KR101079386B1

KR101079386B1 - 소립자 저비중 리포단백질의 정량 방법

Info

Publication number: KR101079386B1
Application number: KR1020057010055A
Authority: KR
Inventors: 야스끼 이또; 쯔또무 히라노
Original assignee: 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2011-11-02
Also published as: KR20050084130A; AU2003289224A1; CA2508674A1; JP4476814B2; CN1745303B; US7544515B2; US20060154374A1; CN1745303A; US7811826B2; CN101051051A; JPWO2004053500A1; US20090148959A1; ATE505731T1; CA2508674C; AU2003289224B2; WO2004053500A1; DE60336753D1; EP1571452A1; EP1571452A4; EP1571452B1

Abstract

본 발명은 신속하고 간편한 소립자 LDL의 분별 측정 방법을 제공한다. 본 발명은 피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질을 그 이외의 저비중 리포단백질과 분리하는 제1 공정, 및 분리한 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 단백질을 측정하는 제2 공정을 포함하는, 피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질의 정량 방법이다.

소립자 저비중 리포단백질, 다가음이온, 2가 양이온, 동맥경화, 키트

Description

소립자 저비중 리포단백질의 정량 방법 {Method of Quantifying Small-Sized Low Density Lipoprotein}

본 발명은 동맥경화증의 임상 진단에 중요한 소립자 저비중 리포단백질의 분별 정량 방법에 관한 것이다.

저밀도 리포단백질(LDL)은 혈액 중의 콜레스테롤 운반의 주역이며, 동맥경화성 질환의 위험 인자인데, LDL 중에서도 특히 입자 크기가 작고 평균적인 LDL보다 고비중의 소립자 저비중 리포단백질(이하, 「소립자 LDL」이라고 함)은 동맥경화 유발성이 통상의 LDL보다 몇배 높다는 것이 알려져 있다. 소립자 LDL의 증가는 동맥경화성 질환의 주요 위험 인자 중 하나이며, 분별 측정하는 것은 임상적으로 매우 중요하다.

종래의 소립자 LDL의 측정 방법은 초원심법, 전기 영동법, 고속 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법 등이 있다. 초원심법은 비중차를 이용하여 소립자 LDL을 분리하여 그 콜레스테롤량이나 단백질량을 정량하는 방법이며, 소립자 LDL은 비중 1.040 내지 1.063으로 분획된다(문헌[Atherosclerosis, 48 p.33-49, 1993] 및 [Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994] 등). 그러나, 이 방법은 고가의 설비를 필요로 하며, 측정에 매우 장시간을 요한다. 전기 영동법은 폴리아크릴아미드 겔 을 이용하여 LDL의 이동도나 입자 직경을 측정하는 방법이며, 소립자 LDL은 입자 크기가 25.5 nm 이하(문헌[JAMA, 260, p.1917-21, 1988] 등)이거나, 또는 LDL의 상대 이동도(VLDL로부터 LDL까지의 이동 거리를 VLDL로부터 HDL까지의 이동 거리로 나눈 것)가 0.4 이상이다(문헌[동맥경화, 25, p.67-70, 1997]). 그러나, 이들 방법은 LDL의 소립자화의 정도를 측정하는 방법으로서 정량 방법은 아니다. 또한, 한번 측정하는 검체수가 한정되어 있어 측정에 장시간을 요한다. 최근, 아가로오스 전기 영동에서 영동 후의 겔을 지질 염색하고, 그 염색 패턴을 컴퓨터로 해석하여 리포단백질을 정량하는 방법(일본 특허 공개 제2000-356641호 공보)이 발명되었지만, 이것은 산화 LDL, 아세틸 LDL, 당화 LDL, MDA-LDL 등의 변성 LDL을 분석하는 방법이며, 소립자 LDL은 정확하게 측정할 수 없다. 또한, 해석에 매우 고가의 장치를 필요로 하기 때문에 일반적이지 않다.

종래, HDL 측정에 있어서 HDL 이외의 리포단백질을 응집시켜 HDL을 분리시키기 위한 분리제로서 다가음이온과 2가 양이온을 조합하여 이용하는 방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 덱스트란 황산-Mg²⁺을 이용하는 방법(문헌[Clin. Chem., 28, p.1379-88, 1982] 등), 헤파린-Mn²⁺를 이용하는 방법(문헌[J Lipid Res., 19, p.65-76, 1978] 등), 헤파린-Ca²⁺를 이용하는 방법(문헌[Arch. Biochem. Biophys., 170, p.334-40, 1975] 등), 인텅스텐산-Mg²⁺를 이용하는 방법(문헌[Clin. Chem., 23, p.882-84, 1977] 등) 등이 있다. 또한, 복수의 분리제를 사용하여 리포단백질을 단계적으로 침전시켜 계산에 의해 LDL이나 VLDL의 분획을 측정하는 방법이 이미 보고되어 있다(일본 특허 공개 (평)7-294532호 공보, 문헌[임상병리 임시증간특집 제21호, 82, 1975] 등). 또한, 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 HDL을 분리하는 방법도 보고되어 있다(문헌[Ann. Clin. Biochem. 18 p.177-81, 1981]).

