CN107153023A - 一种分离尿液中外泌体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种简单快速高效的尿液外泌体分离的方法，该方法包括：S1.收集尿液，离心，保留上清液（SN1）；S2.使用二硫苏糖醇处理底部沉淀；S3. 处理后的混合液经离心获得上清（SN2），与第一次得到的上清SN1混合；S4.将特定体积的商业化外泌体沉淀试剂加入到总的上清液中（SN1+SN2），混匀后在4℃孵育至少12个小时；S5. 将上清与外泌体沉淀试剂混合液离心，在管底得到可见的外泌体沉淀；S6. 加入磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀。与其他尿液外泌体分离的方法相比，该方法能够从尿液中获得最大数量的外泌体颗粒，同样也能产生较高数量及更优质量的外泌体miRNA或mRNA。

Description

一种分离尿液中外泌体的方法

技术领域

本发明涉及生物化学与细胞生物学领域，具体地讲，涉及一种分离尿液中外泌体的方法及试剂盒。

背景技术

尿液不仅能提供关于肾的疾病标记物，同样能提供关于尿道及前列腺等的标记物。这些生物标记物能够游离存在于尿液或存在于由膜双层所包裹的外泌体中。尿液外泌体是直径为40-100nm的小囊泡，起源于细胞内吞作用，当一个多泡小体与所有肾单元段的细胞膜融合之后而被分泌到尿液中。尿液外泌体不仅包含蛋白质，同时也包含有功能性的miRNA及mRNA分子，这些在靶细胞中能够被翻译成为蛋白质而介导细胞间的通讯。这些功能性miRNA/RNA分子被证实能作为肾功能障碍及结构性损伤相关的分子标记物之后，研究对于尿液外泌体的研究兴趣异常浓厚，于是激发了新一轮对于分离外泌体及从外泌体中提取这些分子的热情。

最经典的从体液中分离外泌体的方法是基于连续低温梯度超速离心的方法。这种方法从尿液中分离外泌体既费时，又需要昂贵的超高速离心机，每次都只能处理较少数量较小体积的样本，因此限制了其临床应用的可能性。最近几年，已经有一些成熟的外泌体提取试剂盒相继上市，这些试剂盒不需要特殊设备，可以方便快捷地提取外泌体及其所携带的RNA。此类试剂盒中，有的是利用特殊设计的过滤器过滤掉非外泌体成分，同时把外泌体中的RNA成分释放出来，直接用于接下来的实验；有的则是高分子聚合物的体积排阻效应，把外泌体沉淀出来。这样一来，从体液中分离外泌体变得省时省力，且成本大大降低。

不同的试剂盒在分离外泌体的效率方面差别明显。由于不同体液之间的生化特性等的差异，制定改进适用于特定体液如尿液中外泌体分离的方法，如何在目前标准的分离操作的技术上再进一步提高分离的效率，使得其能满足后续的蛋白及RNA分子的分析等要求，显得十分必要。

人体正常排出的尿液中富含Tamm–Horsfall蛋白（THP）。它是一种糖蛋白，生理条件下，其在尿液中由单体形式聚集形成分子量巨大的多聚体。尿液THP多聚体之间形成的网格状结构会捕获相当数目的外泌体。由于THP丰度较高，因此在一定程度上降低了尿液中外泌体的产量。研究发现，在加入二硫苏糖醇(DTT)之后，THP的多聚化网格能够被打乱，从而能够从中释放外泌体，增加外泌体提取的产量。另外，较低的温度会有利于THP的多聚化及沉淀，因此，适当提高操作及孵育温度可以减少外泌体的损失。

发明人在之前的研究实践中，先后采用了不同的方法分离尿液中的外泌体，对不同的外泌体富集和RNA提取的方法进行了比较，同时基于上述的背景，对尿液中外泌体的分离方法进行改进，提出了本发明所采用的技术方案。

通过比较实验证明，利用本发明所提供的方法能够从每ml尿液中获得最大数量的外泌体颗粒。与优选方案的标准的ExoQuick-TC的操作流程相比，这种方法同样也能产生较高数量及更优质量的外泌体miRNA和mRNA。因此，这为尿液外泌体分离及尿液外泌体分子标记物的开发提供了一个有用的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于开发一种低成本高效率的方法来分离提取尿液中的外泌体。

