DE69533387T2 - Verfahren zur bestimmung von cholesterin in high-density-lipoprotein - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Menge von Cholesterin in einem Lipoprotein hoher Dichte (HDL) [nachstehend als "HDL-Cholesterin" bezeichnet]. HDL ist für den Lipidstoffwechsel auf dem Gebiet der klinischen Diagnose wichtig.
- Es ist bekannt, dass HDL mit dem Entfernen von Cholesterin zusammenhängt, das sich in Zellen zur Aufnahme von Cholesterin aus Gewebe, einschließlich Arterienwänden, angesammelt hat, dass HDL ein negativer Risikofaktor für verschiedene Arten von Arteriosklerose, wie Koronararteriosklerose, ist, und dass der HDL-Spiegel im Blut ein geeignetes Anzeichen zur Vorhersage von Arteriosklerose ist. Das übliche Verfahren zur Bestimmung der Menge von HDL-Cholesterin besteht aus zwei Schritten, einem Fraktionierungsschritt und einem Schritt der Bestimmung der Cholesterinmenge. Beispiele für die Fraktionierung umfassen ein Ultrazentrifugationsverfahren, ein immunchemisches Verfahren, ein elektrophoretisches Verfahren und ein Ausfällungsverfahren. Bei dem Ultrazentrifugationsverfahren wird HDL durch das spezifische Gewicht unter Verwendung einer Ultrazentrifuge abgetrennt, um die Menge von HDL-Cholesterin zu bestimmen. Dieses Verfahren leidet jedoch an mangelnder Genauigkeit bei der Bestimmung, Komplexität und mangelnder ökonomischer Effizienz. Das immunchemische Verfahren umfasst ein immunelektrophoretisches Verfahren, ein "Einfacheradiale-Immunodiffusions"- (single radial immunodiffusion, SRID-) Verfahren und ein Ouchterlony-Diffusionsverfahren. Diese Verfahren sind jedoch dahingehend mangelhaft, dass ein Apoprotein erkannt, aber ein Lipoprotein nicht genau erkannt wird. Bei dem Elektrophoreseverfahren wird ein Celluloseacetatfilm oder ein Agarosegel als Träger abgetrennt, und die Menge an Cholesterin wird enzymatisch bestimmt. Diesem Verfahren mangelt es an Einfachheit und ökonomischer Effizienz. Bei dem Ausfällungsverfahren werden Polyethylenglycol oder ein Polyanion, wie Heparin, Phosphorwolframsäure und Dextranschwefelsäure, und ein zweiwertiges Kation an ein Apoprotein B, das auf den Oberflächen von Lipoprotein niedriger Dichte (low-density lipoprotein, LDL), Lipoproteins sehr niedriger Dichte (very-low-density lipoprotein, VLDL) und Chylomikronen (CM) vorhanden ist, unter Bildung eines unlöslichen Niederschlags gebunden, und dieser unlösliche Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt, um die Menge von HDL-Cholesterin im Überstand zu bestimmen (Summary of Clinical Investigation Method, 29. Ausgabe, Kanai I., Kanehara Shuppan, S. 471, 1983). Dieses Verfahren ist das einfachste. Wenn ein Autoanalyzer verwendet wird, der oft zur Messung einer großen Zahl von Proben, zur schnellen Messung und bei klinischer Untersuchung verwendet wird, ist dieses Verfahren jedoch nicht geeignet, da dieses Verfahren einen Zentrifugationsschritt durch eine Zentrifuge umfasst. Außerdem kann bei der Fraktionierung ein manueller Fehler auftreten, wenn zum Beispiel die Menge der abgetrennten HDL-Fraktion unter Verwendung einer Messpipette bestimmt wird. Folglich liegt die Komplexität der Bestimmung der Menge von HDL-Cholesterin im Fraktionierungsverfahren. Wenn jedoch eine Serumprobe direkt zu einem Reagenz hinzugefügt wird, das eine Cholesterinesterase und eine Cholesterinoxidase enthält, ohne das HDL zu fraktionieren, unterscheidet sich dieses Verfahren nicht von einem System zum Bestimmen der Gesamtmenge von Cholesterin, und die Menge von HDL-Cholesterin kann durch dieses Verfahren nicht spezifisch bestimmt werden. Die veröffentlichte ungeprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 126,498/1988 beschreibt, das eine Cholsäure zugesetzt wird, um die Spezifität zu steigern. Bei diesem Verfahren des Standes der Technik wird jedoch nicht nur HDL, sondern auch LDL, VLDL und dergleichen nach und nach umgesetzt, und es ist schwierig, einen eindeutigen Endpunkt der Umsetzung zu erhalten, und somit ist die Spezifität von HDL unter Verwendung dieses Verfahrens des Standes der Technik nicht zufriedenstellend.