또한, 종래 복수의 분리제를 사용하여 리포단백질을 단계적으로 침전시켜 탁도의 차이에 의해 각 리포단백질을 측정하는 방법(문헌[임상병리 임시증간특집 제21호, 82, 1975] 등), 이온 강도의 차이에 의해 소립자 LDL을 혼탁 또는 용해시켜 흡광도의 차이에 의해 소립자 LDL을 측정하는 방법(일본 특허 공개 제2003-28882호 공보) 등이 있었다. 그러나, 흡광도를 측정하기 때문에 특이성이나 정밀도가 불충분하였다.

본 발명의 목적은 신속하고 간편한 소립자 LDL의 분별 측정 방법을 제공하는 것이다.

상기한 바와 같이 리포단백질 중의 HDL 이외의 리포단백질을 응집시키기 위해 다가음이온, 2가 양이온 등을 분리제로서 사용하는 것은 보고되어 있었다. 그러나, 리포단백질의 대표적인 분획인 VLDL, LDL 및 HDL은 각각 물성이 상이하기 때문에 분리제에 의해 분리할 수 있지만, LDL을 동일한 방법으로 아분획으로 분리하는 것은 시도되지 못하였다.

본 발명자들은 소립자 LDL을 분리하는 방법에 대하여 예의 검토를 행하고, 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온을 적당한 농도로 작용시킴으로써 소립자 LDL과 그 이외의 LDL이 분리된다는 것을 발견하였다. 또한, 1가 양이온을 추가하여 작용시켰을 경우, 1가 양이온은 이온 강도 조정제로서 작용하여 보다 양호한 소립자 LDL의 분리를 달성할 수 있었다. 또한, 다가음이온과 2가 양이온 및 1가 양이온 대신에 PEG를 사용해도 동일한 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명자들은 다가음이온과 2가 양이온 및 1가 양이온을 조합했을 경우, 또는 PEG를 사용했을 경우의 각각의 농도에 대하여 상세한 검토를 행하고, 이들 농도 범위를 규정함으로써 LDL 입자 중에서도 소립자 LDL 이외의 LDL을 응집시켜 소립자 LDL을 분리하는 조건을 발견하였다. 이 반응에 의해 소립자 LDL 이외의 LDL은 응집물을 형성하며, 원심 분리나 필터 처리에 의해 반응액 중에서 제거할 수 있다. 또한, 분리 후의 반응액에 LDL 콜레스테롤 측정용 시약 또는 LDL 중 중성 지방 측정용 시약 또는 항인간 아포단백질 B 항체를 작용시킴으로써 소립자 LDL 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 단백질을 정량하는 것이 가능해져 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

상술한 이온 강도의 차이에 의해 소립자 LDL을 혼탁 또는 용해시켜 흡광도의 차이에 의해 소립자 LDL을 측정하는 방법(일본 특허 공개 제2003-28882호 공보)과 비교하여, 본 발명에서는 분리 후의 소립자 LDL을 콜레스테롤, 중성 지방, 단백질의 형태로 측정하기 때문에 특이성이나 정밀도에서 우수하다.

즉, 본 발명은 이하의 방법 및 키트를 제공한다.

(1) 피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질을 그 이외의 저비중 리포단백질과 분리하는 제1 공정, 및 분리한 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤, 중성 지방 또는 단백질을 측정하는 제2 공정을 포함하는, 피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질의 정량 방법,

(2) 상기 (1)에 있어서, 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 다가음이온 및 2가 양이온을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 추가로 1가 양이온을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(4) 상기 (2) 또는 (3)에 있어서, 제1 공정에서 사용되는 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산 및 덱스트란 황산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다가음이온인 것을 특징으로 하는 방법,

(5) 상기 (2) 내지 (4) 중 어느 한 항에 있어서, 제1 공정에서 사용되는 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온인 것을 특징으로 하는 방법,

(6) 상기 (3) 또는 (5)에 있어서, 제1 공정에서 사용되는 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는 방법,

(7) 상기 (4) 내지 (6) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 다가음이온을 첨가했을 때의 다가음이온의 최종 농도가, 헤파린의 경우 10 내지 250 U/mL, 덱스트란 황산의 경우 0.02 내지 1.25 ％, 인텅스텐산의 경우 0.02 내지 1.25 ％인 방법,

(8) 상기 (5) 내지 (7) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 2가 양이온을 첨가했을 때의 2가 양이온의 최종 농도가, Mn²⁺의 경우 2.5 내지 35 mmol/L, Mg²⁺의 경우 2.5 내지 125 mmol/L, Ca²⁺의 경우 1 내지 75 mmol/L인 방법,

(9) 상기 (6) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 1가 양이온을 첨가했을 때의 1가 양이온의 최종 농도가 0 내지 50 mmol/L인 방법,