为了实现本发明的目的，本发明提供的一种简单快捷高效分离尿液中外泌体的方法，步骤如下：

S1.收集尿液，离心，保留上清液（SN1）。具体地，

S1A. 在无菌容器中收集第一次的尿液样本；

S1B. 在每50ml尿液中加入1ml PIC溶液以减少蛋白的降解；

S1C. 在37℃条件下，将10ml尿液/PIC混合溶液17,000 × g 离心10分钟；

S1D. 转移上清液SN1到新的管中并留存。

S2.使用二硫苏糖醇DTT处理底部沉淀；具体地，

S2A. 加入500µL分离溶液重悬沉淀，涡旋30秒；

S2B. 加入100mg DTT使得最终浓度为200mg/mL；

S2C. 在37℃条件下孵育样品10分钟，在孵育期间，每隔2分钟涡旋振荡直到沉淀完全溶解。

S3. 处理后的混合液经离心获得上清（SN2），与第一次得到的上清SN1混合；具体地，在S2C所得到的重悬液中加入1mL分离溶液，混匀，在37℃条件下，17,000 × g 离心10分钟，得到上清SN2，将其与第一次得到的上清SN1混合。

S4.将特定体积的商业化外泌体沉淀试剂加入到总的上清液中（SN1+SN2），混匀后在4℃孵育至少12个小时；具体地，

S4A. 将上清混合液SN1+SN2转移到一个大的无菌管中，测定其总体积；

S4B. 按照各自相应的操作指南，加入特定体积的商业化外泌体沉淀试剂，优选地，使用System Bioscience所生产的ExoQuick-TC外泌体沉淀试剂，再优选地，在每10mL上清混合液中加入3.3mL ExoQuick-TC外泌体沉淀试剂，来回颠倒混匀；

S4C. 在4℃条件下过夜（至少12个小时）孵育混合液

S5. 将上清与外泌体沉淀试剂混合液离心，在管底得到可见的外泌体沉淀；具体地，

S5A. 在4℃条件下10,000 × g离心混合液30分钟，离心后在管底可见米黄色或浅白色沉淀；

S5B. 再1,500 × g 离心5分钟，快速旋转出除残留的余量液体，管子开口放置2-3分钟以晾干所有的可能液体。

S6. 加入磷酸盐缓冲液（PBS）重悬外泌体沉淀；具体地，加入100µL磷酸缓冲液，不断搅动重悬沉淀，直至液体完全透亮在光下不显示有任何悬浮颗粒。

基于以上从尿液中分离外泌体的具体操作步骤，本发明还构造了一种分离尿液中外泌体的试剂盒，包括：商业化的外泌体沉淀试剂，优选地，ExoQuick-TC，DTT、蛋白抑酶混合剂、分离溶液及磷酸盐缓冲液。

本发明采用基于改进的外泌体沉淀法分离尿液外泌体的方法，可以实现简单快速高效的分离尿液的外泌体，且本发明具有以下优点：

首先，避免了超高速离心机对实验的限制，这在一般的生物实验室及临床病理检验等科室都可以达到。

其次，起始尿液采用较高速的离心去除尿沉渣、细胞、细胞膜碎片、其他残渣及聚集体较大的THP等。这样就避免其他试剂盒逐步分离的繁复操作，通过后续的DTT处理能够获得纯度更高的外泌体，为后续外泌体蛋白及RNA的分析提供了更加有效可靠的基础。

最后，使用还原性的试剂处理底部沉淀，通过转移到较高温度来解聚THP蛋白并释放包裹在其中的外泌体，因此进一步提高了外泌体分离的效率。

附图说明

图1 为通过本发明所述方法分离外泌体的流程图。

图2 为分别通过超速离心、通过标准ExoQuick-TC方法和通过本发明所述方法进行外泌体分离后NanoSight NS300的检测结果。

图3 为通过Western blot 的方法检测超速离心法、标准ExoQuick-TC方法和本发明所述方法分离得到的外泌体的蛋白标志物Flotillin 1。

图4 为通过qRT-PCR的方法检测超速离心法、标准ExoQuick-TC方法和本发明所述方法分离得到的外泌体中miR-192和miR-200c的相对表达情况。

具体实施方式

以下具体实施例是为了进一步阐述本发明的最佳实施例，而不用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件或制造厂商所建议的条件实施。