- Die Erfinder haben die Menge von Cholesterin in Lipoproteinen, wie HDL, LDL, VLDL und CM, die jeweils durch Ultrazentrifugation fraktioniert wurden, unter Verwendung eines Reagenzes bestimmt, das eine Zuckerverbindung und ein Protein-löslichmachendes Mittel enthält, und gefunden, dass sich die Reaktionsfähigkeit jedes der Lipoproteine mit dem Reagenz je nach der Kombination der Zuckerverbindung und/oder des Protein-löslichmachenden Mittels im Reagenz unterscheidet, was zu dem Unterschied in der Reaktionsfähigkeit von HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin, VLDL-Cholesterin und CM-Cholesterin führt. Diese Erkenntnis führte zur Vollendung der vorliegenden Erfindung.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Bestimmen der Menge von HDL-Cholesterin, wie in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt.
- Bevorzugte Beispiele für die Zuckerverbindung umfassen ein Cyclodextrinderivat der Formel (I)wobei die Reste R1, R2 und R3 unabhängig Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkanoyl, Sulfo, -(Glucosyl)p-H (wobei p 1 oder 2 ist) oder -(Maltosyl)q-H (wobei q 1 oder 2 ist) sind und m eine ganze Zahl von 6 bis 8 ist, und ein Cyclodextrinderivat der Formel (II)
- Die Protein-löslichmachenden Mittel, die zum Bestimmen der Menge von Cholesterin jeweils in LDL, VLDL und CM in der Probe verwendet werden, sind aus den nachstehenden Verbindungen ausgewählt:
einer Verbindung der Formel (IV)wobei die Reste R7, R8, R9, R10, R11 und R12 unabhängig Alkanoyl sind, und
einer Verbindung der Formel (V)-O-, -CH(R16)- (wobei der Rest R16 Alkyl oder Alkenyl ist), -CH2CH(OH)(CH2)d- (wobei d eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist), -CH=CH(CH2)e- (wobei e eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist), -OCOCH(CH2COOR17)- (wobei der Rest R17 Alkyl oder Alkenyl ist) ist, oder einem Gemisch davon.
- Das Protein-löslichmachende Mittel zum Bestimmen der Menge von HDL-Cholesterin in der Probe ist ausgewählt aus einer Verbindung der Formel (VI)
- Die Verbindungen der Formeln (I) bis (VII) werden nachstehend als "Verbindungen (I) bis (VII)" bezeichnet.
- Bei den Definitionen der Reste in den Formeln (I) bis (VII) bedeuten Alkyl und die Alkyleinheit des Alkanoylrests einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl, Decyl, Pentadecyl, Icosanyl- und Docosanyl. Alkenyl bedeutet einen Alkenylrest mit 2 bis 22 Kohlenstoffatomen, wie Vinyl, Propenyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Heptenyl, Decenyl, Pentadecenyl, Icosenyl und Docosenyl.
- Beispiele für den Substituenten des substituierten Alkylrests und des substituierten Alkanoylrests umfassen Hydroxy, Carboxy und Sulfo.