(10) 상기 (1)에 있어서, 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 PEG를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(11) 상기 (10)에 있어서, 피검체 시료에 PEG를 첨가했을 때의 PEG의 최종 농도가 2 내지 5 ％인 방법,

(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정의 콜레스테롤 측정이 분획 조작을 요하지 않는 저비중 리포단백질 중 콜레스테롤의 정량 시약을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(13) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정의 중성 지방 측정이 분획 조작을 요하지 않는 저비중 리포단백질 중 중성 지방의 정량 시약을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(14) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정의 단백질 측정이 항인간 아포단백질 B 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법,

(15) 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온을 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는, 피검체 시료로부터 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(16) 상기 (15)에 있어서, 피검체 시료에 추가로 1가 양이온을 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는 방법,

(17) 상기 (15) 또는 (16)에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산 및 덱스트란 황산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다가음이온인 것을 특징으로 하는, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(18) 상기 (15) 내지 (17) 중 어느 한 항에 있어서, 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온인 것을 특징으로 하는, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(19) 상기 (15) 내지 (18) 중 어느 한 항에 있어서, 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(20) 상기 (17) 내지 (19) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 다가음이온을 첨가했을 때의 다가음이온의 최종 농도가, 헤파린의 경우 10 내지 250 U/mL, 덱스트란 황산의 경우 0.02 내지 1.25 ％, 인텅스텐산의 경우 0.02 내지 1.25 ％인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(21) 상기 (18) 내지 (20) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 2가 양이온을 첨가했을 때의 2가 양이온의 최종 농도가, Mn²⁺의 경우 2.5 내지 35 mmol/L, Mg²⁺의 경우 2.5 내지 125 mmol/L, Ca²⁺의 경우 1 내지 75 mmol/L인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(22) 상기 (19) 내지 (21) 중 어느 한 항에 있어서, 피검체 시료에 1가 양이온을 첨가했을 때의 1가 양이온의 최종 농도가 0 내지 50 mmol/L인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(23) 피검체 시료에 PEG를 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는, 피검체 시료로부터 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(24) 상기 (23)에 있어서, 피검체 시료에 PEG를 첨가했을 때의 PEG의 최종 농도가 2 내지 5 ％인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법,

(25) 다가음이온 및 2가 양이온을 포함하는 분리제 및 저비중 리포단백질 측정 시약을 포함하는, 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 단백질을 측정하기 위한 소립자 저비중 리포단백질 측정용 키트,

(26) 상기 (25)에 있어서, 분리제가 추가로 1가 양이온을 포함하는, 소립자 저비중 리포단백질 측정용 키트,

(27) PEG를 포함하는 분리제 및 저비중 리포단백질 측정 시약을 포함하는, 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 단백질을 측정하기 위한 소립자 저비중 리포단백질 측정용 키트,

(28) 상기 (25) 또는 (26)에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산 및 덱스트란 황산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다가음이온인 것을 특징으로 하는 키트,

(29) 상기 (26) 또는 (28)에 있어서, 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온이고, 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는 키트.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2002-355119호 명세서 및(또는) 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 본 발명의 제1 공정의 방법을 나타내는 도면이다.

도 2는 실시예 1에서의 본 발명의 제1 공정의 효과를 나타내는 도면이다.

도 3은 실시예 2에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 4는 실시예 3에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 아포단백질 B의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 아포단백질 B의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 5는 실시예 4에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 6은 실시예 5에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 7은 실시예 6에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 8은 실시예 7에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 9는 실시예 8에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 중성 지방의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 중성 지방의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

도 10은 실시예 9에서의 본 발명의 방법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와, 초원심법에 의한 소립자 LDL 중 콜레스테롤의 측정치와의 상관성을 나타내는 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법은 제1 공정 및 제2 공정을 포함한다. 제1 공정에서는 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온을 포함하는 분리액, 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리액 또는 PEG를 첨가하고, 일정 시간 반응 후 VLDL 및 소립자 LDL 이외의 LDL을 응집시켜 원심 분리나 필터에 의해 제거한다. 이어지는 제2 공정에서는 소립자 LDL 중의 콜레스테롤이나 중성 지방이나 단백질을 정량한다. 제1 공정에서는 상기 리포단백질 제거 후의 용액 중에 소립자 LDL 외에 HDL이 남지만, LDL 콜레스테롤 측정 시약 또는 LDL 중의 중성 지방 측정 시약 또는 항인간 아포단백질 B 항체를 작용시킴으로써 소립자 LDL의 성분만을 분별 측정할 수 있다.

