CN103389241A - 一种血液纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于应用在体外诊断领域生物标志物检测中的阴性血液的制备方法，特别涉及利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法。本发明通过将即能识别生物标志物又能识别超顺磁颗粒上探针分子的生物分子溶液加入到探针分子标记的超顺磁颗粒中，快速制备出能够识别生物标志物的超顺磁颗粒，被识别的生物标志物是血液中拟去除的生物标志物；然后将血液样品加入到装有上述拟去除血液中生物标志物的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒的容器中，充分混合，使血液样品中的生物标志物结合在所述的识别生物标志物的超顺磁颗粒上，通过外加磁场，分离出血液，得到去除了血液样品中的某种生物标志物的阴性血液样品。
Description
技术领域
本发明属于应用在体外诊断领域生物标志物检测中的阴性血液的制备方法，涉及可以循环使用的超顺磁颗粒进行分离纯化血液，特别涉及利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法。
背景技术
生物标志物是医药领域中的一个十分热门的课题。在医学领域，生物标志物可用于疾病诊断，判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。随着分子生物学技术的不断进展，生物标志物包括的种类也越来越多，例如SNP、基因组、转录组和蛋白质组等等都被列入生物标志物的行列。生物标志物的检测样本有多种多样，血液样本是最主要的样本之一。许多生物标志物不是患者的专有属性，正常人体内也含有，只有当人发病时，这些生物标志物会高出正常人体中所含生物标志物值的平均水平，以此来诊断疾病的发生与发展。血液中的生物标志物的检测方法有多种，而对于定量检测方法的建立与应用，标准工作曲线的制作是必不可少的，通常生物标志物的标准样品是用阴性血液（不含拟检测的生物标志物的血清或者血浆）稀释标准品而制备。目前许多生物标志物的标准样品的制备所使用的标准品稀释液是小牛血清或者胎牛血清，但是我们在生物样品的实际分析中发现，以人血清、人血浆和动物血清为标准品稀释液对许多生物标志物标准品的检测的结果是不一致的，为了提高血液生物样品临床检测的准确性，应该使用人源的阴性血液作为标准品的稀释液来制作工作曲线。目前的阴性血液的制备是使用含有识别生物标志物的凝胶分离柱或者聚合物分离膜的分离材料，血液流经分离材料，生物标志物被特异性地捕捉在分离材料上。此方法的缺点是血液不能充分与分离材料上的识别生物标志物的分子充分反应，分离效率低，并且需要特定的动力装置推动血液运动。这些方法主要是针对单一生物标志物的清除，分离材料上识别生物标志物的分子容易脱离，分离材料难以真正被重复使用，生产成本较高。
发明内容
本发明的目的是为临床体外诊断血液样品中的生物标志物的检测提供标准品制备用的阴性血液，从而提供一种利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法。
本发明提供的是一种利用生物标志物进行体外诊断领域的阴性血液的制备方法。本发明利用探针分子标记的超顺磁颗粒为固相载体，通过将即能识别生物标志物又能识别超顺磁颗粒上探针分子的生物分子溶液加入到探针分子标记的超顺磁颗粒中，快速制备出能够识别生物标志物的超顺磁颗粒，被识别的生物标志物是血液中拟去除的生物标志物；然后将血液样品（血浆或者血清）加入到装有上述拟去除血液中生物标志物的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒的容器中，充分混合，使血液样品中的生物标志物结合在所述的识别生物标志物的超顺磁颗粒上，通过外加磁场，分离出血液，得到去除了血液样品中的某种生物标志物的阴性血液样品。
本发明的利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法包括以下步骤：
（1）向探针分子标记的超顺磁颗粒中加入含有能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白的水溶液或者核酸的水溶液，充分混合，使蛋白或者核酸结合在所述的探针分子标记的超顺磁颗粒上，在外加磁场的作用下分离出溶液，得到的沉淀物为能够识别生物标志物的超顺磁颗粒；
