIII）または胆汁酸類などの界面
活性剤の中でも、特にカチオン系界面活性剤、アニオン
系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、胆汁酸塩などが
好ましく用いられる。カチオン系界面活性剤としては、
例えば、オキシエチレンドデシルアミン、ポリオキシエ
チレンドデシルアミン、ポリオキシエチレンオクタデシ
ルアミンなどがあげられ、アニオン系界面活性剤として
は、例えば、ココイルメチルタウリン酸ナトリウム、ラ
ウロイルメチルタウリン酸ナトリウム、ミリストイルメ
チルタウリン酸ナトリウム、パルミトイルメチルタウリ
ン酸ナトリウム、ステアロイルメチルタウリン酸ナトリ
ウムなどがあげられ、ノニオン系界面活性剤としては、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテルなどがあげら
れ、胆汁酸塩としては、例えば、コール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナ
トリウム、ウルソデオキシコール酸ナトリウム、リトコ
ール酸ナトリウム、イソケノデオキシコール酸ナトリウ
ム、７−オキソリトコール酸ナトリウム、１２−オキソ
リトコール酸ナトリウム、１２−オキソケノデオキシコ
ール酸ナトリウム、７−オキソデオキシコール酸ナトリ
ウムなどがあげられる。
定する際の蛋白可溶化剤としては、化合物（VI）、化合
物（VII ）、化合物（VIII）または胆汁酸類などの界面
活性剤の中でも、特にカチオン系界面活性剤、アニオン
系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、胆汁酸塩などが
好ましく用いられる。カチオン系界面活性剤としては、
例えば、オキシエチレンドデシルアミン、ポリオキシエ
チレンドデシルアミン、ポリオキシエチレンオクタデシ
ルアミンなどがあげられ、アニオン系界面活性剤として
は、例えば、ココイルメチルタウリン酸ナトリウム、ラ
ウロイルメチルタウリン酸ナトリウム、ミリストイルメ
チルタウリン酸ナトリウム、パルミトイルメチルタウリ
ン酸ナトリウム、ステアロイルメチルタウリン酸ナトリ
ウムなどがあげられ、ノニオン系界面活性剤としては、
例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオ
キシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステ
アリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテルなどがあげら
れ、胆汁酸塩としては、例えば、コール酸ナトリウム、
デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナ
トリウム、ウルソデオキシコール酸ナトリウム、リトコ
ール酸ナトリウム、イソケノデオキシコール酸ナトリウ
ム、７−オキソリトコール酸ナトリウム、１２−オキソ
リトコール酸ナトリウム、１２−オキソケノデオキシコ
ール酸ナトリウム、７−オキソデオキシコール酸ナトリ
ウムなどがあげられる。
【００３１】本発明は、糖化合物および／または蛋白可
溶化剤をコレステロール測定試薬系と共存させる点に特
徴を有するものであり、コレステロール測定系自体は下
記の反応原理に基づく一般法に従うものである。ただ
し、色原体および測定波長はこれに限定されるものでは
ない。
溶化剤をコレステロール測定試薬系と共存させる点に特
徴を有するものであり、コレステロール測定系自体は下
記の反応原理に基づく一般法に従うものである。ただ
し、色原体および測定波長はこれに限定されるものでは
ない。
【００３２】
【数１】
【００３３】コレステロールエステル加水分解酵素ある
いはコレステロール酸化酵素としては、通常市販されて
いる、コレステロールエステルを加水分解する能力を有
する微生物または動物由来のコレステロールエステラー
ゼやリポプロテインリパーゼ、コレステロールを酸化し
て過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールオ
キシダーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、
安定性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを
主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピ
ル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いら
れる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
いはコレステロール酸化酵素としては、通常市販されて
いる、コレステロールエステルを加水分解する能力を有
する微生物または動物由来のコレステロールエステラー
ゼやリポプロテインリパーゼ、コレステロールを酸化し
て過酸化水素を生成する微生物由来のコレステロールオ
キシダーゼなどがあげられるが、これら酵素の特異性、
安定性をさらにあげるためにポリエチレングリコールを
主成分とする基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピ
ル基などで上記の酵素を化学的に修飾したものも用いら
れる。また、遺伝子操作により得られる酵素も用いられ
る。
【００３４】本発明方法は、血液、尿などのＨＤＬを含
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法につい
て説明する。本発明を実施するに際しては、まず、糖化
合物溶液および／または蛋白可溶化剤溶液を調製する。
糖化合物溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、
反応時に例えば１００ｍＭ以下、好ましくは３〜８０ｍ
Ｍの濃度になるように調製する。なお、糖化合物はあら
かじめコレステロール測定試薬中に共存させておいても
よい。蛋白可溶化剤溶液は、コレステロール測定試薬と
共存させ、反応時に例えば５０ｇ／ｌ以下、好ましくは
０．１〜２０ｇ／ｌの濃度になるように調製する。試薬
は、糖化合物溶液および／またはコレステロール測定試
薬が共存した蛋白可溶化剤溶液から調製し、２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃で約５分保温する。次い
で、上記試薬に試料そのものもしくは必要に応じて水あ
るいは生理食塩水で希釈した試料を加え、５〜３０分間
反応させる。反応終了後、反応液の吸光度を５００〜６
００ｎｍ、例えば５５５ｎｍで測定し、コレステロール
量を算出する。試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中
