JP2010523094A - 生体分子の精製方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、以下の工程；ａ）この工程の前又は後で、生体分子を含有する試料からの溶液又は懸濁液を反応容器で調製する又は反応容器にそれを詰める、結合マトリクスを有する反応容器を遠心機にて配置することと、ｂ）第１の加速度値での少なくとも１回の第１の遠心工程及び第１の加速度値よりも高い第２の加速度値での少なくとも１回の第２の遠心工程を含む少なくとも１回の多段式遠心工程を組み入れることと、その際、ｃ）工程ｂ）は結合工程、洗浄工程及び／又は溶出工程であってもよいこととを含む、試料から生体分子を精製する方法に関する。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体分子、特にＤＮＡ分子やＲＮＡ分子のような核酸の精製方法に関する。

生物試料に由来する生体分子の精製及び分析は、基礎的な生物医学研究、臨床研究及び臨床診断、法医学分析、集団遺伝学の調査、疫学分析並びにこれらに関連する専門分野において果たす役割が高まっている。これは、特にＤＮＡ分子やＲＮＡ分子のような核酸に適用されるが、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質にも適用される。

生物学はこの２０年間、このために包括的な一連の分子生物学的手段が進展させてきた。従って、たとえば、医学的及び臨床的な診断、法医学、薬剤の開発と評価における製薬学、食物の分析及び食品のモニタリング、作物及び家畜の育成における農学、並びに環境分析並びに研究の多くの分野において今後、分子生物学解析の一層さらに広範な使用が期待されるべきである。

トランスクリプトーム、すなわち、細胞中のｍＲＮＡの解析によって、遺伝子の活性を直接決定することができる。たとえば、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）又は遺伝子発現のチップ解析のような現代的な分子生物学の方法による細胞における転写物パターン（ｍＲＮＡパターン）の定量的解析によって、たとえば、不完全に発現された遺伝子を検出することができ、その結果、たとえば、代謝性疾患や感染、又は癌性疾患に向かう素因を検出することができる。

分子生物学的方法、たとえば、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＲＦＬＰ，ＡＦＬＰ又は配列決定によるゲノム、すなわち、細胞のＤＮＡ全体の解析によって、たとえば、遺伝的欠損を検出することができ、又はＨＬＡの型及びそのほかの遺伝的マーカーを決定することができる。法医学的な、集団遺伝学の又は食物の法定分析のためのＤＮＡフィンガープリント法は、さらにこの総称に該当する。ゲノムのＤＮＡ及びＲＮＡの解析も、たとえば、ウイルス、細菌などの感染性病原体を直接検出するのに用いられる。

そのほかの生体分子、たとえば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質の解析は、たとえば、特定の生理的状態、食物における混入、特定の栄養素の含量などに関する情報を提供することができる。

しかしながら、これらのアプローチすべての前提条件は、試料に含有される生体分子、特に核酸が、その後、付随する記載された方法の１つに供されることができるように単離され、精製されていることである。

検出されるべき生体分子は非常に低い濃度でしか存在しないことが多いので、試料に含有される生体分子の効率的で且つ高収率の精製が決定的に重要である。

生物試料から生体分子を精製する方法は多数ある。ここでは遠心工程を使用することが多く、その背景において、結合マトリクスを含有する遠心管に溶解された試料が導入される。遠心の間、溶液はマトリクスを介して運ばれ、精製されるべき生体分子は結合した形態でマトリクス上に残存する。手順のそれに続く進行の間、それらはマトリクスから溶出され、回収される。

この方式に従う核酸の精製方法は、たとえば、特許文献１で開示されたいわゆる「ブーム方式」の方法である。

これにおいて、カオトロピック塩の存在下、珪酸塩マトリクスを伴う容器に、核酸を含有する試料が導入される。次いで容器は遠心され、又は真空が適用される。これによって核酸を珪酸塩マトリクスに結合させる一方で、試料のそのほかの構成物質すべて（特に細胞残屑、細胞小器官、タンパク質など）は珪酸塩マトリクスを通過し、廃棄される。次いで結合した核酸を好適な作用物質によって溶出し、さらなる解析に供する。

