CN105925564B - 提取植物基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于提取高完整度植物基因组DNA的方法。所述方法将植物组织在固定液中进行固定，用刀切成小段放置于细胞核分离液中用匀浆器搅拌，随后离心将大部分杂质与细胞核分离，并用percoll细胞分离混合溶液进一步进行核层分离，并最终将细胞核包埋于低熔点琼脂糖凝胶中，最后在胶块中进行蛋白、RNA等物质的去除。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体的，涉及一种提取植物基因组DNA的方法。
背景技术
近些年二代和三代测序技术实现了突飞猛进的发展速度，极大的推动了人类对于植物基因组学的认识，而获得完整性高、纯净度好的基因组DNA是获得真实、准确的基因组信息的前提和关键。目前常用的植物组织高分子量DNA提取方法包括Zhang等人和Peterson等人开发的方法，这些方法的缺陷在于提取的高分子量DNA成功率低、多糖等杂质含量高，其主要有以下原因：首先是这些方法破碎组织的方式均为冷冻研磨，该方法稍有不慎，如研磨时间增长或者研磨力度过大，都会使核膜破裂导致未受到保护的DNA断裂，其次是这些方法均使用离心-弃上清-重悬这样的步骤进行细胞核洗涤，从而去除细胞碎片、蛋白质、多糖多酚等物质，但是该方法单一，无法有效去除杂质，而且每次洗涤都会损失大量细胞核。另外，这些方法使用的核分离液HB溶液中有大量的蔗糖，在保护DNA的同时也更容易引入多糖污染。上述这些弊端均会不同程度地破坏DNA的完整性，导致其在二代和三代测序技术中造成文库构建失败或信息分析异常。
因此有必要开发一种能够完整的提取植物基因组DNA的方法，为进一步推动植物基因组的研究和利用提供有效手段。
发明内容
本发明的目的在于解决现有的植物基因组提取方法中存在的缺陷，提供一种新的完整提取植物基因组的方法。
本发明提供了一种提取高分子量植物基因组DNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(一)将固定后植物组织与核分离液混合后利用匀浆器在30000-35000rpm的速度下匀浆处理30-40秒获得匀浆混合物，用孔径为80-100μm的滤膜过滤所述匀浆混合物，收集滤液并在2000g-2500g下离心15-25min，收集沉淀；
(二)用核分离液重悬步骤(一)获得的沉淀，而后加入Triton X-100至Triton X-100终浓度为10-15体积％，获得重悬混合物，用孔径为20-40μm的滤膜过滤，将滤液部分加到percoll细胞分离混合溶液上方，600g-650g离心30-50min后将中间层及紧挨着中间层下方的1-2ml液体一起吸出，获得核液；
(三)用核分离液重悬所述核液后离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，将沉淀用核分离液重悬并在43-45℃水浴3.5-4.5min后与琼脂糖液混匀制胶块；
其中，所述percoll细胞分离混合溶液的组成成分包括20-30体积％的核分离液和70-80体积％的percoll细胞分离液。
其中，所述核分离液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-25mM EDTA，100mM-150mM氯化钾，10mM-20mM NaCl，0.5mM-1.5mM精胺，0.5mM-1.5mM亚精胺，0.25-0.5体积％TritonX-100，2.5-7.5体积％M2-巯基乙醇和8-10％(w/v)PVP10(聚乙烯吡咯烷酮)。
其中，所述Percoll细胞分离液是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone，PVP)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。
在本发明的一种优选的实施方式中，percoll细胞分离混合溶液可以为购自Pharmacia公司的商品名为Percoll的产品。
优选的，步骤(二)中相对于每毫升的所述滤液部分，percoll细胞分离混合溶液的用量为1-1.5ml。
在匀浆处理过程中，每匀浆12-15秒后在冰水中静置冷却30-40秒。
其中，步骤(一)中将固定后植物组织与核分离液按照1：8-12的质量体积比混合。