のコレステロール量を測定した場合には、別に総コレス
テロール量を求め、これらの差を求めることによりＨＤ
Ｌコレステロールが定量できる。
有する体液に適用できる。次に、本発明の定量法につい
て説明する。本発明を実施するに際しては、まず、糖化
合物溶液および／または蛋白可溶化剤溶液を調製する。
糖化合物溶液は、糖化合物を適当な緩衝液、例えば５０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、
反応時に例えば１００ｍＭ以下、好ましくは３〜８０ｍ
Ｍの濃度になるように調製する。なお、糖化合物はあら
かじめコレステロール測定試薬中に共存させておいても
よい。蛋白可溶化剤溶液は、コレステロール測定試薬と
共存させ、反応時に例えば５０ｇ／ｌ以下、好ましくは
０．１〜２０ｇ／ｌの濃度になるように調製する。試薬
は、糖化合物溶液および／またはコレステロール測定試
薬が共存した蛋白可溶化剤溶液から調製し、２０〜５０
℃、好ましくは３０〜４０℃で約５分保温する。次い
で、上記試薬に試料そのものもしくは必要に応じて水あ
るいは生理食塩水で希釈した試料を加え、５〜３０分間
反応させる。反応終了後、反応液の吸光度を５００〜６
００ｎｍ、例えば５５５ｎｍで測定し、コレステロール
量を算出する。試料中のＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭ中
のコレステロール量を測定した場合には、別に総コレス
テロール量を求め、これらの差を求めることによりＨＤ
Ｌコレステロールが定量できる。
【００３５】血清から超遠心により分画されたＨＤＬ、
ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各フラクションを使用し
て上記試薬によりコレステロール量を測定した。その結
果、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせによりＨ
ＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬ
コレステロール、ＣＭコレステロールの反応性が異な
り、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより各
リポ蛋白との反応性が異なることが確認された。
ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各フラクションを使用し
て上記試薬によりコレステロール量を測定した。その結
果、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせによりＨ
ＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、ＶＬＤＬ
コレステロール、ＣＭコレステロールの反応性が異な
り、糖化合物および蛋白可溶化剤の組み合わせにより各
リポ蛋白との反応性が異なることが確認された。
【００３６】コレステロール測定試薬に糖化合物５ｍＭ
および蛋白可溶化剤ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白
の反応性の差を第１表に示す。
および蛋白可溶化剤ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白
の反応性の差を第１表に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】コレステロール測定試薬に糖化合物ジメチ
ル−β−シクロデキストリン５ｍＭおよび蛋白可溶化剤
５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第２表に示す。
ル−β−シクロデキストリン５ｍＭおよび蛋白可溶化剤
５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第２表に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】コレステロール測定試薬に糖化合物５ｍＭ
および蛋白可溶化剤オキシエチレンドデシルアミン５ｇ
／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応
性の差を第３表に示す。
および蛋白可溶化剤オキシエチレンドデシルアミン５ｇ
／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の反応
性の差を第３表に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】コレステロール測定試薬に糖化合物ジメチ
ル−β−シクロデキストリン５ｍＭおよび蛋白可溶化剤
５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第４表に示す。
ル−β−シクロデキストリン５ｍＭおよび蛋白可溶化剤
５ｇ／ｌを組み合わせて共存させたときの各リポ蛋白の
反応性の差を第４表に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】第１表〜第４表に示されるように、第１表
または第２表の組み合わせの場合はＬＤＬ、ＶＬＤＬお
よびＣＭ中のコレステロール量から間接的にＨＤＬ中の
コレステロール量を測定することができ、第３表または
第４表の組み合わせの場合は直接的にＨＤＬ中のコレス
テロール量を測定することができる。次に、実施例によ
って本発明の態様を説明する。
または第２表の組み合わせの場合はＬＤＬ、ＶＬＤＬお
よびＣＭ中のコレステロール量から間接的にＨＤＬ中の
コレステロール量を測定することができ、第３表または
第４表の組み合わせの場合は直接的にＨＤＬ中のコレス
テロール量を測定することができる。次に、実施例によ
って本発明の態様を説明する。
【００４５】
実施例１ ジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、ポリオ
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬を調
製した。試料としては、血清から超遠心で分画されたＬ
ＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの混合サンプルを用いた。あらか
じめ３７℃で加温した上記試薬３ｍｌにサンプル５０μ
ｌを混和し、３７℃で１５分間反応させ、得られた溶液
の５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬を調
製した。試料としては、血清から超遠心で分画されたＬ
ＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの混合サンプルを用いた。あらか
じめ３７℃で加温した上記試薬３ｍｌにサンプル５０μ
ｌを混和し、３７℃で１５分間反応させ、得られた溶液