实施例1

健康志愿者的晨尿在知情同意的情况下被收集，并在使用前存放于-80℃冰箱。冻存的尿样在冰上完全融化之后，剧烈涡旋振荡90秒。取相同个体的尿样分别采用超高速离心法、ExoQuick-TC常规方法及本发明所提出的方法来进行尿液中外泌体的分离富集。

超高速离心法的具体操作流程为，先将10mL尿样在500×g离心15分钟去除细胞及细胞碎片，上清液被转移到新Ti70离心管（70Ti 转子, Beckman Coulter）中，在4℃条件下17,000×g离心45分钟去除大的囊泡，随后转移上清液到新的管中，4℃条件下200,000×g离心65分钟以沉淀外泌体，最后加入100µL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬外泌体。

ExoQuick-TC常规方法即是按照System Bioscience所提供的产品说明书，按照其建议的条件操作。具体来说，取10mL尿样，3,000×g离心15分钟，转移上清到一个无菌管中，加入2mL ExoQuick-TC外泌体沉淀试剂，吹吸混匀。在4℃条件下过夜孵育后，室温下将混合溶液1,500×g离心30分钟。离心后，在管底可见米黄色或者浅白色沉淀。再在1,500×g离心5分钟去除痕量的液体，晾干沉淀。最后加入100µlL PBS溶液重悬外泌体。

本发明所提示方法的具体操作为：在10ml尿液中加入0.2ml PIC溶液，在37℃条件下，17,000× g 离心10ml尿液/PIC混合溶液10分钟，随后转移上清液SN1到新的管中并留存。在沉淀中加入500µL 分离溶液，涡旋30秒，加入100mg DTT，在37℃条件下孵育样品10分钟，在孵育期间，每隔2分钟涡旋振荡直到沉淀完全溶解。再在溶解液中加入1mL分离溶液，混匀后，在37℃条件下，17,000× g 离心10分钟。将离心后得到的上清SN2与SN1混合，转移到一个无菌管中，测定总体积，每10mL上清液中加入3.3mL ExoQuick-TC外泌体沉淀溶液，来回颠倒混匀后，在4℃条件下过夜孵育混合液。在4℃条件下10,000× g离心混合液30分钟，离心后在管底可见米黄色或浅白色沉淀。再1,500× g 离心5分钟去除痕量的液体，晾干沉淀。最后加入100µL PBS溶液重悬外泌体。

吸取10µL以上三种方法所分离的外泌体通过加入PBS溶液稀释10,000倍以后，取1mL上样，使用NanoSight NS300（马尔文公司）的散射光模式来进行记数。仪器配套的纳米颗粒跟踪分析软件来自动界定样本内小泡的数量及大小范围，并对颗粒大小、相对密度及数量绘制曲线。

结果如图2 所示，图2A 为通过超速离心分离得到的外泌体，图2B 为通过标准ExoQuick-TC方法分离得到的外泌体，图2C为使用本发明的方法分离得到的外泌体。通过直观的方法可以看出，三种方法所分离得到的外泌体在粒径上并无太大差别，但通过本发明所提供的方法能分离出更多的外泌体。

实施例2

利用实施例1 中分离得到的外泌体进行western blot 试验检测外泌体中的标志性蛋白Flotillin 1。

分别取40ul上述三种方法所分离的外泌体溶液，在其中加入等体积的外泌体裂解液，通过移液器上下吹吸混匀样本；随后在冰上孵育30分钟，每隔10分钟颠倒离心管不断混匀样本；在4°C条件下，14,000× g离心10分钟，转移上清液到干净的离心管中，并置于冰上；将蛋白样本稀释200倍后通过BCA法测定λ562nm的吸光度值，通过标准蛋白溶液所绘制的标准曲线而换算其浓度；定量30ug 外泌体总蛋白置于2×SDS 样品上样缓冲液中，100℃同时变性5 分钟，顺序加样到10％的SDS-PAGE 凝胶中，通过10％的SDS-PAGE 分离，采用湿氏电转仪(Bio-Rad) 恒流350mA 冰浴转膜1h20min 转到0.2mm 的PVDF 膜，质量体积比5％脱脂牛奶37℃封闭1 小时，加一抗多克隆抗体anti-Flotillin 1(将原液按照体积比稀释400 倍，原液为购自abcam的多克隆抗体，货号为ab41927) 孵育过夜；加二抗(原液为山羊抗兔IgG-HRP，工作液的浓度是将原液按照体积比稀释10000 倍，购自abcam，货号ab6721)，室温下孵育1 小时，化学发光(SuperSignal West pico Chemilu scent Substrate，34080，Pierce)，根据试剂盒的说明书进行显影、定影，利用上述Western Blotting 方法分别检测超高速离心法、常规ExoQuick-TC法及本发明的技术方法所分离外泌体效果的结果见图3。