（2）向步骤（1）得到的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒中加入含有生物标志物的血液样品（血浆或者血清），充分混合后，使血液样品（血浆或者血清）中的生物标志物结合在所述的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒上，在外加磁场的作用下分离出血液，得到了血液中不含生物标志物的阴性血液（阴性血浆或者阴性血清）。
用洗脱液清洗步骤（2）处理过血液样品的结合有生物标志物的超顺磁颗粒，将生物标志物从结合有生物标志物的超顺磁颗粒上洗脱下来，分离出溶液，从而得到的沉淀物为可以回收再利用的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒。
所述的向探针分子标记的超顺磁颗粒中加入含有能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白的水溶液或者核酸的水溶液，其中：所述的探针分子标记的超顺磁颗粒与能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白或者核酸的摩尔比为1∶1～1∶20。
所述的含有能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白的水溶液或者核酸的水溶液为纯水或超纯水配制的水溶液，或者由含有能使蛋白或者核酸稳定的水溶性缓冲液配制的水溶液；所述的水溶性缓冲液为生化领域公知的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液、2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液或柠檬酸缓冲液等。
所述的向步骤（1）得到的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒中加入含有生物标志物的血液样品，其中：能够识别生物标志物的超顺磁颗粒与含有生物标志物的血液样品的摩尔比为1∶10～100∶1，优选摩尔比为1∶1～10∶1。
所述的外加磁场是使用普通的永磁铁或者电磁铁，以能快速（一般在10秒内）吸住超顺磁颗粒为使用的条件。
所述的分离可用磁铁（如用普通的永磁铁或者电磁铁）磁化超顺磁颗粒，将超顺磁颗粒吸向容器壁，然后将溶液取出。
所述的探针分子可是亲和素、链霉亲和素、蛋白A或蛋白G；上述探针分子标记的超顺磁颗粒的制备方法为本领域的通用方法，如参考文献（Biofunctionalization of Nanomaterials，Edited by Challa Kumar.Nanotechnologies for Life Sciences.Volume 1.，Weinheim:Wiley-VCH VerlagGmbH Co.KGaA,2005，ISBN:3-527-31381-8）。
所述的探针分子也可以是含有环氧基团的分子（如3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷），上述探针分子标记的超顺磁颗粒的制备方法为本领域的通用方法，如参考文献（Biofunctionalization of Nanomaterials，Edited by ChallaKumar.Nanotechnologies for Life Sciences.Volume 1.，Weinheim:Wiley-VCHVerlag GmbH Co.KGaA,2005，ISBN:3-527-31381-8）。
所述的超顺磁颗粒的平均粒径为本领域常用的尺寸，一般平均粒径为10～3000nm，优选超顺磁颗粒的平均粒径为10～1000nm。
所述的超顺磁颗粒一般是由含有铁、钴、锰的氧化物组成；其可以是氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒、铁磁性钴氧化物颗粒或铁磁性锰氧化物颗粒。