結合に関連するメカニズムは、たとえば、非特許文献１に記載されている。

この方法には、いわゆる「スピンカラム」が使用されることが多い。これらは、円盤様の珪酸塩マトリクスを含有する微量反応用の容器であり、底が開放されており、底が閉鎖されたさらなる微量反応用の容器の中に配置される。核酸を含有する試料をカオトロピック塩と共にピペットで微量反応用の容器に入れる。次いで２本の微量反応用の容器の組み合わせを遠心機に導入し、約１００００×ｇの加速度値で遠心する。この手順の間、核酸が珪酸塩マトリクスに結合する一方で、試料のそのほかの構成物質はすべて珪酸塩マトリクスを通過し、底が閉鎖された第２の微量反応用の容器に移される。次いで後者は廃棄されるが、結合した核酸は好適な作用物質によって溶出され、さらなる解析に供される。

そのような及び類似の製品は、とりわけ本発明の出願者から入手可能であるが、たとえば、プロメガ、アンビオン、マシュレ、ネーゲル及びインビトロゲンのような競争業者からも入手可能である。

生体分子の精製に関するそのような方法の重要な特徴は、多くの場合、達成される収量が不適当であるということである。特にこれらは、試料中の生体分子の量が非常に少ないので従来の精製方法による収量がその後検出されるべき分子について十分ではない場合である。そのような試料は、たとえば、弱く発現された遺伝子のＲＮＡが解析されるべきである法医学の試料（単数）又は試料（複数）である。

欧州特許第３８９０６３号

Ｍｅｌｚａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６），過塩素酸塩溶液におけるシリカへのＤＮＡの吸着のための推進力、コロイドおよび界面化学雑誌(Jｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ) １８１ （２）， ６３５−６４４

本発明は、従来技術から生じる記載された不都合を克服する目的に基づく。特に、本発明の目的は、不利な状況下の試料から生体分子、特に核酸を精製することができ、その後の解析に利用することができるように達成される生体分子の収量を高めるように言及された方法を改善することである。

提出された主クレームの特徴によって本目的は達成される。サブクレームは、好ましい実施態様を記載する。ここでは、述べられる所与の範囲は常に特定の限定値を含むように理解されるべきであることに留意すべきである。

従って、以下の工程を含む、試料からの生体分子の精製方法を提供することが考えられる。
ａ）結合マトリクスを伴った反応容器の遠心機への配置、但し、生体分子を含有する試料の溶液又は懸濁液は、この工程の前又は後で、反応容器で調製される又は反応容器に導入される；及び
ｂ）第１の加速度値での少なくとも第１の遠心工程と第１の加速度値より高い第２の加速度値での少なくとも第２の遠心工程を含む少なくとも１回の多段式遠心工程の包含；
但し、
ｃ）工程ｂ）は、結合工程、洗浄工程及び／又は溶出工程であることができる。

好ましくは、多段式の工程ｂ）は結合工程であり、遠心によって生体分子が結合マトリクスに結合する。実施例で実証されるように、この場合生体分子の相当に改善された収量が達成される。しかしながら、この工程は同様に好ましくは洗浄工程であることができる。

さらに、第１の遠心工程の前、第１と第２の遠心工程の間、又は第２の遠心工程の後に、任意でさらなる遠心工程を含めることを考えることができる。

さらに好ましい実施態様では、方法が、少なくとも任意の多段式の遠心工程を常に含む、少なくとも結合工程、洗浄工程及び溶出工程を含むことがさらに考えられる。

特に好ましくは、生体分子は、核酸、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質を含有する群から選択される物質であることが考えられる。

下記では、用語「核酸」は、特にＲＮＡ及びＤＮＡを意味するように理解されるべきである。プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡは特にここではＤＮＡとして考えられる一方で、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ及び全ＲＮＡは特にＲＮＡとして考えられる。

原則として、ここで導入される核酸は、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ−グリコシド又はＣ−グリコシドであるポリヌクレオチドのいずれの種類であることもできる。核酸は、一本鎖、二本鎖又は複数鎖、直鎖、分枝鎖又は環状鎖であることができる。

それは、細胞に存在する分子、たとえば、ゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相当することができ、又は、たとえば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）又は合成核酸のように試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で製造することができる。核酸は、数個のヌクレオチド又は数千個のヌクレオチドから構成されることができる。

下記では、用語「結合マトリクスを伴う反応容器」は、選択的に決定された物質と会合する結合マトリクスが反応容器又は小型化カラムの中に配置される生化学的分離方式を意味するように理解されるべきである。

下記では、用語「加速度値」は、遠心機の回転速度によって達成され、遠心される物品に作用する重力加速度の倍数を示す。これは、パラメータｇ＝９．８１ｍｓ^-2によって測定される。１０００×ｇは、たとえば、重力加速度の１０００倍である加速度値を示す。加速度値はまた、「遠心指標」とも呼ばれるが、一般に１分間当たりの回転数（ｒｐｍ）で示される遠心機の回転速度には相当しない。加速度値は、遠心機のドラムの直径（有効な直径）と回転速度によって推定的に決定される。