优选的，步骤(一)还包括，用清洗液清洗新鲜植物组织表面的杂质后用固定液接触固定获得固定后植物组织；所述清洗液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-30mM EDTA和100mM-150mM NaCl；所述固定液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-30mM EDTA，100mM-150mM NaCl和终体积百分含量为2％的甲醛。
其中，清洗和固定的步骤包括：将新鲜植物组织按照1：10-15的质量体积比与所述清洗液接触，清洗植物组织表面的杂质5-10分钟，去除清洗液后将清洗后的植物组织按照1：20-25的质量体积比与固定液接触，去除容器中的气泡，在冰上固定20-25min后去除固定液，用清洗液在0-4℃下洗涤植物组织后获得固定后植物组织。
优选的，步骤(一)还包括先将所述固定后植物组织切成尺寸为2×2-3×3mm的小碎片后再与核分离液混合。
其中，在步骤(二)中，利用5-8倍体积的核分离液(体积相当于沉淀体积的5-8倍的核分离液)重悬步骤(一)获得的沉淀。
在步骤(二)中，轻柔的将所述滤液部分加在percoll细胞分离混合溶液上方，利用冷冻离心机进行离心，离心后吸取中间层，以及位于中间层下方的紧挨中间层部分的1-2ml液体，作为核液。
优选的，在步骤(三)中，利用5-8倍体积的核分离液(体积相当于核液体积的5-8倍的核分离液)重悬核液，而后离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，该步骤优选可以重复2-4遍，具体可以按照以下步骤进行：加入沉淀5-8倍体积的核分离液重悬沉淀，并在4℃下2500g离心8-12min，可以重复此步骤2-4遍。
在离心去除percoll细胞分离混合液并回收沉淀后，再利用5-8倍体积的核分离液重悬。
步骤(三)中制胶块所使用的琼脂糖液为1-2％低熔点琼脂糖液，优选为2％低熔点琼脂糖液。
可选的，所述方法还包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液对胶块进行孵育，再用EDTA溶液和TE溶液对胶块进行清洗获得清洗后胶块，用溶胶酶溶解胶块后透析获得植物基因组DNA。
其中，所述蛋白酶K溶液的组成成分包括：0.8-1.5mg/ml蛋白酶K、0.5-1％(v/v)M2-巯基乙醇，蛋白酶K缓冲液，所述蛋白酶K缓冲液可以为上海远慕生物科技有限公司货号为#YM-S2049的产品。
可选的，所述方法包括：
(四)48-52℃下用相对于胶块5-25倍体积的蛋白酶k溶液浸没胶块孵育12-24小时后在15-25℃下静置4-6分钟，静置结束后去除液体组分，用5-25倍体积的蛋白酶K溶液孵育1.5-2.5h，15-25℃下静置4-6分钟获得蛋白酶k孵育后胶块。
具体的，在步骤(四)中，加入蛋白酶k溶液后，可以每10分钟以450rpm-500rpm转10-15秒获得蛋白酶k.孵育后物料。
(五)将所述蛋白酶k孵育后胶块在RNA酶溶液中孵育去除RNA获得RNA酶孵育后胶块。
具体的，RNA酶孵育的步骤可以包括：将所述蛋白酶K孵育后胶块与RNA酶溶液接触，在37℃孵育1小时，其中每10分钟450rpm-500rpm转10-15秒获得RNA酶孵育后物料。
可选的，所述方法还包括：
(六)在所述RNA酶孵育后胶块中加入50mM的EDTA，晃动10秒后弃液体，该步骤重复2-3遍，再加入50mM EDTA，室温下在水平摇床上180rpm转速转动15分钟后弃液体，该步骤重复3-4遍；加入TE缓冲液，并且室温下在水平摇床上180rpm转速转动15分钟然后弃液体，该步骤重复4-5遍。
(七)吸干胶块表面水分后将胶块在70℃保温使胶块完全溶解后在43℃保温5分钟，加入溶胶酶混匀后在43℃孵育45分钟，5000rpm离心1秒后将混合液于4℃保存。
(八)准备培养皿，加入TE缓冲液，用镊子将0.1μm的透析膜飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10分钟，吸取DNA混合液混匀，滴在膜的中心，盖上培养皿的盖子，室温放置2-2.5小时，从膜中心吸取剩余DNA，5000rpm瞬时离心后于4℃保存。
本发明所提供的方法可以用于各类型植物的新鲜幼嫩苗及叶片，以及幼嫩根尖部位的高分子量DNA提取。