- Beispiele für die Gallensäure umfassen eine Verbindung der Formel (IX)wobei die Reste R21 und R22 unabhängig Wasserstoff, -OR25 (wobei der Rest R25 Wasserstoff, Sulfo oder SO3Na ist) oder Oxo sind, der Rest R23 Wasserstoff oder -OR25 (wobei der Rest R25 wie vorstehend definiert ist) ist und der Rest R24 Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Metall ist.
- Beispiele für das Metall umfassen ein Alkalimetall, wie Natrium und Kalium, und ein Erdalkalimetall, wie Magnesium und Calcium. Die Alkyl- und Alkenylreste sind wie vorstehend definiert.
- Als die Zuckerverbindung sind Cyclodextrinderivate der Formeln (I) und (II) bevorzugt und methyliertes Cyclodextrin ist besonders bevorzugt. Beispiele dafür umfassen α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin, γ-Cyclodextrin, Dimethyl-β-cyclodextrin, Trimethyl-β-cyclodextrin, Hydroxyethyl-β-cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-α-cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Carboxymethyl-β-cyclodextrin, Glycosyl-β-cyclodextrin, Maltosyl-α-cyclodextrin, Maltosyl-β-cyclodextrin, partiell methyliertes β-Cyclodextrin, α-Cyclodextrinsulfat und β-Cyclodextrinsulfat.
- Als das Protein-löslichmachende Mittel zum Bestimmen der Menge von Cholesterin im LDL, VLDL und CM in der Probe werden nichtionische und anionische oberflächenaktive Mittel der Formeln (IV) und (V) verwendet. Ein Beispiel für ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist ein Saccharosefettsäureester. Beispiele für das anionische oberflächenaktive Mittel umfassen Natriumdodecylbenzolsulfonat, Natrium-n-dodecylbenzolsulfonat, Natriumlaurylsulfonat und Natriumsalze von Schwefelsäureestern höherer Alkohole.
- Als das Protein-löslichmachende Mittel zum Bestimmen der Menge von HDL-Cholesterin in der Probe werden kationische und anionische oberflächenaktive Mittel der Formeln (VI) und (VII) und die Gallensäure verwendet. Ein Beispiel für das kationische oberflächenaktive Mittel ist Oxyethylendodecylamin. Beispiele für das anionische oberflächenaktive Mittel umfassen Natriumcocoylmethyltaurat, Natriumlauroylmethyltaurat, Natriummyristoylmethyltaurat, Natriumpalmitoylmethyltaurat und Natriumstearoylmethyltaurat. Beispiele für das Gallensäuresalz umfassen Natriumcholat, Natriumdesoxycholat, Natriumchenodesoxycholat, Natriumursodesoxycholat, Natriumlithocholat, Natriumisochenodesoxycholat, Natrium-7-oxolithocholat, Natrium-12-oxolithocholat, Natrium-12-oxochenodesoxycholat und Natrium-7-oxodesoxycholat.
- Die vorliegende Erfindung ist durch das Vorhandensein der Zuckerverbindung und des Proteinlöslichmachenden Mittels in dem Reagenzsystem zum Bestimmen der Cholesterinmenge gekennzeichnet. Das System zum Bestimmen der Cholesterinmenge folgt einem allgemeinen Verfahren, das auf dem nachstehenden Reaktionsprinzip basiert, mit der Maßgabe, dass die Farbsubstanz und die Messwellenlänge der nicht auf die nachstehend gezeigten beschränkt sind.
-
- Beispiele für die Cholesterinesterhydrolase umfassen kommerzielle Cholesterinesterase und kommerzielle Lipoproteinlipase, die aus einem Mikroorganismus oder einem Tier stammen, das die Fähigkeit besitzt, einen Cholesterinester zu hydrolysieren.
- Beispiele für die Cholesterinoxidase umfassen kommerzielle Cholesterinoxidase, welche die Oxidation von Cholesterin unter Bildung von Wasserstoffperoxid katalysiert und aus einem Mikroorganismus stammt.