所述的生物标志物为单靶标或者多靶标的生物标志物。所述的生物标志物为在临床体外血液诊断中正在使用的用于监测和评价能够导致生物有机体的生物化学和生理学改变的某种特征性的生化指标的生物标志物或者可能成为生物标志物使用的蛋白或者核酸。例如肿瘤标志物中的癌胚抗原或CA125等、心血管疾病标志物中的肌钙蛋白或肌红蛋白等、传染病标志物中的乙肝表面抗原或艾滋病病毒等、骨病标志物中的骨钙素等、免疫疾病标志物中的血清淀粉样蛋白A等、炎症性疾病标志物中的Ｃ反应性蛋白或白介素6等。所述的生物标志物的种类不仅仅局限上述提到的标志物。
所述的单靶标的生物标志物如可选自肿瘤标志物中的一种、心血管疾病标志物中的一种、传染病标志物中的一种、骨病标志物中的一种、免疫疾病标志物中的一种、炎症性疾病标志物中的一种或遗传性疾病标志物中的一种等。
所述的多靶标的生物标志物如可选自肿瘤标志物、心血管疾病标志物、传染病标志物、骨病标志物、免疫疾病标志物、炎症性疾病标志物和遗传性疾病标志物中的一种或几种；且所述的肿瘤标志物中的标志物可为一种或几种，所述的心血管疾病标志物中的标志物可为一种或几种，所述的传染病标志物中的标志物可为一种或几种，所述的骨病标志物中的标志物可为一种或几种，所述的免疫疾病标志物中的标志物可为一种或几种，所述的炎症性疾病标志物中的标志物可为一种或几种，所述的遗传性疾病标志物中的标志物可为一种或几种。
所述的标志物是蛋白或者核酸。所述的蛋白可以是抗原或抗体，但不仅限于此。
所述的洗脱液为本领域公知的抗原抗体复合物解离剂，核酸复合结构解离剂。例如无机盐的水溶液（如1M的NaCl水溶液或3.5M的MgCl2水溶液等）、乙二胺四乙酸（EDTA）水溶液（如1mM的乙二胺四乙酸（EDTA）水溶液等）、甘氨酸缓冲液（如100mM pH1.8的甘氨酸缓冲液或100mM pH2.2的甘氨酸缓冲液等）、三乙胺缓冲液（如100mM pH11.5的三乙胺缓冲液等）、离子型去垢剂（如质量浓度为1%的十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液等）。
本发明的利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法具有：操作方法简单、快速，血液纯化的效率高；本发明的方法不仅适合于单靶标的生物标志物的清除，也适合于多靶标的生物标志物的同时快速清除，可以快速制备阴性血液。并且处理过血液的结合有生物标志物的超顺磁颗粒易于回收循环使用，成本低。本发明的方法能广泛应用于基于蛋白免疫以及基因检测的体外诊断研究与生产中。
附图说明
图1.本发明实施例2的血浆处理前后生物标志物含量的对照图。
具体实施方式
实施例1.含有肌红蛋白的阴性血清的纯化
在装载有10mL标记有3×10-8mol 3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（1分子含有一份环氧基官能团）的氧化铁颗粒（氧化铁颗粒的粒径为500nm）的离心管中，加入10ml含有1mg/ml生物标志物肌红蛋白(MYO)对应的抗体的水溶液（水溶液是由pH7.4的磷酸盐缓冲液用纯水稀释得到的水溶液，其中MYO抗体的含量为6×10-7mol），37℃振荡反应30分钟，使MYO抗体与氧化铁颗粒上的探针分子3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷的环氧基官能团相结合，然后用20mL pH为7.4的含有质量浓度为0.1%Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗，在以永磁铁为外加磁场的作用下分离出全部溶液，重复三次，最后用10mL超纯水清洗，得到能够识别MYO的抗体的氧化铁颗粒。
在离心管中加入0.5mL上述得到的能够识别MYO的抗体的氧化铁颗粒，然后加入含有MYO的血清10mL，振荡5分钟，使血清中的MYO结合在识别MYO的抗体的氧化铁颗粒上，在以永磁铁为外加磁场的作用下分离出血清，得到了血清中不含MYO的阴性血清。
向离心管中处理完血清的上述的氧化铁颗粒中，加入pH2.2的100mM甘氨酸缓冲液1mL后振荡30分钟，将MYO从结合有MYO的抗体的氧化铁颗粒上洗脱下来，分离出溶液，用PBST清洗所得沉淀物后，即得到可再次使用的能够识别MYO的抗体的氧化铁颗粒。
实施例2.含有肌红蛋白（MYO）、C反应蛋白（CRP）和肌酸激酶的同工酶（CK-MB）的阴性血浆的纯化