상술한 바와 같이 리포단백질은 크게 VLDL, LDL 및 HDL의 분획으로 나뉘며, LDL은 추가로 소립자 LDL과 그 이외의 아분획으로 나뉜다. 소립자 LDL을 SLDL(small LDL), Small dense LDL, dense LDL이라고 하는 경우도 있으며, 그 이외의 LDL을 LLDL(large LDL), Light LDL이라고 하기도 한다. 이들 분획 및 아분획은 입자 크기 또는 비중에 의해 구별할 수 있다. 그 입자 크기의 직경은 보고자에 따라 상이하지만, VLDL이 30 nm 내지 80 nm(30 nm 내지 75 nm), LDL이 22 nm 내지 28 nm(19 nm 내지 30 nm), HDL이 직경 7 내지 10 nm이다. 비중은 VLDL이 1.006 이하, LDL이 1.019 내지 1.063, HDL이 1.063 내지 1.21이다. LDL의 입자 직경은 그라디엔트 겔 전기 영동(GGE)(문헌[JAMA, 260, p.1917-21, 1988]), NMR(문헌[HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2^nd Edition, edited by Nader Rifai et al, p.609-623, AACC PRESS: The Fats of Life, Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No.3, p.15-16])에 의해 측정할 수 있고, 비중은 초원심 분리에 의한 분석(문헌[Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994] 및 [Atherosclerosis, 83, p.59, 1990])에 기초하여 결정할 수 있다.

본 발명의 방법으로 측정하고자 하는 소립자 LDL은 일반적으로는 LDL 분획 중 직경이 약 22.0 내지 약 25.5 nm인 아분획, 비중이 1.040 내지 1.063인 아분획을 가리킨다. LDL을 크기에 따라 아분획으로 나누는 것은 LDL 중 입경이 작은 것이 동맥경화 유발성이 높고, LDL 중에서도 보다 악성도가 높기 때문에 LDL 중에서도 작은 것을 분별 측정할 필요가 있기 때문이다. LDL 내에서 직경 분포나 비중 분포는 연속되어 있으며, 비중이 어느 정도 이상의 것이 특히 악성도가 높다고 명확하게 구별할 수 있는 것이 아니다. 따라서, 상기한 비중 1.040 내지 1.063의 값도 소립자 LDL의 특성으로서 확립된 것은 아니며, 넓게 이용되고 있어 확립된 값이라고 할 수 있는 LDL의 비중 범위 1.019 내지 1.063을 중앙점으로 나눈 것이다. 예를 들면, 별도의 보고에서는 1.044 내지 1.060으로 분획된다(문헌[Atherosclerosis: 106, p.241-253, 1994]). 소립자 LDL의 비중을 어느 범위로 할것인지는 보고자에 따라 약간의 차이가 있지만, 어느 것이나 그 범위에서 분별했을 경우의 소립자 LDL의 존재가 임상적인 악성도와 연관되어 있다.

본 발명에 있어서, 소립자 LDL이라고 하는 경우, LDL 중 비중이 작은 것이며, 임상적으로 동맥경화 유발성이 그 이외의 LDL보다 큰 것, 바람직하게는 LDL의 비중 범위에서 중앙점보다 위의 비중 범위에 속하는 것, 더욱 바람직하게는 비중 1.040 내지 1.063의 범위에 속하는 LDL을 말한다.

본 발명의 방법에서 사용하는 피검체 시료는 혈청 또는 혈장, 바람직하게는 혈청이다. 제1 공정에서 적당한 부피의 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온의 최종 농도가 특정한 범위 내가 되도록 첨가한다. 소립자 LDL과 그 이외의 LDL의 분리는 다가음이온과 2가 양이온의 존재하에서 행할 수 있지만, 추가로 1가 양이온을 존재시킴으로써 1가 양이온이 이온 강도 조정제로서 작용하여 보다 양호한 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획 분리를 달성할 수 있다. 이 때, 특정한 농도의 다가음이온 및 2가 양이온을 포함하는 분리액, 또는 특정한 농도의 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리액을 미리 제조하여 이것을 첨가할 수도 있고, 특정한 농도의 다가음이온 및 2가 양이온 및 1가 양이온을 별개로 조정해 두고 각각을 별개로 첨가할 수도 있다. 별개로 첨가하는 경우 피검체 시료에 첨가하는 순서는 한정되지 않는다. 다가음이온 및 2가 양이온을 포함하는 분리제, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리액을 사용하는 경우, 분리액의 용매로서 정제수, 생리 식염수 및 각종 완충액을 사용할 수 있다. 분리액의 pH는 3 내지 8이 바람직하다.

제1 공정에서 사용하는 다가음이온으로서는 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 황산 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 첨가한 후의 다가음이온의 최종 농도는, 헤파린의 경우 10 내지 250 U/mL, 인텅스텐산의 경우 0.02 내지 1.25 ％, 덱 스트란 황산의 경우 0.02 내지 1.25 ％가 바람직하다.

제1 공정에서 사용하는 2가 금속 이온에는 Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Co²⁺를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 Mn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺가 사용된다. 피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온을 첨가한 후의 2가 양이온의 최종 농도는, 다가음이온으로서 헤파린을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 7.5 내지 35 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 40 내지 125 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 50 내지 75 mmol/L가 바람직하며, 인텅스텐산을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 2.5 내지 7.5 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 2.5 내지 50 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 1 내지 30 mmol/L가 바람직하다. 덱스트란 황산을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 2.5 내지 10 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 7.5 내지 30 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 5 내지 20 mmol/L가 바람직하다.