- Um die Spezifität und die Stabilität der vorstehend erwähnten Enzyme zu verbessern, können die Enzyme durch eine Gruppe, die hauptsächlich aus Polyethylenglycol, einem wasserlöslichen Oligosaccharidrest und einer Sulfopropylgruppe besteht, chemisch modifiziert werden. Ein Enzym, das durch Genmanipulation erhalten wird, kann ebenfalls verwendet werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf eine HDL enthaltende Körperflüssigkeit, wie Blut und Urin, angewendet werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist nachstehend beschrieben.
- Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zuerst die Lösung der Zuckerverbindung und die Lösung des Protein-löslichmachenden Mittels hergestellt. Die Lösung der Zuckerverbindung wird durch Lösen der Zuckerverbindung in einem geeigneten Puffer, zum Beispiel 50 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,4), hergestellt, so dass die Konzentration der Zuckerverbindung zum Zeitpunkt der Umsetzung zum Beispiel 100 mM oder weniger, vorzugsweise 3 bis 80 mM, annimmt. Die Zuckerverbindung kann dem Reagenz zum Bestimmen der Cholesterinmenge hinzugefügt werden. Die Lösung des Proteinlöslichmachenden Mittels wird dem Reagenz zum Bestimmen der Cholesterinmenge hinzugefügt, und sie wird derart hergestellt, dass die Konzentration des Proteinlöslichmachenden Mittels zum Zeitpunkt der Umsetzung zum Beispiel 50 g/l oder weniger, vorzugsweise 0,1 bis 20 g/l, annimmt. Das erfindungsgemäße Reagenz wird aus der Lösung der Zuckerverbindung und der Lösung des Protein-löslichmachenden Mittels, welches das Reagenz zum Bestimmen der Cholesterinmenge enthält, hergestellt und bei 20 bis 50°C, vorzugsweise bei 30 bis 40°C, für 5 Minuten gehalten.
- Dann wird die Probe als solche oder die Probe, die mit Wasser oder einer physiologischen Kochsalzlösung verdünnt wurde, dem vorstehend erwähnten Reagenz zugefügt, und die Umsetzung wird für 5 bis 30 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der Umsetzung wird eine Extinktion der Reaktionslösung bei 500 bis 600 nm, zum Beispiel bei 555 nm, gemessen, um die Cholesterinmenge zu berechnen. Wenn die Cholesterinmenge im LDL, VLDL und CM in der Probe gemessen wurde, wird die Gesamtmenge von Cholesterin in der Probe getrennt gemessen, und die Differenz zwischen der Cholesterinmenge im LDL, VLDL und CM und der Gesamtmenge von Cholesterin in der Probe wird berechnet, um die Menge von HDL-Cholesterin zu bestimmen.
- Die nachstehenden Testbeispiele zeigen, dass sich die Reaktionsfähigkeit von HDL, LDL, VLDL und CM jeweils in Abhängigkeit von der Kombination der Zuckerverbindung und/oder des Protein-löslichmachenden Mittels im Reagenzsystem zum Bestimmen der Menge von Cholesterin in jedem der Lipoproteine durch das vorstehend erwähnte Verfahren unterscheidet.
- Testbeispiel 1
- Unter Verwendung der Fraktionen von HDL, LDL, VLDL und CM, die aus dem Serum durch Ultrazentrifugation fraktioniert wurden, wurde die Reaktionsfähigkeit jedes der Lipoproteine mit dem Reagenz gemessen. In dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin waren 5 mM Dimethyl-β-cyclodextrin als Zuckerverbindung und 5 g/l Protein-löslichmachendes Mittel enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
- –, +, ++, +++
- zeigen die Reaktionsintensitäten an, und die Reihenfolge der Intensitäten ist – < + < ++ < +++.
- Wenn Dimethyl-β-cyclodextrin als Zuckerverbindung und ein geeignetes Proteinlöslichmachendes Mittel in dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin vorhanden sind, kann die Menge von HDL-Cholesterin aus der Menge von Cholesterin im LDL, VLDL und CM indirekt bestimmt werden.