の５５５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４６】その結果を第１図に示す。第１図は、ＬＤ
Ｌ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレステロール濃度と吸光度との相
関関係を示すもので、ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレステ
ロール濃度は吸光度とよい相関を示した。
Ｌ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレステロール濃度と吸光度との相
関関係を示すもので、ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレステ
ロール濃度は吸光度とよい相関を示した。
【００４７】実施例２ 血清から超遠心で分画されたＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの
混合サンプルの代わりに血清サンプルを用いる以外は実
施例１と同様の操作を行って吸光度を測定し、第１図を
基準に血清サンプル中のＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレス
テロール濃度（Ａ）を求めた。別に、血清サンプル中の
総コレステロール濃度（Ｂ）を、酵素法のコレステロー
ル測定試薬で測定し、求めた。ＨＤＬコレステロール濃
度は［（Ｂ）−（Ａ）］とした。対照法として、デキス
トラン硫酸−リンタングステン酸−Ｍｇ沈殿法〔デタミ
ナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕（臨床化
学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９８７年）
を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度
を求めた。
混合サンプルの代わりに血清サンプルを用いる以外は実
施例１と同様の操作を行って吸光度を測定し、第１図を
基準に血清サンプル中のＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレス
テロール濃度（Ａ）を求めた。別に、血清サンプル中の
総コレステロール濃度（Ｂ）を、酵素法のコレステロー
ル測定試薬で測定し、求めた。ＨＤＬコレステロール濃
度は［（Ｂ）−（Ａ）］とした。対照法として、デキス
トラン硫酸−リンタングステン酸−Ｍｇ沈殿法〔デタミ
ナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕（臨床化
学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９８７年）
を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度
を求めた。
【００４８】その結果、本発明の方法による結果は沈殿
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
８３２０（ｎ＝２０）〕。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
８３２０（ｎ＝２０）〕。
【００４９】実施例３ ジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、ポリオ
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代
わりにヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン（１
０ｍＭ）、ポリオキシエチレンモノラウレート（０．５
ｇ／ｌ）、コレステロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍ
ｌ）、コレステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍ
ｌ）、４−アミノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳ
Ｅ（１．１ｍＭ）、３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７
５）からなる試薬を用いる以外は実施例２と同様の操作
を行い、沈殿法による結果と比較した。
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代
わりにヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン（１
０ｍＭ）、ポリオキシエチレンモノラウレート（０．５
ｇ／ｌ）、コレステロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍ
ｌ）、コレステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍ
ｌ）、４−アミノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳ
Ｅ（１．１ｍＭ）、３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７
５）からなる試薬を用いる以外は実施例２と同様の操作
を行い、沈殿法による結果と比較した。
【００５０】その結果を第５表に示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】第５表に示すように、本発明の方法による
結果は沈殿法による結果と良好な相関を示した。
結果は沈殿法による結果と良好な相関を示した。
【００５３】実施例４ ジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、ポリオ
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代
わりにジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、
コレステロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレ
ステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミ
ノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍ
Ｍ）および３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）から
なる試薬を用いる以外は実施例２と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