또한, 추가로 제1 공정에서 1가 양이온을 사용하는 경우, 1가 금속 이온에는 Na⁺, K⁺, Li⁺를 바람직하게 사용할 수 있다. 1가 양이온의 최종 농도는 0 내지 50 mmol/L가 바람직하다.

예를 들면, 피검체 시료 100 μL에 다가음이온과 2가 양이온을 포함하는 분리제, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리제 100 μL를 첨가한다. 이 때의 분리제 중의 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온의 농도는 피검체 시료와 분리제를 혼합했을 때의 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온의 농도가 상기 최종 농도가 되도록 제조해 두면 된다. 분리제 중의 다가음이온의 농도는, 헤파린의 경우 20 내지 500 U/mL, 인텅스텐산의 경우 0.04 내지 2.5 ％, 덱스트란 황산의 경우 0.04 내지 2.5 ％가 바람직하다. 또한, 분리제 중의 2가 양이온의 농도는, 다가음이온으로서 헤파린을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 15 내지 70 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 80 내지 250 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 100 내지 150 mmol/L가 바람직하고, 인텅스텐산을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 5 내지 15 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 5 내지 100 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 2 내지 60 mmol/L가 바람직하다. 덱스트란 황산을 사용했을 경우, Mn²⁺ 농도는 5 내지 20 mmol/L, Mg²⁺ 농도는 15 내지 60 mmol/L, Ca²⁺ 농도는 10 내지 40 mmol/L가 바람직하다. 1가 양이온의 농도는 0 내지 100 mmol/L가 바람직하다.

피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 첨가한 후, 반응 혼합액을 교반하여 제1 공정의 반응을 행한다.

제1 공정에서의 반응은 2 ℃ 내지 45 ℃의 온도에서 행하는 것이 바람직하며, 20 ℃ 내지 37 ℃에서 행하는 것이 더욱 바람직하다.

제1 공정에서의 반응은 1 분 내지 30 분간 행하는 것이 바람직하며, 5 분 내지 15 분간 행하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 제1 공정에서 피검체 시료에 첨가하는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온의 적절한 농도는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온 종류의 조합에 따 라서도 변화하며, 피검체 시료의 pH, 이온 강도 등의 조건에 따라서도 변화한다. 따라서, 본 발명의 제1 공정의 반응을 행하는 경우, 항상 동일한 비중 범위의 것을 얻을 수 있다고 할 수 없으며, 특히 상술한 일반적으로 소립자 LDL의 비중 범위라고 여겨지고 있는 1.040 내지 1.063의 것을 얻을 수 있다고도 할 수 없다. 단, 상기 농도 조건에서 제1 공정의 반응을 행하면, 거의 동등한 비중을 갖는 LDL을 얻을 수 있고, 그 LDL은 상기 정의한 LDL에 포함된다. 또한, 소립자 LDL의 비중을 1.040 내지 1.063으로 고정하여 고려한 경우이며, 본 발명의 제1 공정에 의해 얻어지는 LDL의 비중이 이 범위에서 약간 벗어났다고 해도 그 벗어난 정도는 크지 않다. 또한, LDL 전체에서 비교적 소립자의 LDL을 포함하고 있다는 사실에는 변함이 없기 때문에, 본 발명의 제1 공정에 의해 얻어지는 소립자 LDL의 양은 어느 피검체가 동맥경화를 유발할 위험을 반영하고 있다.

제1 공정의 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획의 분리는, 다가음이온 및 2가 양이온, 또는 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온 대신에 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 피검체 시료에 첨가함으로써 행할 수도 있다. 이 때 사용되는 PEG의 분자량은 4,000 내지 20,000이 바람직하며, PEG의 최종 농도는 4 내지 10 ％가 바람직하다.

제1 공정의 반응이 종료된 후, 원심 분리를 행하여 상청을 얻음으로써 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획을 채취할 수 있다. 이 때의 원심 분리의 조건은 9,000 g 내지 36,000 g에서 1 내지 30 분이다.

또한, 제1 공정의 반응이 종료된 후, 반응 혼합액을 필터로 여과하여도 패스 -드로우(pass-through)로서 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획을 채취할 수 있다. 필터는 압력을 가하여 여과하는 형태의 것일 수도 있고, 원심 조작에 의해 여과하는 형태의 것일 수도 있다. 이 때 사용하는 필터의 분획 크기는 0.10 내지 0.80 ㎛이며, 예를 들면 시판되고 있는 마이렉스, 울트라프리(밀리포어사(MILLIPORE) 제조), 미니잘트(사르토리우스사(Sartorius) 제조), DISMIC(어드밴텍사(ADVANTEC) 제조), HT 터프린ㆍ아크로디스크ㆍ시린지 필터(폴 겔만 래보러터리사(PALL Gelman Laboratory) 제조) 등을 사용할 수 있다.

제1 공정에서 얻어진 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획 중의 LDL만을 측정함으로써 피검체 시료 중의 소립자 LDL을 정량할 수 있다.