- Testbeispiel 2
- Unter Verwendung der Fraktionen von HDL, LDL, VLDL und CM, die aus dem Serum durch Ultrazentrifugation fraktioniert wurden, wurde die Reaktionsfähigkeit jedes der Lipoproteine mit dem Reagenz gemessen. In dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin waren 5 mM Zuckerverbindung und 5 g/l Oxyethylendodecylamin als Protein-löslichmachendes Mittel enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
- +, ++, +++
- zeigen die Reaktionsintensitäten an, und die Reihenfolge der Intensitäten ist + < ++ < +++.
- Wenn die Zuckerverbindung und 5 g/l Oxyethylendodecylamin als das Protein-löslichmachendes Mittel in dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin vorhanden sind, kann die Menge von HDL-Cholesterin direkt bestimmt werden.
- Testbeispiel 3
- Unter Verwendung der Fraktionen von HDL, LDL, VLDL und CM, die aus dem Serum durch Ultrazentrifugation fraktioniert wurden, wurde die Reaktionsfähigkeit jedes der Lipoproteine mit dem Reagenz gemessen. In dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin waren 5 mM Dimethyl-β-cyclodextrin als Zuckerverbindung und 5 g/l Protein-löslichmachendes Mittel enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
- +–, +, ++, +++
- zeigen die Reaktionsintensitäten an, und die Reihenfolge der Intensitäten ist + < + < ++ < +++.
- Wenn Dimethyl-β-cyclodextrin als Zuckerverbindung und ein geeignetes Proteinlöslichmachendes Mittel in dem Reagenz zum Bestimmen der Menge von Cholesterin vorhanden sind, kann die Menge von HDL-Cholesterin direkt bestimmt werden.
-
1 zeigt eine Korrelation zwischen der Konzentration von Cholesterin im LDL, VLDL und CM und der durch das erfindungsgemäße Verfahren gemessenen Extinktion. -
2 zeigt eine Korrelation zwischen der Konzentration von HDL-Cholesterin und der durch das erfindungsgemäße Verfahren gemessenen Extinktion. - Beispiel 5 (Bezugbeispiel)
- Ein Reagenz, das Dimethyl-β-cyclodextrin (5 mM), Oxyethylendodecylamin (0,25 g/l), Cholesterinesterase (1,0 U/ml), Cholesterinoxidase (5,0 U/ml), 4-Aminoantipyrin (2,2 mM), EMSE (1,1 mM) und 30 mM Good-Puffer (pH 6,75) enthielt, wurde hergestellt. Eine durch Ultrazentrifugation aus dem Serum fraktionierte HDL-Probe wurde verwendet. Drei Milliliter des vorstehend genannten Reagenzes, das auf 37°C erwärmt wurde, wurden mit 50 μl der Probe gemischt, und das Gemisch wurde bei 37°C für 15 Minuten umgesetzt. Die Extinktion der so erhaltenen Lösung wurde bei 555 nm gemessen.
- Die Ergebnisse sind in
2 gezeigt.2 zeigt eine Korrelation zwischen der Menge von HDL-Cholesterin und der Extinktion. Die Menge von HDL-Cholesterin korrelierte eng mit der Extinktion. - Beispiel 6 (Bezugbeispiel)
- Im Wesentlichen wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 wiederholt, ausgenommen dass eine Serumprobe anstelle der aus dem Serum durch Ultrazentrifugation fraktionierten HDL-Probe verwendet wurde, und die Extinktion wurde gemessen. Die Menge von HDL-Cholesterin im Serum wurde auf Basis von
2 bestimmt. Als Kontrolle wurde die Menge von HDL-Cholesterin in der Serumprobe unter Verwendung eines Dextranschwefelsäure-Phosphorwolframsäure-Mg-Ausfällungsverfahrens bestimmt [Ausfällung unter Verwendung eines Bestimmungs-HDL (von Kyowa Medex Co., Ltd., hergestellt)] (Clinical Chemistry, 1. Auflage, Ogi M., Itensha, S. 110, 1987). - Die Ergebnisse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren waren eng mit den Ergebnissen gemäß dem Ausfällungsverfahren korreliert [Korrelationskoeffizient r = 0,889 (n = 20)].
