CN109580303A

CN109580303A - 低密度脂蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN109580303A
Application number: CN201811487633.4A
Authority: CN
Inventors: 张波; 刘振国; 周立忠
Original assignee: Weifang Ze Cheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Weifang Ze Cheng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明适用于生物检测技术领域，提供了一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：向血清中加入大分子化合物，除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白；然后用金属离子沉淀低密度脂蛋白；再用缓冲液和金属离子溶解沉淀，并去除白蛋白等少量杂质蛋白，最后进行低密度脂蛋白的纯化。借此，本发明能够提高低密度脂蛋白的制备速率，制备成本低、时间短，纯化产物产出量高。

Description

低密度脂蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种低密度脂蛋白的制备方法。

背景技术

低密度脂蛋白(LDL)升高是心血管疾病发生的重要影响因素，低密度脂蛋白的检测及载脂蛋白B的检测是最常用的检测血脂水平的方法；在检测以上指标时，需要一定纯度及完全活性的低密度脂蛋白作为校准品和质控品。

目前，绝大多数低密度脂蛋白测定方法是超速离心法和聚乙二醇沉淀法，这些方法都需要用到超速离心机，超速离心机在使用过程中，需要20个小时左右才能够将低密度脂蛋白或者低密度脂蛋白的中间制备产物分离，耗时较长；同时，超速离心机一般价格昂贵，且使用寿命比较短，提高了制备成本；这些方法在实施过程中需要用到包括超速离心机在内的多种仪器，操作繁琐，对工作人员的技术要求高；另外，现有技术制备的低密度脂蛋白产量比较低。

综上可知，现有技术在实际应用中显然存在不足之处，有必要加以改进。

发明内容

针对上述技术缺陷，本发明的目的在于提供一种低密度脂蛋白的制备方法，其采用大分子化合物除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白，并结合其他方法进一步纯化低密度脂蛋白，使用的仪器、设备和试剂耗材少，制备成本低，操作简单，适合低密度脂蛋白的批量纯化；低密度脂蛋白的制备可在2小时内完成，制备时间短，效率高；纯化产物产出量高，在88.5％以上。

为了实现上述目的，本发明提供一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为0.1～10％，混匀后离心，取一次上清液。

步骤二沉淀低密度脂蛋白

向所述一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取一次沉淀。

步骤三沉淀混合物的溶解

向所述一次沉淀中加入缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取二次上清液；

所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10。

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

向所述二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；

向所述二次沉淀中加入所述缓冲液和所述金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白；

所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10。

步骤五纯化低密度脂蛋白

采用国家标准检测方法对所述低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子为NaCl、KI、KCL、NaI、KBr、MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂中的任意一种。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述金属离子为MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂中的任意一种。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述大分子化合物与所述血清的体积比为1～10:100。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，离心过程中，离心机的转速为9000～11000r/min，离心时间为3～10min。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述缓冲液的pH为5.0～9.0，所述缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂的浓度为1.0～5.0％。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂的加入量为所述二次上清液体积的3～9％。

根据本发明的低密度脂蛋白的制备方法，所述非选择性沉淀剂为硫酸铵、硫酸钠或聚乙二醇中的任意一种

本发明的有益效果为：

1、本发明采用大分子化合物除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白，并结合其他方法进一步纯化低密度脂蛋白，使用的仪器少，整个操作过程简单，对工作人员的技术要求低，提高低密度脂蛋白的制备速率。

2、本发明使用的离心机为高速离心机，也不需要其他精密仪器，使用的试剂为常见试剂，因此，设备和试剂等耗材少，制备成本低，适合低密度脂蛋白的批量纯化。

3、本发明可在2小时内完成，制备时间短，效率高。

4、本发明的方法制备的低密度脂蛋白纯化产物产出量高，在88.5％以上。

附图说明

图1是本发明低密度脂蛋白的制备流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，混匀后离心，取一次上清液。大分子化合物能够与血清中除低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白发生沉淀反应，而低密度脂蛋白和高密度脂蛋白存在于一次上清液中。

大分子化合物与血清的体积比为1～10:100；大分子化合物选用肝素、PVP、DS中的任意一种或者几种，大分子化合物的浓度为0.1～10％，为了促进离心效果，作为一种优选的方案，大分子化合物选用肝素、PVP、DS中的任意两种，且经过多次试验，肝素和DS两种大分子化合物混合使用时，离心效果最好，低密度脂蛋白产出量最高，且肝素和DS的体积比为1:4～7。

采用不溶血血清，血清采集后应尽快分析，当天不能检测的血清在2～8℃条件下可贮存5～7天，-20℃条件下可贮存25～30天，只能解冻一次检测。

步骤二沉淀低密度脂蛋白

向步骤一中得到的一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，搅拌溶解的时间为5～10min，溶解后进行离心，然后取一次沉淀。金属离子可以与低密度脂蛋白生成沉淀，经过离心后将高密度脂蛋白去除。

步骤三沉淀混合物的溶解

向步骤二制得的一次沉淀中加入缓冲液和金属离子，搅拌溶解，搅拌溶解的时间为5～10min，溶解后进行离心，然后取二次上清液；缓冲液和金属离子共同作用，能够将沉淀中的低密度脂蛋白溶解出来。