이 때, LDL의 측정은 LDL 중의 콜레스테롤을 측정하거나, LDL 중의 중성 지방을 측정하거나, LDL 중의 아포단백질 B를 측정함으로써 행할 수 있다.

제2 공정에서 사용되는 분획 조작을 요하지 않는 LDL 콜레스테롤의 측정 방법으로서 몇가지 방법(일본 특허 공개 (평)11-318496호 공보, 일본 특허 공개 제2002-202314호 공보, 일본 특허 공개 (평)10-080300호 공보, 일본 특허 공개 (평)09-313200호 공보, 일본 특허 공개 (평)11-155595호 공보, 일본 특허 제3256241호 공보)이 있는데, 이들을 바람직하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 일본 특허 공개 (평)11-318496호 공보에 기재된 것에 따라, 이하와 같이 하여 제1 공정에서 얻어진 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획 중의 LDL을 정량할 수 있다. 제1 공정에서 얻어진 소립자 LDL 및 HDL을 포함하는 분획을 시료로 하여 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜, 생성된 과산화수소를 소거함으로써 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질을 소거하고(단계 A), 이어서 시료 중의 잔존 LDL을 정량할 수 있다(단계 B). 이 때, LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제로서는 HLB치가 13 이상 15 이하인 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있으며, 구체예로서는 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등으로 HLB치가 13 이상 15 이하인 화합물이 있다. 단계 A에서 사용되는 상기 계면활성제의 농도는 0.1 내지 10 g/L 정도가 바람직하고, 0.5 내지 5.0 g/L 정도가 더욱 바람직하다. 과산화수소를 소거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜 물과 산소로 분해하는 방법, 및 퍼옥시다아제를 이용하여 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과 과산화수소를 반응시켜 무색 퀴논으로 전환시키는 방법을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 단계 A의 반응액 중의 콜레스테롤 에스테라아제의 농도는 0.2 내지 1.0 U/mL 정도가 바람직하며, 유래로서는 슈도모나스속 세균으로부터 생성되는 것이 효과적이다. 또한, 콜레스테롤 옥시다아제의 농도는 0.1 내지 0.7 U/mL 정도가 바람직하며, 세균이나 효모 유래의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 카탈라아제의 농도는 40 내지 100 U/mL 정도가 바람직하다. 또한, 과산화수소를 무색 퀴논으로 전환시키는 경우의 퍼옥시다아제의 농도는 0.4 내지 1.0 U/mL가 바람직하고, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 농도로서는 0.4 내지 0.8 mmol/L가 바람직하다. 단계 B에서는 피검체 시료 중의 잔존 콜레스테롤을 정량한다. 이것은, 예를 들면 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 첨가하고, 제1 공정에서 첨가한 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 정량함으로써 행할 수 있다. 이 때 LDL에 작용하는 계면활성제로서 HLB치가 11 이상 13 미만인 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있으며, 구체예로서는 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등으로 HLB치가 11 이상 13 미만인 화합물을 들 수 있다. 단계 B의 그 밖의 바람직한 반응 조건은 제1 공정에서의 바람직한 반응 조건과 동일하다.

LDL을 측정하기 위한 측정 키트는 시판되고 있으며, 이들 시판되는 측정 키트를 이용하여 LDL을 측정할 수도 있다. 시판되는 키트로서는, 예를 들면 LDL-EX(N)(덴까 세껜)가 있다.

제2 공정에서 사용되는 분획 조작을 요하지 않는 LDL 중의 중성 지방 측정 방법으로서 몇가지 방법(WO00/43537호 공보)이 있는데, 이들을 바람직하게 이용할 수 있다.

제2 공정에서 사용되는 항인간 아포단백질 B 항체를 작용시키는 방법으로서 몇가지 방법(일본 특허 제2638137호 공보, 일본 특허 공개 (평)02-64458호 공보)이 있는데, 이들을 바람직하게 이용할 수 있다.

본 발명에는 소립자 LDL을 포함하는 분획을 분리하기 위한 제1 공정을 행하기 위한 시약, 및 분리된 소립자 LDL을 측정하기 위한 시약을 포함하는 키트도 포 함된다. 상기 키트는, 예를 들면 상술한 LDL 측정 시약 키트 및 다가음이온 및 2가 양이온(또는 다가음이온과 2가 양이온을 포함하는 분리제) 등을 포함한다. 상기 키트는 추가로 원심 분리용 튜브, 소립자 LDL 분리용 필터를 포함할 수도 있다. 또한, 상기 키트는 다가음이온 및 2가 양이온에 추가하여 1가 양이온을 포함할 수도 있으며, 이 경우 다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리제로서 이들 물질을 포함할 수도 있다. 또한, 상기 키트는 다가음이온 및 2가 양이온 대신에 폴리에틸렌글리콜을 포함할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