在装载有5mL标记有1×10-6mol亲和素的铁磁性钴氧化物颗粒（铁磁性钴氧化物的粒径为50nm）的离心管中，加入含有生物素修饰的肌红蛋白(MYO)的抗体1×10-6mol、生物素修饰的C反应蛋白（CRP）的抗体1×10-6mol和生物素修饰的肌酸激酶的同工酶（CK-MB）的抗体1×10-6mol的混合水溶液2mL（水溶液是由含有质量浓度为0.1%Tween 20的pH8.0的Tris缓冲液配制的水溶液），37℃振荡反应30分钟，使肌红蛋白(MYO)的抗体、C反应蛋白（CRP）的抗体和生物素修饰的肌酸激酶的同工酶（CK-MB）的抗体与铁磁性钴氧化物颗粒上的探针分子亲和素相结合，然后用5mL PBST清洗，在以电磁铁为外加磁场的作用下分离出全部溶液，重复三次，最后用5mL超纯水清洗，得到能够识别上述三种生物标志物（MYO、CRP和CK-MB）的混合抗体的铁磁性钴氧化物颗粒。
在离心管中加入2mL上述得到的能够识别三种生物标志物（MYO、CRP和CK-MB）的混合抗体的磁性钴氧化物颗粒，然后加入含有MYO、CRP和CK-MB的血浆1mL，振荡5分钟后，使血浆中的MYO、CRP和CK-MB结合在识别三种生物标志物（MYO、CRP和CK-MB）的混合抗体的磁性钴氧化物颗粒上，在以永磁铁为外加磁场的作用下分离出血浆，得到了血浆中不含MYO、CRP和CK-MB的阴性血浆。测试处理前后的血浆中三种靶标的浓度，结果见表1和图1。
向离心管中处理完血浆的磁性钴氧化物颗粒中，加入pH1.5的100mM甘氨酸缓冲液2mL后振荡30分钟，将MYO、CRP和CK-MB从结合有MYO、CRP和CK-MB的抗体的磁性钴氧化物颗粒上洗脱下来，分离出溶液，用PBST清洗所得沉淀物后，即得到可再次使用的能够识别MYO、CRP和CK-MB的抗体的磁性钴氧化物颗粒。
表1血浆样品处理前后生物标志物的含量
实施例3.含有白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF α）的阴性血清的纯化
在装载有1mL标记有1×10-6mol蛋白A的铁磁性锰氧化物颗粒（铁磁性锰氧化物的粒径为100nm）的离心管中，加入含有白介素6（IL-6）的抗体和肿瘤坏死因子α（TNF α）的抗体各1×10-6mol的混合水溶液2mL（水溶液是由含有质量浓度为0.1%Tween 20的pH8.0的Tris缓冲液配制的水溶液），37℃振荡反应30分钟，使白介素6（IL-6）的抗体和肿瘤坏死因子α（TNF α）的抗体与铁磁性锰氧化物颗粒上的探针分子蛋白A相结合，然后用5mL PBST清洗，在以电磁铁为外加磁场的作用下分离出全部溶液，重复三次，最后用5mL超纯水清洗，得到能够识别上述两种生物标志物（IL-6、TNF α）的混合抗体的铁磁性锰氧化物颗粒。
在10mL离心管中加入0.5mL上述得到的能够识别两种生物标志物（IL-6、TNF α）的混合抗体的铁磁性锰氧化物颗粒，然后向离心管中加入含有IL-6和TNF α的血清10mL，振荡5分钟后，使血清中的IL-6和TNF α结合在识别两种生物标志物（IL-6、TNF α）的混合抗体的铁磁性锰氧化物颗粒上，在以永磁铁为外加磁场的作用下分离出分离出血清，得到了血清中不含IL-6和TNF α的阴性血清。
向离心管中处理完血清的铁磁性锰氧化物颗粒中，加入2mol/L硫酸铵水溶液1mL后振荡30分钟，将IL-6和TNF α从结合有IL-6和TNF α的抗体的铁磁性锰氧化物颗粒上洗脱下来，分离出溶液，用PBST清洗所得沉淀物后，即得到可再次使用的能够识别IL-6和TNF α的抗体的铁磁性锰氧化物颗粒。实施例4.含有microRNA标志物miR-141的阴性血清的纯化
在装载有1mL标记有1×10-8mol链霉亲和素的铁磁性钴氧化物颗粒（铁磁性钴氧化物颗粒的粒径为200nm）的离心管中，加入0.2ml含有识别生物标志物miR-141的生物素标记的DNA分子10-8mol的水溶液（水溶液是由pH7.4的磷酸盐缓冲液配制的水溶液），37℃振荡反应30分钟，使识别生物标志物miR-141的生物素标记的DNA与铁磁性钴氧化物颗粒上的探针分子链霉亲和素相结合，然后用5mL超纯水清洗，在以电磁铁为外加磁场的作用下分离出全部溶液，重复三次，最后用5mL超纯水清洗，得到能够识别生物标志物miR-141的DNA的铁磁性钴氧化物颗粒。