キシエチレンラウリルアミン（５ｇ／ｌ）、コレステロ
ールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロール
オキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチピ
リン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）および３
０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代
わりにジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、
コレステロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレ
ステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミ
ノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍ
Ｍ）および３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）から
なる試薬を用いる以外は実施例２と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
【００５４】その結果、本発明の方法による結果は沈殿
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
９６９（ｎ＝２０）〕。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
９６９（ｎ＝２０）〕。
【００５５】実施例５ ジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、オキシ
エチレンドデシルアミン（０．２５ｇ／ｌ）、コレステ
ロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロー
ルオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）、３０
ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬を調製
した。試料としては、血清から超遠心で分画されたＨＤ
Ｌのサンプルを用いた。あらかじめ３７℃で加温した上
記試薬３ｍｌにサンプル５０μｌを混和し、３７℃で１
５分間反応させ、得られた溶液の５５５ｎｍにおける吸
光度を測定した。
エチレンドデシルアミン（０．２５ｇ／ｌ）、コレステ
ロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロー
ルオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）、３０
ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬を調製
した。試料としては、血清から超遠心で分画されたＨＤ
Ｌのサンプルを用いた。あらかじめ３７℃で加温した上
記試薬３ｍｌにサンプル５０μｌを混和し、３７℃で１
５分間反応させ、得られた溶液の５５５ｎｍにおける吸
光度を測定した。
【００５６】その結果を第２図に示す。第２図は、ＨＤ
Ｌコレステロール濃度と吸光度との相関関係を示すもの
で、ＨＤＬコレステロール濃度は吸光度とよい相関を示
した。
Ｌコレステロール濃度と吸光度との相関関係を示すもの
で、ＨＤＬコレステロール濃度は吸光度とよい相関を示
した。
【００５７】実施例６ 血清から超遠心で分画されたＨＤＬのサンプルの代わり
に血清サンプルを用いる以外は実施例５と同様の操作を
行って吸光度を測定し、第２図を基準に血清サンプル中
のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として、
デキストラン硫酸−リンタングステン酸−Ｍｇ沈殿法
〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕
（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９
８７年）を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロ
ール濃度を求めた。
に血清サンプルを用いる以外は実施例５と同様の操作を
行って吸光度を測定し、第２図を基準に血清サンプル中
のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として、
デキストラン硫酸−リンタングステン酸−Ｍｇ沈殿法
〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕
（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９
８７年）を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロ
ール濃度を求めた。
【００５８】その結果、本発明の方法による結果は沈殿
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
８８９（ｎ＝２０）〕。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
８８９（ｎ＝２０）〕。
【００５９】実施例７ ジメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、オキシ
エチレンドデシルアミン（０．２５ｇ／ｌ）、コレステ
ロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロー
ルオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）、３０
ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代わ
りにコール酸ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ）、ポリエチレ
ングリコールで修飾したコレステロールエステラーゼ
（１．０Ｕ／ｍｌ）、ポリエチレングリコールで修飾し
たコレステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４
−アミノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．
１ｍＭ）、３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）から