전기 영동법에 의해 소립자 LDL을 많이 포함하는 것이 확인되는 검체 및 그 이외의 LDL을 많이 포함하는 검체를 사용하여 제1 공정의 효과를 구하였다. 혈청 50 μL에 60 U/mL의 헤파린 나트륨 및 40 mmol/L의 MnCl₂를 포함하는 분리액 50 μL를 첨가하여 25 ℃에서 15 분간 반응시켰다. 그 후 18,500 g으로 15 분간 원심 분리를 행하여 상청을 회수하고, 시판되고 있는 디스크형 폴리아크릴아미드 겔 리포포어(lipophore)를 이용하여 반응성을 비교하였다. 분리액과 반응 전의 혈청은 등량의 생리 식염수로 희석한 후 영동하였다. 도 1에 본 발명의 제1 공정의 방법을 나타내는 도면을, 도 2에 그 결과를 나타내었다. 도 2는 정상적인 LDL만이 선택적 으로 제거되어 있는 것을 나타낸다. 도 2 중 레인 No.1은 소립자 LDL 이외의 LDL을 많이 포함하는 검체의 반응 전의 영동 결과를, 레인 No.2는 소립자 LDL을 많이 포함하는 검체의 반응 전의 영동 결과를, 레인 No.3은 소립자 LDL 이외의 LDL을 많이 포함하는 검체의 반응 후의 영동 결과를, 레인 No.4는 소립자 LDL을 많이 포함하는 검체의 반응 후의 영동 결과를 나타낸다.

<실시예 2>

혈청을 시료로 하여 본 발명의 방법에 의해 소립자 LDL을 측정하고, 그 측정치를 초원심법에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

즉, 검체 100 μL에 300 U/mL의 헤파린 나트륨 및 150 mmol/L의 MgCl₂를 포함하는 분리액 100 μL를 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 18,500 g으로 15 분간 원심 분리하여 상청을 회수하고, 시판되고 있는 키트 LDL-EX(N)(덴카 세이켄사 제조)를 사용하여 히따찌 7170형 자동 분석 장치에 의해 소립자 LDL 중의 콜레스테롤을 측정하였다. 초원심법은 혈청과 비중액을 혼합한 후, 원심을 행하여 비중 1.040 내지 1.063의 분획을 회수하고, 콜레스테롤을 측정하여 소립자 LDL 중의 콜레스테롤치로 하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 3>

혈청을 포함하는 검체 100 μL에 평균 분자량 5000의 1.5 ％ 덱스트란 황산나트륨 및 40 mmol/L의 MgCl₂를 포함하는 분리액 100 μL를 첨가하여 25 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 18,500 g으로 15 분간 원심 분리하여 상청을 회수하고, 항인간 아포단백질 B 항체를 사용한 면역 비탁법(제1 가가꾸 야꾸힝, 아포 B 오토ㆍN 「제1」을 사용)에 의해 소립자 LDL 중의 아포단백질 B량을 측정하였다. 초원심법은 혈청과 비중액을 혼합한 후, 원심을 행하여 비중 1.040 내지 1.063의 분획을 회수하고, 아포단백질 B를 측정하여 소립자 LDL 중의 아포단백질 B치로 하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 4>

실시예 2에 있어서, 분리액을 0.3 ％의 인텅스텐산 나트륨 및 7.5 mmol/L의 CaCl₂로 한 것 이외에는, 동일한 시약으로 동일한 조작을 행하여 본 발명의 방법에 의한 측정치와 초원심법에 의해 얻어지는 값을 비교하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 5>

실시예 2에 있어서, 분리액을 40 U/mL의 헤파린 나트륨 및 30 mmol/L의 MnCl₂로 한 것 이외에는, 동일한 시약으로 동일한 조작을 행하여 본 발명의 방법에 의한 측정치와 초원심법에 의해 얻어지는 값을 비교하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의 한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 6>

실시예 2에 있어서, 분리액을 500 U/mL의 헤파린 나트륨 및 140 mmol/L의 MgCl₂ 및 34 mmol/L의 KCl로 한 것 이외에는, 동일한 시약으로 동일한 조작을 행하여 본 발명의 방법에 의한 측정치와 초원심법에 의해 얻어지는 값을 비교하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 7>

실시예 2에 있어서, 분리액을 8 ％ PEG(분자량 6,000)로 한 것 이외에는, 동일한 시약으로 동일한 조작을 행하여 본 발명의 방법에 의한 측정치와 초원심법에 의해 얻어지는 값을 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 8>

혈청을 포함하는 검체 100 μL에 150 U/mL의 헤파린 나트륨 및 90 mmol/L의 MgCl₂를 포함하는 분리액 100 μL를 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 18,500 g으로 15 분간 원심 분리를 행하여 상청을 회수하고, LDL 중 중성 지방 측정 시약에 의해 소립자 LDL 중의 중성 지방을 측정하였다. 초원심법은 혈청과 비중액을 혼합한 후, 원심을 행하여 비중 1.040 내지 1.063의 분획을 회수하고, 중성 지방을 측정하여 소립자 LDL 중 중성 지방치로 하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

<실시예 9>

혈청을 포함하는 검체 100 μL에 150 U/mL의 헤파린 나트륨 및 90 mmol/L의 MgCl₂를 포함하는 분리액 100 μL를 첨가하여 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후, 원심형의 필터 여과(밀리포어사의 울트라프리-MC (0.1 ㎛ 필터 유닛)를 사용)를 사용하여 10,000 g으로 1 분간 원심 분리를 행하여 여과액을 회수한 후, 소립자 LDL 중의 콜레스테롤을 측정하여 초원심법에 의해 얻어지는 값과 비교하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 2와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의한 결과는 초원심법에 의한 결과와 양호한 상관성을 나타내었다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 삽입하기로 한다.