下記では、用語「遠心工程」は、定義できる持続時間と定義できる加速度値によって区別される方法工程を意味するように理解される。

この結合マトリクスは好ましくは、アニオン交換体、珪酸塩基材、プラスチックの基材又はキトサン含有の基材を含む。

下記では、用語「珪酸塩基材」は、大きな内部表面積を有し、溶液に含有される構成物質がマトリクスの構成物質と接触するように真空を適用する間、又は遠心の間、反応容器に導入された溶液が膜、沈殿物、充填物又は円盤を通って行くように、反応容器に配置される多孔性珪酸塩の膜、沈殿物、充填物又は円盤を意味するように理解されるべきである。珪酸塩基材は好ましくはシリカゲルのマトリクスである。珪酸塩基材は同様に型押しガラス繊維又はガラスビーズ（「マイクロビーズ」）から構成することができる。たとえば、商標名ＱＩＡプレップ及びＲＮｅａｓｙのもとで本出願者によって市場に出された精製キットにおいて珪酸塩基材が使用される。

アニオン交換体は従来技術から十分に知られている。核酸の主鎖の負に荷電したリン酸ラジカルと相互作用する樹脂が一般にここで使用される。使用される緩衝液の塩濃度及びｐＨ値は、核酸が樹脂に結合するか、又はカラムから溶出されるかどうかを決定する。

そのようなアニオン交換体は、たとえば、キアゲン、ゲノムチップ及びプラスミドチップの商標名で本出願者によって市場に出されている。

キトサンは、生体分子の結合剤として最近になって議論されている。これは、β−１，４−グリコシド結合Ｎ−アセチルグルコサミンラジカルとグルコサミンラジカルのコポリマーである。生理的条件下で、キトサンは、正の正味電荷を持つので、負に荷電した多数の生体分子、特に核酸、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、脂肪及び脂肪酸を結合することが可能である。

本発明によれば、さらに特に好ましくは、結合マトリクスが珪酸塩基材を含み、さらに生体分子を含有する試料が遠心の前に少なくとも１種のカオトロピック塩と混合されることが考えられる。実施態様は特に核酸に好適である。この背景において使用される分離方式は、すでに議論された「ブーム方式」の方法に基づく。これにおいて、カオトロピック塩の存在下で、珪酸塩マトリクスを伴った容器に、核酸を含有する試料が導入される。次いで容器が遠心される又は容器に真空が適用される。これによって核酸が珪酸塩マトリクスに結合する一方で、試料のそのほかの構成物質すべて（特に細胞残屑、細胞小器官、タンパク質など）は珪酸塩マトリクスを通過し、廃棄される。次いで結合した核酸を好適な作用物質によって溶出し、さらなる解析に供する。

好ましくは、この実施態様では以下の工程が考えられる。
ａ）珪酸塩基材を含む結合マトリクスを伴ったカラム様の反応容器の遠心機への配置、但し、核酸を含有する試料と少なくとも１種のカオトロピック塩の溶液又は懸濁液は、この工程の前又は後で、この反応容器で調製され、又はこの反応容器に導入される；
ｂ）第１の加速度値での第１の遠心工程の包含；
ｃ）第１の加速度値よりも高い第２の加速度値での第２の遠心工程の包含；
ｄ）工程ｃ）と工程ｄ）の間又は工程ｄ）の後でのさらなる遠心工程の任意の包含；
ｅ）１以上の洗浄工程の任意の包含；
ｆ）珪酸塩基材に結合した核酸の溶出溶液による溶出。

この実施態様では、多段式の遠心工程は、核酸が珪酸塩マトリクスに結合する結合工程である。この実施態様は、珪酸塩マトリクスを含有する「スピンカラム」による従来技術から知られる１工程法に比べて、精製されるべき核酸の相当に改善された収量をもたらす。しかしながら、或いは、又はこれに加えて、上記プロトコールの下で数工程として洗浄工程及び／又は溶出工程が計画されることも考えられる。

洗浄の工程（単数）又は工程（複数）は、洗浄緩衝液と共に行われる。これは特にエタノール及び／又はアセトンを含有する。

結合マトリクスに結合した生体分子、特に核酸の溶出のための溶出溶液は、たとえば、水（蒸留水を含む）又は低モル溶液であることができる。ここでは、低濃度の塩化ナトリウム溶液が、たとえば可能である。