- Beispiel 7 (Bezugbeispiel)
- Im Wesentlichen wurde das gleiche Verfahren wie in Beispiel 6 wiederholt, ausgenommen dass ein Reagenz, das Natriumcholat (5 mg/ml), Polyethylenglycol-modifizierte Cholesterinesterase (1,0 U/ml), Polyethylenglycol-modifizierte Cholesterinoxidase (5,0 U/ml), 4-Aminoantipyrin (2,2 mM), EMSE (1,1 mM) und 30 mM Good-Puffer (pH 6,75) anstelle des Reagenzes verwendet wurde, das Dimethyl-β-cyclodextrin (5 mM), Oxyethylendodecylamin (0,25 g/l), Cholesterinesterase (1,0 U/ml), Cholesterinoxidase (5,0 U/ml), 4-Aminoantipyrin (2,2 mM), EMSE (1,1 mM) und 30 mM Good-Puffer (pH 6,75) enthielt. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen gemäß dem Ausfällungsverfahren verglichen.
- Die Ergebnisse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren korrelieren eng mit den Ergebnissen gemäß dem Ausfällungsverfahren [Korrelationskoeffizient r = 0,980 (n = 40)].
- Die vorliegende Erfindung stellt ein einfaches Verfahren zum Messen der Menge von HDL-Cholesterin ohne Fraktionierungs- und Abtrennschritt bereit.
Claims (3)
- Verfahren zum Bestimmen der Menge von Cholesterin im Lipoprotein hoher Dichte (HDL) in einer Probe, umfassend das Mischen der Probe mit einer Zuckerverbindung und einem Protein-löslichmachenden Mittel, das Messen der Menge von Cholesterin im Lipoprotein geringer Dichte (LDL), im Lipoprotein sehr geringer Dichte (VLDL) und im Chylomikron (CM) in der Probe, und das Berechnen einer Differenz zwischen der Menge vom Cholesterin im LDL, VLDL und CM und der Gesamtmenge von Cholesterin in der Probe, wobei die Zuckerverbindung ein Cyclodextrinderivat ist, und das Proteinlöslichmachende Mittel eine Verbindung ist, welche ausgewählt ist aus einer Verbindung der Formel (IV)wobei die Reste R7, R8, R9, R10, R11 und R12 unabhängig Alkanoyl sind, und einer Verbindung der Formel (V)
-O-, -CH(R16)- (wobei der Rest R16 Alkyl oder Alkenyl ist), -CH2CH(OH)(CH2)d- (wobei d eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist), -CH=CH(CH2)e- (wobei e eine ganze Zahl von 1 bis 22 ist), -OCOCH(CH2COOR17)- (wobei der Rest R17 Alkyl oder Alkenyl ist), ist, oder einem Gemisch davon.
- Verfahren zum Bestimmen der Menge von Cholesterin in HDL in einer Probe, umfassend das Mischen der Probe mit einer Zuckerverbindung und einem Protein-löslichmachenden Mittel und das Bestimmen der Menge von Cholesterin im HDL in der Probe, wobei die Zuckerverbindung ein Cyclodextrinderivat ist, und das Protein-löslichmachende Mittel eine Verbindung ist, welche ausgewählt ist aus Gallensäure, einer Verbindung der allgemeinen Formel (VI)
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Bestimmen von Cholesterin durch das Umsetzen der Probe mit Cholesterinesterhydrolase und Cholesterinoxidase durchgeführt wird, um die Menge von gebildetem Wasserstoffperoxid zu messen, wobei die verwendete Cholesterinesterhydrolase oder Cholesterinoxidase eine chemisch modifizierte Cholesterinesterase oder eine chemisch modifizierte Cholesterinoxidase ist.
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