在离心管中加入1mL上述得到的能够识别生物标志物miR-141的DNA的铁磁性钴氧化物颗粒，然后加入含有miR-141的血清2mL，振荡15分钟后，使血清中的miR-141结合在识别生物标志物miR-141的DNA的铁磁性钴氧化物颗粒上，在以永磁铁为外加磁场的作用下分离出血清，得到了血清中不含miR-141的阴性血清。
向离心管中处理完血清的上述的铁磁性钴氧化物颗粒中，加入2mL含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液（pH8.5），60℃振荡处理30分钟，将miR-141从结合有miR-141的DNA的铁磁性钴氧化物颗粒上洗脱下来，分离出溶液，用超纯水清洗所得沉淀物后，即得到可再次使用的能够识别miR-141的DNA的铁磁性钴氧化物颗粒。
Claims (10)
1.一种利用探针分子标记的超顺磁颗粒去除血液中的生物标志物的血液纯化的方法，其特征是，所述的方法包括以下步骤：
（1）向探针分子标记的超顺磁颗粒中加入含有能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白的水溶液或者核酸的水溶液，充分混合，使蛋白或者核酸结合在所述的探针分子标记的超顺磁颗粒上，在外加磁场的作用下分离出溶液，得到的沉淀物为能够识别生物标志物的超顺磁颗粒；
（2）向步骤（1）得到的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒中加入含有生物标志物的血液样品，充分混合后，使血液样品中的生物标志物结合在所述的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒上，在外加磁场的作用下分离出血液，得到了血液中不含生物标志物的阴性血液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：用洗脱液清洗步骤（2）处理过血液样品的结合有生物标志物的超顺磁颗粒，将生物标志物从结合有生物标志物的超顺磁颗粒上洗脱下来，分离出溶液，得到的沉淀物为能够识别生物标志物的超顺磁颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：所述的洗脱液是无机盐的水溶液、甘氨酸缓冲液、三乙胺缓冲液、乙二胺四乙酸水溶液或十二烷基硫酸钠水溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述的无机盐的水溶液是NaCl水溶液或MgCl2水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的向探针分子标记的超顺磁颗粒中加入含有能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白的水溶液或者核酸的水溶液，其中：所述的探针分子标记的超顺磁颗粒与能够识别探针分子功能和识别生物标志物功能的蛋白或者核酸的摩尔比为1∶1～1∶20。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的向步骤（1）得到的能够识别生物标志物的超顺磁颗粒中加入含有生物标志物的血液样品，其中：能够识别生物标志物的超顺磁颗粒与含有生物标志物的血液样品的摩尔比为1∶10～100∶1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述的外加磁场是使用永磁铁或者电磁铁。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是：所述的探针分子为亲和素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G或含有环氧基团的分子。
9.根据权利要求1、2、5或6所述的方法，其特征是：所述的超顺磁颗粒是氧化铁颗粒、四氧化三铁颗粒、铁磁性钴氧化物颗粒或铁磁性锰氧化物颗粒。
10.根据权利要求1、2、5或6所述的方法，其特征是：所述的生物标志物为单靶标或者多靶标的生物标志物。
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