CN101482570A - 化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，包括样本的预处理、血清测定等步骤。本发明准确可靠，可作为一种准确可靠sdLDL检测方法。

Description

化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法

技术领域：

本发明涉及一种血清小而密低密度脂蛋白检测方法。

背景技术：

目前检测sdLDL的方法主要包括梯度凝胶电泳(Gradient GelElectrophoresis，GGE)；密度梯度超速离心(Density gradientultracentrifugation，DGUC)；核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)光谱法等，这些方法都是针对sdLDL某一方面的特性进行检测，各自有不同程度的局限性，如操作繁琐、耗时(需24小时以上)、需特殊昂贵设备(有的仪器需100多万元)、操作要求极高等，因而这些方法仅限于实验室研究使用，没有得到普及。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种检测sdLDL准确可靠的化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是：包括下列步骤：

1)测试前标本处理：取肝素—镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37℃孵育10min，立即转放置4℃冰箱15min，12000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素—镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/L、0.1g/L硫酸葡聚糖的试剂；

2)检测：经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具体测试方法如下：

采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R₁试剂中含有聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的H₂O₂在缺乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R₂试剂时，含对sdLDL-C有特异作用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder反应，测定546nm处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全自动生化分析仪。结果计算：sdLDL-C(mmol/L)＝标本吸光度/参考品吸光度×参考品浓度(注：各吸光度计算ΔA＝A₂—A₁)

测定主要参数为：采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm，反应温度为37℃。

采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定时，先将待测样本与R₁试剂反应300秒，再与R₂试剂反应300秒，待测样本、R₁试剂、R₂试剂的体积比为1:75:25。

本发明

a)反应原理：肝素与镁离子，并加入适量添加剂沉淀血清中大部分含ApoB的脂蛋白[VLDL、Lp(a)、大而轻低密度脂蛋白(large，buoyant LDL，lLDL)]，而HDL与sdLDL不被沉淀，直接测定上清液中LDL-C浓度即得sdLDL-C含量；

b)试剂与仪器：血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇试剂由上海北海生物技术工程有限公司提供；载脂蛋白A1、B试剂由上海捷门生物技术有限公司提供；葡萄糖试剂由温州东瓯生物科技有限公司提供；氯化镁由上海凌峰化学试剂有限公司提供，高密度胆固醇纯品、添加剂由Sigma公司提供，浓度为5.9mg/ml。全自动生化分析仪日立7600-020；低温超速离心机Beckman-Coulter公司AllegraTM 64R；

c)标本收集：研究对象禁止荤食3天，早晨禁止饮食和喝水，取静脉血2ml，置有盖密封试管，37℃静置30min，3000转/min离心10min，取上层血清，密封，作为待测样本，2h内完成所有生化指标检测，若不能完成需密封放置—70℃保存，保存时间不超过2个月。

本发明准确可靠，为sdLDL的检测提供了一种简便、快速的方法。

下面结合实例对本发明作进一步说明。

具体实施方式：

a)反应原理：肝素与镁离子，并加入适量添加剂沉淀血清中大部分含ApoB的脂蛋白[VLDL、Lp(a)、大而轻低密度脂蛋白(large，buoyantLDL，lLDL)]，而HDL与sdLDL不被沉淀，直接测定上清液中LDL-C浓度即得sdLDL-C含量；

b)试剂与仪器：血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇试剂由上海北海生物技术工程有限公司提供；载脂蛋白A1、B试剂由上海捷门生物技术有限公司提供；葡萄糖试剂由温州东瓯生物科技有限公司提供；氯化镁由上海凌峰化学试剂有限公司提供，高密度胆固醇纯品、添加剂由Sigma公司提供，浓度为5.9mg/ml。全自动生化分析仪日立7600-020；低温超速离心机Beckman-Coulter公司AllegraTM 64R；

c)标本收集：研究对象禁止荤食3天，早晨禁止饮食和喝水，取静脉血2ml，置有盖密封试管，37℃静置30min，3000转/min离心10min，取上层血清，密封，作为待测样本，2h内完成所有生化指标检测，若不能完成需密封放置—70℃保存，保存时间不超过2个月；

d)测试前标本处理：取肝素—镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37℃孵育10min，立即转放置4℃冰箱15min，12000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素—镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/L、0.1g/L硫酸葡聚糖的试剂；

e)检测：经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具体测试方法如下：

采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R₁试剂中含有聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的H₂O₂在缺乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R₂试剂时，含对sdLDL-C有特异作用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder反应，测定546nm处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全自动生化分析仪。

测定主要参数为：采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm，反应温度为37℃。

采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定时，先将待测样本与R₁试剂反应300秒，再与R₂试剂反应300秒，待测样本、R₁试剂、R₂试剂的体积用量分别为3μl、225μl、75μl。

统计学处理：应用SPSS11.5统计分析软件包，计量资料采用t检验，并分别计算均数(x)、标准差(s)和变异系数，所得结果表示为均数±标准差(x±s)；计数资料采用χ²检验，显著性差异的概率均设为P<0.05。

还取健康体检者138例为对照组，年龄22～52岁，平均年龄(31.8±8)岁，其中男性71例，女性67例，所有健康体检者无心脑血管疾病，无糖尿病，以及其他影响脂质代谢的疾病，且近2个月未服用影响血脂的药物如他汀类药物等；经冠状动脉血管造影证实初诊冠心病人30例，均未使用如他汀类药物，男性16例，女性14例，年龄35～72岁，平均年龄(51.8±6.7)岁。采用上述方法进行sdLDL浓度检测，结果：健康体检者sdLDL浓度为0.5±0.28mmol/L，中位数为0.48mmol/L，最大浓度1.12mmol/L。sdLDL浓度与TG、ApoB、LDL、HDL相关性分别为0.642、0.723、0.812、-0.256。6名健康体检者sdLDL浓度为“0”，占总健康体检者4.3％(6/138)。其中男性sdLDL浓度明显高于女性sdLDL浓度(0.57±0.27，0.40±0.32，P<0.05)。30例冠心病患者sdLDL浓度为1.3±0.41mmol/L，中位数为1.28mmol/L，在30例冠心病患者中占27％(8/30)的患者LDL—C浓度超过正常范围，sdLDL浓度与与TG、ApoB、LDL、HDL相关性分别为0.742、0.78、0.672、-0.231。见表1：