なる試薬を用いる以外は実施例６と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
エチレンドデシルアミン（０．２５ｇ／ｌ）、コレステ
ロールエステラーゼ（１．０Ｕ／ｍｌ）、コレステロー
ルオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４−アミノアンチ
ピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．１ｍＭ）、３０
ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）からなる試薬の代わ
りにコール酸ナトリウム（５ｍｇ／ｍｌ）、ポリエチレ
ングリコールで修飾したコレステロールエステラーゼ
（１．０Ｕ／ｍｌ）、ポリエチレングリコールで修飾し
たコレステロールオキシダーゼ（５．０Ｕ／ｍｌ）、４
−アミノアンチピリン（２．２ｍＭ）、ＥＭＳＥ（１．
１ｍＭ）、３０ｍＭグッド緩衝液（ｐＨ６．７５）から
なる試薬を用いる以外は実施例６と同様の操作を行い、
沈殿法による結果と比較した。
【００６０】その結果、本発明の方法による結果は沈殿
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
９８０（ｎ＝４０）〕。
法による結果と良好な相関を示した〔相関係数ｒ＝０．
９８０（ｎ＝４０）〕。
【００６１】
【発明の効果】本発明により、煩雑な分画分離操作の不
要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供され
る。
要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供され
る。
【図１】ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋ＣＭコレステロール濃度と
本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示
すものである。
本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示
すものである。
【図２】ＨＤＬコレステロール濃度と本発明の方法によ
り測定された吸光度との相関関係を示すものである。
り測定された吸光度との相関関係を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 21/31 Ｚ 21/77 Ｂ (72)発明者 杉内 博幸 熊本県熊本市長嶺町1675−31 (72)発明者 入江 徹美 熊本県熊本市健軍町2484−17 (72)発明者 上釜 兼人 熊本県熊本市長嶺町1716−80 (72)発明者 大澤 進 千葉県四街道市みそら４−17−９
Claims (7)
- 【請求項１】 糖化合物および／または蛋白可溶化剤存
在下、試料中の低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リ
ポ蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）中の
コレステロール量を測定し、試料中の総コレステロール
量との差を求めることを特徴とする高密度リポ蛋白（Ｈ
ＤＬ）中のコレステロールの定量法。 - 【請求項２】 糖化合物および／または蛋白可溶化剤存
在下、試料中のＨＤＬ中のコレステロール量を測定する
ことを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量法。 - 【請求項３】 糖化合物が一般式（Ｉ） 【化１】 〔式中、Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 は同一または異なって水
素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置
換のアルカノイル、スルホ、−（グルコシル）p−Ｈ
（式中、ｐは１または２を表す）または−（マルトシ
ル）q −Ｈ（式中、ｑは１または２を表す）を表し、ｍ
は６〜８の整数を表す〕で表される化合物または一般式
（II） 【化２】 （式中、Ｒ4 は水素またはＮａを表し、ｎは５〜２００
０の整数を表す）で表される化合物である請求項１また
は請求項２記載の定量法。 - 【請求項４】 蛋白可溶化剤が一般式（III ） 【化３】 〔式中、ａは１〜２００の整数を表し、ｂは０または１
を表し、Ｒ5 はＲ14−Ｘ−Ｏ−（式中、Ｒ14はアルキル
またはアルケニルを表し、Ｘは単結合またはＣＯを表
す）またはＨ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）c −Ｎ（Ｒ15）−
（式中、ｃは１〜２００の整数を表し、Ｒ15はアルキル
またはアルケニルを表す）を表し、Ｒ6 はアルキルまた
はアルケニルを表す〕で表される化合物、一般式（IV） 【化４】 （式中、Ｒ7 、Ｒ8 、Ｒ9 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は同
一または異なってアルカノイルを表す）で表される化合
物または一般式（Ｖ） 【化５】 〔式中、Ｒ13はアルキルまたはアルケニルを表し、Ｙは 【化６】 −Ｏ−、−ＣＨ（Ｒ16）−（式中、Ｒ16はアルキルまた
はアルケニルを表す）、−ＣＨ2 ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ
2 ）d −（式中、ｄは１〜２２の整数を表す）、−ＣＨ
＝ＣＨ（ＣＨ2 ）e −（式中、ｅは１〜２２の整数を表
す）、−ＯＣＯＣＨ（ＣＨ2 ＣＯＯＲ17）−（式中、Ｒ
17はアルキルまたはアルケニルを表す）またはこれらの
混合物を表す〕で表される化合物である請求項１記載の
定量法。 - 【請求項５】 蛋白可溶化剤が一般式（VI） 【化７】 （式中、Ｒ18はアルキルまたはアルケニルを表す）で表
される化合物、一般式（VII ） 【化８】 （式中、Ｒ19はアルキルまたはアルケニルを表す）で表
される化合物または一般式（VIII） 【化９】 （式中、ｆは１〜１００の整数を表し、Ｒ20はアルキル
またはアルケニルを表す）で表される化合物である請求
項２記載の定量法。 - 【請求項６】 蛋白可溶化剤が胆汁酸類である請求項２
記載の定量法。 - 【請求項７】 試料中にコレステロールエステル加水分
解酵素およびコレステロール酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することからなるコレステロール量
を測定する方法において、使用するコレステロールエス
テル加水分解酵素またはコレステロール酸化酵素が化学
修飾されたコレステロールエステラーゼまたは化学修飾
されたコレステロールオキシダーゼである請求項１〜請
求項６記載の定量法。
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