本发明所提供的方法首先利用清洗液对植物组织进行漂洗处理，并结合固定液对植物组织进行固定保护，利用匀浆器对植物组织进行破碎，同时利用percoll细胞分离混合溶液将核层与杂质分开。最后将分离的细胞核与溶胶混合，蛋白消化、洗脱等过程均在胶块中完成。该方法对植物起始量要求少，而且流程操作简单，操作时长短，而且匀浆方法相对于研磨法来说更容易控制匀浆程度，实验的可重复性强，大幅提高了所提基因组DNA的完整度。
附图说明
图1为本发明实施例1所提取的水稻基因组DNA进行0.75％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测的结果。泳道1为Lambda DNA/HindIII Marker；泳道2为0.5个水稻细胞核包埋胶块。
图2为本发明对比例1所提取的水稻基因组DNA进行0.75％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测的结果。泳道1为Lambda DNA/HindIII Marker；泳道3为0.5个水稻细胞核包埋胶块，第2泳道和第4泳道未上样。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
第一天：
1：将新鲜水稻叶片2.5g展平擦干，用刀片去除叶柄及主叶脉。转移至50ml离心管中。加入25ml清洗液，将叶片上的杂物和土壤洗掉，倒出液体。
清洗液的组分：10mM Tris-HCL，20mM EDTA和150mM NaCl。
2：加入60ml固定液完全淹没组织样。搅拌或者敲击瓶子去除掉里面的气泡放在冰上固定20min。
固定液的组分：10mM Tris-HCL，20mM EDTA，150mM NaCl和终体积百分含量为2％的甲醛。
3：倒掉固定液，加入60ml清洗液，震荡瓶身尽量减少瓶子里的气泡。冰上放置5min后倒掉，重复三次。
4：将瓶子里的叶片取出擦干，放置于冰镇的干净平皿中。在叶片上滴2-4ml核分离液，使叶片微湿。
核分离液的组分：10mM Tris-HCL，20mM EDTA，150mM氯化钾，10mM NaCl，0.5mM精胺，0.5mM亚精胺，0.25％(v/v)TritonX-100，2.5％(v/v)M2-巯基乙醇和8％(w/v)PVP10。
5:用刀片切碎叶片至2×2mm小片，收集至50ml离心管中。
6:加入25ml核分离液，将手持匀浆器(QIAGEN，#9001272)竖直插入到液面以下。
7：用35000rpm的速度搅拌15秒。将离心管放在冰上冰镇30秒，并轻柔摇晃避免局部过热。然后再用该速度搅拌15秒，搅拌结束后立即放在冰上。
8：将混合液用100μm孔径的滤膜过滤至新的50ml离心管中。
9：4℃下2500g离心力离心20min(升速＝9，降速＝9)。
10：弃掉上清液，加入1ml核分离液重悬沉淀。随后再加入3.5ml的核分离液，500μl的10％(v/v)的Triton X-100溶液，手摇30秒。
11：用40μm孔径的滤膜过滤，将滤液部分转移至新的50ml离心管中。
12：轻柔将11步中的滤液部分加在5ml percoll细胞分离混合溶液的上面。冷冻离心机650g离心30min-50min(升速＝9，降速＝1)。
percoll细胞分离混合溶液的组成成分为2.5ml核分离液和7.5ml的percoll细胞分离液。
percoll细胞分离液购自Pharmacia公司，商品名为Percoll。
13：将中间的核层及核层下方2ml液体吸出至15ml离心管中。
14：加入3ml核分离液，轻柔上下颠倒5-10次彻底混匀。4℃下650g离心30min，(升速＝9，降速＝9)弃掉上清，加入10ml核分离液重悬沉淀，并在4℃下2500g离心10min，(升速＝9，降速＝9)，重复此步骤2遍，彻底洗掉percoll离心混合溶液。
15：弃掉上清，留下200μl的液体。用宽口的枪头重悬核沉淀，并将其转移至1.5ml的离心管中，4℃下5000rpm离心5min。
16：完全弃掉上清，用核分离液混匀沉淀至186μl，放至43℃水浴中4min，与114μl的2％低熔点琼脂糖液混匀，并分别吸取90μl放置在凝胶模具中。
17：将含有胶液的模具水平放入4℃冰箱20min，使胶块彻底凝固。
18：50℃下每个50ml康宁管中加入2.5ml蛋白酶k溶液(2.5ml蛋白酶k缓冲液(上海远慕生物科技有限公司，#YM-S2049)，1％(v/v)M2-巯基乙醇，1mg/ml蛋白酶K)，每个管放置3个胶块。