본 발명에 의하면 간편한 조작으로 소립자 LDL을 그 이외의 LDL과 분리할 수 있고, 소립자 LDL 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 아포단백질 B를 분별 측정할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다.

Claims

피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질을 그 이외의 저비중 리포단백질과 분리하는 제1 공정, 및 분리한 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤, 중성 지방 또는 단백질을 측정하는 제2 공정을 포함하며,

상기 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 다가음이온 및 2가 양이온을 사용하는 것을 특징으로 하는,

피검체 시료 중의 소립자 저비중 리포단백질의 정량 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 추가로 1가 양이온을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제1 공정에서 사용되는 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산 및 덱스트란 황산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다가음이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제1 공정에서 사용되는 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 제1 공정에서 사용되는 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 피검체 시료에 다가음이온을 첨가했을 때의 다가음이온의 최종 농도가, 헤파린의 경우 10 내지 250 U/mL, 덱스트란 황산의 경우 0.02 내지 1.25 중량％, 인텅스텐산의 경우 0.02 내지 1.25 중량％인 방법.
제5항에 있어서, 피검체 시료에 2가 양이온을 첨가했을 때의 2가 양이온의 최종 농도가, Mn²⁺의 경우 2.5 내지 35 mmol/L, Mg²⁺의 경우 2.5 내지 125 mmol/L, Ca²⁺의 경우 1 내지 75 mmol/L인 방법.
제6항에 있어서, 피검체 시료에 1가 양이온을 첨가했을 때의 1가 양이온의 최종 농도가 0 내지 50 mmol/L인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 공정에서 소립자 저비중 리포단백질과 그 이외의 저비중 리포단백질의 분리에 PEG(폴리에틸렌글리콜)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 피검체 시료에 PEG(폴리에틸렌글리콜)를 첨가했을 때의 PEG의 최종 농도가 2 내지 5 중량％인 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제2 공정의 콜레스테롤 측정이 분획 조작을 요하지 않는 저비중 리포단백질 중 콜레스테롤의 정량 시약을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제2 공정의 중성 지방 측정이 분획 조작을 요하지 않는 저비중 리포단백질 중 중성 지방의 정량 시약을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제2 공정의 단백질 측정이 항인간 아포단백질 B 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
피검체 시료에 다가음이온 및 2가 양이온을 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는, 피검체 시료로부터 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제15항에 있어서, 피검체 시료에 추가로 1가 양이온을 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산 및 덱스트란 황산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 다가음이온인 것을 특징으로 하는, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온인 것을 특징으로 하는, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제17항에 있어서, 피검체 시료에 다가음이온을 첨가했을 때의 다가음이온의 최종 농도가, 헤파린의 경우 10 내지 250 U/mL, 덱스트란 황산의 경우 0.02 내지 1.25 중량％, 인텅스텐산의 경우 0.02 내지 1.25 중량％인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제18항에 있어서, 피검체 시료에 2가 양이온을 첨가했을 때의 2가 양이온의 최종 농도가, Mn²⁺의 경우 2.5 내지 35 mmol/L, Mg²⁺의 경우 2.5 내지 125 mmol/L, Ca²⁺의 경우 1 내지 75 mmol/L인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제19항에 있어서, 피검체 시료에 1가 양이온을 첨가했을 때의 1가 양이온의 최종 농도가 0 내지 50 mmol/L인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
피검체 시료에 PEG(폴리에틸렌글리콜)를 첨가하여 소립자 저비중 리포단백질 이외의 저비중 리포단백질을 침전시키는 것을 포함하는, 피검체 시료로부터 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
제23항에 있어서, 피검체 시료에 PEG(폴리에틸렌글리콜)를 첨가했을 때의 PEG의 최종 농도가 2 내지 5 중량％인, 소립자 저비중 리포단백질을 분리하는 방법.
다가음이온, 2가 양이온 및 1가 양이온을 포함하는 분리제 및 저비중 리포단백질 측정 시약을 포함하는, 소립자 저비중 리포단백질 중의 콜레스테롤 또는 중성 지방 또는 단백질을 측정하기 위한 소립자 저비중 리포단백질 측정용 키트.
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제25항에 있어서, 2가 양이온이 Mn²⁺, Mg²⁺ 및 Ca²⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2가 양이온이고, 1가 양이온이 Na⁺, K⁺ 및 Li⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1가 양이온인 것을 특징으로 하는 키트.