カオトロピック塩は好ましくはすでに溶液中にある。或いは核酸を含有する試料が溶液又は懸濁液の中にあることができ、カオトロピック塩を次いで加えることができる。或いは、今度は、試料とカオトロピック塩が固形物として存在することができ、一緒に溶液又は懸濁液にすることができる。

下記では、用語「カラム様の反応容器」は、上端部が任意で閉鎖可能であり、底部が任意で開放している容器を意味するように理解されるべきである。反応容器は上述した珪酸塩マトリクスを含有する。上記の意味での反応容器の典型例は、本出願者によって製造され、市場に出されているような、いわゆる「スピンカラム」である。反応容器は、たとえば、エッペンドルフによって市場に出されたもののような市販の幾分大きい反応容器に正確にはめ込むように配置することができるように好ましくは構成される。この場合、大きい方の反応容器は、結合マトリクスを通過する液体のための回収容器として役立つ。

言及される本発明に係る方法は、低い加速度値での遠心工程と高い加速度値での遠心工程の初めての組み合わせによって生体分子精製における収量を、本出願者による研究が示しているように（実施例を参照）２０％まで高める。この手段によって分析的検討は相当に促進され、多くの場合、最初でさえ可能であるが；たとえば、試料中の核酸の量が非常に少ないので従来の精製方法による収量が、増幅されるべき及び／又は検出されるべき核酸について十分ではない場合がある。

言及される収量に対する改善は驚くべきであり、当業者によって予期し得るものではなかった。今日までの「カラムスピン」法が常に単一の加速度値で行われているという事実から見て、２工程遠心法は、表面的に考えると１工程遠心法よりも時間がかかるので、非常に好ましくないように思われる。

本発明に係る方法は、たとえば、研究用器具エッペンドルフの製造者によって製造されるような、生命科学の研究操作に存在するような、市販の手動操作可能な卓上遠心機にて行うことができる。この場合、遠心のプロトコールは、異なった加速度値での少なくとも２回の遠心工程と共に「手動」で完成される、すなわち、異なった遠心工程を含めるのにユーザーの介入が必要である。

言うまでもなく好ましくは、本発明に係る方法は、自動化された及び／又はプログラム可能な遠心機において行われることが考えられる。ここでは特に、異なった加速度値での少なくとも２回の遠心工程を伴った、内部に保存された１以上の遠心プロトコールを遠心機がすでに有することを考えることができる。そのような遠心機は明らかに、本発明の保護の範囲に該当する。

生物試料は、特に好ましくは、試料材料、血漿、体液、血液、血清、細胞、白血球分画、外皮催炎物質、唾液、尿、精子、糞便、法医学試料、塗沫標本、穿刺試料、生検、組織試料、組織の一部及び臓器、食物試料、環境試料、植物及び植物の一部、細菌、ウイルス、ウイロイド、プリオン、酵母及び真菌、及び前述の材料の断片又は構成物質、及び／又は単離された、合成された又は修飾されたタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、代謝産物及び／又は代謝体を含有する群から選択される材料である。

この背景において、生物試料における又は生物試料に由来する核酸のその後の解析については、当業者に既知であり、好適であると思われる解析方法すべてを採用することができ、好ましくは、光学顕微鏡、電子顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡、レーザー顕微解剖、走査電子顕微鏡、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィ、突然変異解析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、特に二次元ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＦＬＰ解析（制限断片長多型解析）、ＳＡＧＥ解析（遺伝子発現の連続分析）、ＦＰＬＣ解析（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）、質量分光分析、たとえば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ質量分光分析又はＳＥＬＤＩ質量分光分析、マイクロアレイ解析、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ解析、酵素の活性の溶解、ＨＬＡタイピング、配列決定、ＷＧＡ（「ゲノム全体の増幅」）、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ分解酵素保護解析又はプライマー伸長解析を含む群から選択される方法である。

好ましくは、方法は、生体分子を含有する細胞又は組織の溶解のための工程によって先行されることが考えられる。

この溶解工程は、たとえば、物理的溶解又は化学的溶解であることができる。採用される物理的溶解法は、特に超音波の使用、連続的な凍結及び融解（凍結／融解）、回転刃の使用、振動するマイクロビーズの使用、低張ショックの作用、いわゆる「フレンチプレス法」又はいわゆる「細胞爆弾法」である。

可能性のある化学的溶解法は、特に、フェノール、クロロホルム及び／又はイソアミルアルコールの使用である。酵素法も同様にこの用語に該当するので、たとえば、細菌用のリゾチームの使用又は酵母用のβ−グルクロニダーゼ（カタツムリの内臓酵素）の使用である。