实施例3

利用实施例1 中分离得到的外泌体提取其中的miRNA，通过qRT-PCR来检测外泌体中成熟miRNA的相对表达量，以表明不同外泌体分离方法的效果。

分别取40ul上述三种方法所分离的外泌体溶液，在其中加入1ml TRIzol溶液（Invitrogen），用力涡旋振荡后室温静置5分钟，随后加入200ul氯仿溶液，上下振荡离心管至均一状态，室温静置3分钟后在4℃条件下12000rpm高速离心15min。吸取上层水相到新的离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，充分颠倒混匀后，再在-20℃条件下静置2个小时以上。4℃条件下，12000rpm高速离心15min 后小心弃掉上清液，加入1ml 预冷的75％乙醇洗涤沉淀，再在4℃下7500rpm离心5min，弃去液体，室温下放置5min 以充分晾干沉淀，最后5ul加入不含RNase的无菌水溶解沉淀。使用Agilent Bioanalyer 2100及Small RNA chip（安捷伦公司）测量小RNA 纯度及浓度。10ng的总RNA与含有特定的miRNA引物的TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)试剂混合，然后按照厂商的操作指示来完成反转录。实时荧光定量PCR在ABI Stepone Plus定量PCR仪(Applied Biosystems)上进行，使用商业化的Assay-on-Demand(Applied Biosystems)用于每个miRNA的研究。通过RNU6B的表达来进行内参。每一组都进行三次重复。不同方法所分离的外泌体内miRNA相对表达量如图4所示。

本发明为简单快速高效分离尿液中的外泌体提供了有效工具。结果证明该方法能够提高尿液中外泌体分离的效率，能够满足后续外泌体蛋白及RNA分子的研究。该发明对尿液外泌体RNA作为分子标志物提供了理论基础，结合不同的疾病及治疗方案，可以进一步筛选疾病（如癌症等）和药物使用中用于病程监控的生物标志物。

Claims (9)

1.一种分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，包括步骤：

S1、收集尿液，离心，保留上清液（SN1）；

S2、使用二硫苏糖醇（DTT）处理底部沉淀；

S3、处理后的混合液经离心获得上清（SN2），与第一次得到的上清SN1混合；

S4、将特定体积的商业化外泌体沉淀试剂加入到总的上清液中（SN1+SN2），混匀后在4℃孵育至少12个小时；

S5、将上清与外泌体沉淀试剂混合液离心，在管底得到可见的外泌体沉淀；

S6、加入磷酸盐缓冲液重悬外泌体沉淀。

2.根据权利要求1 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S1包括：

1) 收集尿液的过程中需要加入蛋白抑酶混合剂（Protease Inhibitor Cocktail）；

2）在37℃条件下，17,000 × g 离心尿液10分钟。

3.根据权利要求1所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

1）使用DTT处理底部沉淀时需要加入分离溶液；

2）使用DTT处理底部沉淀的终浓度为200mg/mL；

3）使用DTT处理底部沉淀时需要在37℃条件下孵育10分钟。

4.根据权利要求3 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述分离溶液的组分为：250mM蔗糖，10mM三乙醇胺，一个PIC药片（罗氏），pH值为7.6。

5.根据权利要求1 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S3的离心条件为在37℃条件下，17,000 × g 离心10分钟。

6.根据权利要求1 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S4包括：

1）商业化外泌体沉淀试剂优选为，ExoQuick-TC；

2）加入ExoQuick的优选条件为每10mL上清液中加入3.3mL。

7.根据权利要求1 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S5的离心条件为在4℃条件下10,000 × g离心30分钟。

8.根据权利要求1 所述的分离尿液中外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S6中磷酸盐缓冲液的组分为：140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、1.8mM KH₂PO₄，pH 值为7.4 。

9.一种分离尿液中外泌体的试剂盒，其特征在于，包括：商业化的外泌体沉淀试剂，优选地，ExoQuick-TC，DTT、蛋白抑酶混合剂、分离溶液及磷酸盐缓冲液。