第二天：
1：过夜(12h)之后将离心管拿出，室温下平衡5min。倒掉旧蛋白酶k，让胶块回到底部。
2：加入新的约2.7ml的蛋白酶k溶液。确保所有的胶块都在溶液里，2h之后将离心管拿出，室温下静置5min去除液体组分。
3：加入50μl RNA酶，37℃孵育1小时。
4：将上述RNA酶溶液倒掉，加入10ml 50mM EDTA，室温下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动15分钟，然后倒掉。重复此步骤7遍。
5：倒掉最后一遍的EDTA溶液，加入10ml TE缓冲液。并且室温下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动15分钟然后倒掉。重复该步骤5遍。
6：倒掉最后一遍的TE缓冲液，用钝边的勺子或者铲子捞出胶块，微微倾斜铲子，用洁净的吸水纸吸干水分。将胶块放入到1.7ml离心管中，一个管一个胶块。
7：5000rpm离心1秒，使胶块到离心管管底。
8：将离心管放到70℃的金属浴中2分钟，使胶块完全溶解。
9：迅速将离心管放入43℃金属浴中5分钟
10：每个管中加入2μl溶胶酶，用枪头旋转混匀10秒。
11：将混合液在43℃孵育45分钟。
12：5000rpm离心1秒，立即将混合液放入到4度冰箱。
13：准备培养皿，加入15ml TE缓冲液。
14：用镊子将0.1μm的透析膜飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10分钟。
15：用宽口的枪头吸取DNA混合液混匀，滴在膜的中心，盖上培养皿的盖子，室温放置2.5小时。
16：用宽口枪头从膜中心吸取剩余DNA，转移至新的离心管中。4℃保存。
通过以上步骤提取的DNA，经Nanodrop检测：260/280＝1.81，260/230＝2.19。
利用提取的水稻基因组DNA进行0.75％琼脂糖凝胶脉冲场电泳检测结果(如图1所示)。泳道1为Lambda DNA/HindIII Marker；泳道2为0.5个水稻细胞核包埋胶块。
对比例1
首先取水稻嫩叶2.85g，在液氮中粗磨后立即转入30ml预冷的1×HB(成分为0.01MTris，0.08M KCl，0.01M EDTA，1m M精胺，1m M亚精胺，0.5M蔗糖)，使用前加入0.15％(V/V)M2-巯基乙醇溶液，冰上搅拌10分钟。将混合液用四层纱布和两层神奇滤布过滤，并离心20min，条件为4℃，1800g。将沉淀直接用1×HB悬浮，用四层神奇滤布过滤，离心20min，条件为4℃，1800g。将沉淀直接用1×HB悬浮。之后从上述第一天16步后相同于实施例1。
通过以上方法提取的DNA，经Nanodrop检测：260/280＝1.51，260/230＝1.38。Nanodrop检验结果显示，该方法提取的DNA中多糖多酚类及蛋白类物质残余量高，电泳图上有明显降解现象(如图2所示)，难以区分主带，这是降解和杂质共同作用的结果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (13)
1.一种提取高分子植物基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)将固定后植物组织与核分离液混合后利用匀浆器在30000-35000rpm的速度下匀浆处理30-40秒获得匀浆混合物，用孔径为80-100μm的滤膜过滤所述匀浆混合物，收集滤液并在2000g-2500g下离心15-25min，收集沉淀；
(二)用核分离液重悬步骤(一)获得的沉淀，而后加入Triton X-100至Triton X-100终浓度为10-15体积％，获得重悬混合物，用孔径为20-40μm的滤膜过滤，将滤液部分加到percoll细胞分离混合溶液上方，600g-650g离心30-50min后将中间层及中间层下方1-2ml液体吸出获得核液；
(三)用核分离液重悬所述核液后离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，将沉淀用核分离液重悬并在43-45℃水浴3.5-4.5min后与琼脂糖液混匀制胶块；