表1 对照组与病例组血脂检测结果

f)方法特异性：将HDL纯品配制成低值2.0mmol/L和高值5.0mmol/L，超速离心制备得到的sdLDL纯品配制成低值0.5mmol/L和高值2.0mmol/L以及超速离心制得不含sdLDL血清(LDL-C浓度为4.1mmol/L，HDL-C浓度为2.2mmol/L)按照方法中所描述进行样本处理，各样本重复测定5次，测得HDL低值2.0±0.05mmol/L，高值5.0±0.1mmol/L；sdLDL低值0.5±0.03mmol/L，高值2.0±0.09mmol/L，不含sdLDL血清LDL-C浓度为0.0mmol/L，HDL-C浓度为2.2mmol/L±0.09mmol/L，说明该法仅沉淀除sdLDL以外的其他含ApoB的胆固醇，不能沉淀HDL与sdLDL；

g)添加剂的影响将sdLDL纯品低值0.5mmol/L和高值2.0mmol/L用不含0.1％添加剂的沉淀剂处理后测得其浓度为低值0.41±0.04mmol/L和高值1.53±0.11mmol/L(n＝5)；用含0.1g/L％硫酸葡聚糖的沉淀剂处理后测得其浓度为低值0.5±0.03mmol/L，高值2.0±0.09mmol/L(n＝5)。不含0.1g/L硫酸葡聚糖的沉淀剂处理标本时，约使20％sdLDL被沉淀(处理后/处理前)，从而导致sdLDL检测结果偏低；

h)精密度实验：将方法中所制备的sdLDL纯品用生理盐水分别稀释成高值1.6mmol/L和低值0.6mmol/L，分别测定批内和日间标准差(s)、CV。其中高值批内s、CV分别为0.01、2.0％，批间s、CV分别为0.023、2.7％；低值批内s、CV分别为0.026、6.7％，批间s、CV分别为0.031、4.5％；

i)检测范围：取sdLDL纯品，用生理盐水作稀释，使sdLDL的含量分别为原来纯品的1/20、1/10、2/10、4/10、6/10、8/10、10/10，各稀释液平行测定2次，以预测值为X，实测值为Y，进行线性相关分析，方程为Y＝0.987X+0.006，r＝0.997。说明本法的sdLDL检测浓度可报告范围达到2.2mmol/L；

j)干扰实验：主要观察整个样本处理和检测过程中、血红蛋白和胆红素对sdLDL结果的影响。将HDL-C、VLDL—C、血红蛋白和胆红素分别加入只含sdLDL，使其终浓度分别为HDL-C(1mmol/L)、VLDL—C(1mmol/L)、血红蛋白(500mg/dl)、胆红素(40mg/dl)，按照上述方法进行样本处理，检测加入干扰物前后sdLDL浓度(平行处理测定2次)，结果分别为99.2％、99.7％、97.1％、97.6％。结果显示：HDL-C、VLDL—C对该法测定sdLDL无干扰，血红蛋白≤500mg/L、胆红素≤40mg/L不影响测定结果。

k)回收实验：在900μL sdLDL浓度为1.1mmol/L血清中加入100μLsdLDL纯品液系列。sdLDL纯品液浓度：高值＝3mmol/L，中值＝1.2mmol/L，低值＝0.5mmol/L，测定样本中的sdLDL浓度，结果该方法的平均回收率在97.9％。

Claims (3)

1、化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是：包括下列步骤：

1)测试前标本处理：取肝素—镁试剂0.2ml加入0.2ml血清置于1.5ml离心管中，混匀，试管密封置37℃孵育10min，立即转放置4℃冰箱15min，12000rpm离心15min，取上清液作为待测标本；所述肝素—镁试剂是含145U/mL肝素、氯化镁79mmol/L、0.1g/L硫酸葡聚糖的试剂；

2)检测：经过方法处理后待测样本中仅含sdLDL而无其他低密度脂蛋白胆固醇，测定待测样本中LDL-C浓度即得该样本sdLDL浓度；具体测试方法如下：

采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒进行双试剂测定，R₁试剂中含有聚阴离子与sdLDL形成复合物而遮蔽sdLDL-C，血清中HDL在表面活性剂作用下与酶试剂产生不完整的Trinder反应，反应中产生的H₂O₂在缺乏偶联剂时被消耗而不显色；当加入R₂试剂时，含对sdLDL-C有特异作用的表面活性剂能水解sdLDL-C，释放出其胆固醇，参与完整的Trinder反应，测定546nm处的吸光度与sdLDL-C的浓度成正比，测定仪器为全自动生化分析仪。

2、根据权利要求1所述的化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是：测定主要参数为：采用二点终点法，定标模式采用二点定标，反应方向为上升，主波长为546nm，副波长为600nm，反应温度为37℃。

3、根据权利要求1或2所述的化学沉淀法检测血清小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是：采用包括R₁、R₂试剂的胆固醇试剂盒对待测样本进行双试剂测定时，先将待测样本与R₁试剂反应300秒，再与R₂试剂反应300秒，待测样本、R₁试剂、R₂试剂的体积比为1:75:25。