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

向步骤三制得的二次上清液中加入非选择性沉淀剂，进行沉淀反应，反应时间为5～10min，反应完全后进行离心，然后取二次沉淀；二次上清液中还存在少量白蛋白等杂质，在二次上清液中加入非选择性沉淀剂，沉淀低密度脂蛋白，除去白蛋白等杂质；

向二次沉淀中加入缓冲液和金属离子，搅拌溶解，得到低密度脂蛋白。

非选择性沉淀剂的加入量为二次上清液体积的3～9％，非选择性沉淀剂的浓度为1.0～5.0％；非选择性沉淀剂为硫酸铵、硫酸钠或聚乙二醇中的任意一种。

本发明中的离心机选用高速离心机，转速为9000～11000r/min，离心时间为3～10min。

本发明中的缓冲液可选Tris缓冲液、PB缓冲液或其他缓冲液，缓冲液的pH为5.0～9.0，缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L；缓冲液与一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10；缓冲液与二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10。

本发明中的金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L，金属离子为NaCl、KI、KCL、NaI、KBr、MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。

经过多次试验，在步骤二中，二价金属离子的沉淀效果较一价金属离子更好，在步骤三和步骤四中，二价金属离子的溶解效果较一价金属离子更好，因此，作为一种优选的方案，金属离子为MgCl2、CaCl2、MnCl2中的任意一种。

步骤五纯化低密度脂蛋白

采用国家标准检测方法对步骤四中的低密度脂蛋白进行纯化，并计算纯化产出量。

为获取最佳实施方式，本发明以上述制备方法制备低密度脂蛋白，设置如下若干实施例，并计算低密度脂蛋白的纯化产出量；

实施例1

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为6％，混匀后离心，取一次上清液。

步骤二沉淀低密度脂蛋白

步骤三沉淀混合物的溶解

所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.9:10。

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.53:10。

所述金属离子的浓度为0.05mol/L。

实施例2

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为8.4％，混匀后离心，取一次上清液。

步骤二沉淀低密度脂蛋白

步骤三沉淀混合物的溶解

所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为1.2:10。

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.5:10。

所述金属离子的浓度为0.07mol/L。

实施例3

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为5％，混匀后离心，取一次上清液。

步骤二沉淀低密度脂蛋白

步骤三沉淀混合物的溶解

所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为1.1:10。

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.58:10。

所述金属离子的浓度为0.06mol/L。

其它实施例的执行过程不再赘述，各实施例其它未示出部分的数据见表一，各实施例低密度脂蛋白的纯化产出量见表二。

表一各实施例的数据

表二低密度脂蛋白的纯化产出量

由上述实施例可以看出，以本发明的方法制备低密度脂蛋白，得到低密度脂蛋白的纯化产出量都在88.5％以上，说明本发明的方法较现有技术更好。

另外，本发明除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白、沉淀低密度脂蛋白、沉淀混合物的溶解、白蛋白等少量杂质蛋白的去除总共在40min内能够完成，以国家标准检测方法对低密度脂蛋白进行纯化的步骤在一个小时之内也能够完成，因此，本发明的耗时总共不超过2小时，低密度脂蛋白的制备时间较短，效率较高。

综上所述，本发明采用大分子化合物沉淀低密度脂蛋白，并结合其他方法进一步纯化低密度脂蛋白，使用的仪器少，整个操作过程简单，对工作人员的技术要求低，提高低密度脂蛋白的制备速率；本发明使用的离心机为高速离心机，也不需要其他精密仪器，使用的试剂为常见试剂，因此，设备和试剂等耗材少，制备成本低，适合低密度脂蛋白的批量纯化；本发明可在2小时内完成，制备时间短，效率高；本发明的方法制备的低密度脂蛋白纯化产物产出量高，在88.5％以上。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白

向血清中加入大分子化合物，大分子化合物的浓度为0.1～10％，混匀后离心，取一次上清液；

步骤二沉淀低密度脂蛋白

向所述一次上清液中加入金属离子，搅拌溶解，溶解后进行离心，然后取一次沉淀；

步骤三沉淀混合物的溶解

所述缓冲液与所述一次沉淀的体积比为0.8～1.3:10；

步骤四白蛋白等少量杂质蛋白的去除

所述缓冲液与所述二次沉淀的体积比为0.4～0.9:10；

步骤五纯化低密度脂蛋白

2.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述金属离子的浓度为0.01～0.1mol/L。

3.根据权利要求2所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述金属离子为NaCl、KI、KCL、NaI、KBr、MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述金属离子为MgCl₂、CaCl₂、MnCl₂中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述大分子化合物与所述血清的体积比为1～10:100。

6.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，离心过程中，离心机的转速为9000～11000r/min，离心时间为3～10min。

7.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述缓冲液的pH为5.0～9.0，所述缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/L。

8.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述非选择性沉淀剂的浓度为1.0～5.0％。

9.根据权利要求8所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述非选择性沉淀剂的加入量为所述二次上清液体积的3～9％。

10.根据权利要求9所述的低密度脂蛋白的制备方法，其特征在于，所述非选择性沉淀剂为硫酸铵、硫酸钠或聚乙二醇中的任意一种。