其中，所述percoll细胞分离混合溶液的组成成分包括20-30体积％的核分离液和70-80体积％的percoll细胞分离液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中相对于每毫升的所述滤液部分，percoll细胞分离混合溶液的用量为1-1.5ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(一)中将固定后植物组织与核分离液按照1：8-12的质量体积比混合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述核分离液的组成成分包括：10mM-15mMTris-HCL，10mM-25mM EDTA，100mM-150mM氯化钾，10mM-20mM NaCl，0.5mM-1.5mM精胺，0.5mM-1.5mM亚精胺，0.25-0.5体积％TritonX-100，2.5-7.5体积％M2-巯基乙醇和8-10％聚乙烯吡咯烷酮。
5.根据权利要求1、2和4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(一)包括，用清洗液清洗植物组织表面的杂质后用固定液接触固定获得固定后植物组织；所述清洗液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-30mM EDTA和100mM-150mM NaCl；所述固定液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-30mM EDTA，100mM-150mM NaCl和终体积百分含量为2％的甲醛。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(一)还包括先将所述固定后植物组织切成尺寸为2×2-3×3mm的小碎片后再与核分离液混合。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液对胶块进行孵育，再用EDTA溶液和TE溶液对胶块进行清洗获得清洗后胶块，用溶胶酶溶解胶块后透析获得植物基因组DNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的组成成分包括：0.8-1.5mg/ml蛋白酶K、0.5-1体积％M2-巯基乙醇，蛋白酶K缓冲液。
9.根据权利要求1、2、6-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(四)48-52℃下用5-25倍体积的蛋白酶k溶液浸没胶块孵育12-24小时后在15-25℃下静置4-6分钟，静置结束后去除液体组分，用5-25倍体积的蛋白酶K溶液孵育1.5-2.5h，15-25℃下静置4-6分钟获得蛋白酶k孵育后胶块；
(五)将所述蛋白酶k孵育后胶块在RNA酶溶液中孵育去除RNA获得RNA酶孵育后胶块。
10.根据权利要求1、2、4、6、7或8中任意一项所述的方法，所述植物组织为植物新鲜幼嫩苗、叶片或幼嫩根尖部位。
11.根据权利要求3所述的方法，所述植物组织为植物新鲜幼嫩苗、叶片或幼嫩根尖部位。
12.根据权利要求5所述的方法，所述植物组织为植物新鲜幼嫩苗、叶片或幼嫩根尖部位。
13.根据权利要求9所述的方法，所述植物组织为植物新鲜幼嫩苗、叶片或幼嫩根尖部位。
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- 2016-05-17 CN CN201610325854.6A patent/CN105925564B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105018463A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-11-04 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种用于次生代谢物含量高的植物组织的dna提取方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105925564A (zh) | 2016-09-07 |
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| GR01 | Patent grant |