特定の形態は、アルカリ溶解である。これは、すでに溶解された細菌からプラスミドＤＮＡを単離するのに特に使用される。細胞抽出物へのＮａＯＨの添加によって、染色体ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ双方の相補的ＤＮＡ鎖間の水素架橋結合が分解し、その立体配座のためにプラスミドＤＮＡは完全に復元することが可能である。個々の調製工程によりバラバラに分解された染色体ＤＮＡは、酢酸カリウムと氷酢酸によるｐＨの中和の後、復元することができず、短い相補的領域でのみＤＮＡ二本鎖が生じ、多数のＤＮＡ一本鎖の非整列接合のために、ＤＮＡの絡まった塊が生じる。中和のために沈殿していたＮａＯＨと共にこれは比較的容易に遠心で除くことができる。この遠心工程で、タンパク質と同様に細胞膜及び細胞膜構成物質は、さらに沈殿物として沈殿する。遠心後、プラスミドＤＮＡは上清にある。

さらに特に好ましくは、本発明に従って使用されるカオトロピック塩は、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化グアニジン、尿、硫酸アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム及びチオシアン酸グアニジンを含有する群から選択される塩又は塩の混合物であることが考えられる。

カオトロピック塩は水に高い親和性を有する塩なので、水和殻を形成する。これらの塩の存在下で、疎水性の側鎖の溶解性が高まるのでタンパク質における疎水性の相互作用が不安定化され、タンパク質は変性する。他方、ＤＮＡやＲＮＡのような核酸は、その安定化に疎水性の相互作用を必要としないので、損なわれることはない。さらに、高濃度のカオトロピック塩のカチオンは、特に珪酸塩マトリクスにおける珪酸塩の表面の負の電荷を満たし、正の正味電荷を生成し、それは、珪酸塩マトリクスへの核酸の結合を相当に強要する。

本方法の第１の遠心工程は、好ましくは、５〜２０００×ｇの間の範囲での加速度値で行う。特に好適な加速度値は、１０×ｇ、２７×ｇ、５０×ｇ、１５０×ｇ、３００×ｇ、５００×ｇ、８００×ｇ、１０００×ｇ及び１５００×ｇである。この遠心工程は、たとえば、５秒〜２０分間の持続時間を有することができる。１０秒〜１０分間の持続時間が特に好ましい。３０秒〜５分間の持続時間が特に好ましい。

本方法の第２の遠心工程は、好ましくは、１００〜２５０００×ｇの間の範囲での加速度値で行う。特に好適な加速度値は、１８０×ｇ、６１０×ｇ、１０００×ｇ、２５００×ｇ、８０００×ｇ、１２０００×ｇ及び／又は１７０００×ｇである。この遠心工程は同様に、たとえば、５秒〜２０分間の持続時間を有することができる。１０秒〜１０分間の持続時間が特に好ましい。３０秒〜５分間の持続時間が特に好ましい。

上記の記載から理解できるように、第１と第２の遠心工程の加速度値の値範囲は重なっている。しかしながら、本発明に従って確実に、第１の遠心工程の加速度値が第２の遠心工程の加速度値を常に下回るようにしなければならない。

さらに好ましくは、反応容器は、「振り子型」の遠心ローターで遠心されることが考えられる。そのようなローターでは、ローターを動かすときなって初めて必要とされる遠心角が定められる。本発明にかかる方法は実際には、固定角のローターを用いた場合、収量で前記改善を有するが、すでにローターに配置された反応容器又は遠心容器に、たとえば、ピペットで又はピペット操作ロボットの助けを借りて物質が導入されるべきであるならば、好ましくは「振り子型」の遠心ローターが採用される。

特に好ましくは、本方法の個々の工程は自動化手順によって進行することが考えられる。これについて、本出願者は、とりわけ、ピペット操作ロボットとプログラム可能な遠心機を組み合わせる彼自身の装置を開発した。そのような自動的化方法の助けを借りて、実験室の処理能力を相当に高めることができ、同時に配置ミスを大幅に回避することができる。双方の因子は、臨床の、法医学の、疫学的な及び集団遺伝学の検討において正確に重要な役割を担う。

試料から生体分子、好ましくは核酸を精製するための方法で使用するための結合マトリクスを含有する反応容器がさらに提供される。そのような反応容器は、たとえば、図３に示される。

試料から生体分子、好ましくは核酸を精製するための方法で使用するための組成物が本発明に従ってさらに提供され、該組成物は、アルカリ剤、フェノール、溶解酵素、イソアミルアルコール、クロロホルム、カオトロピック塩、アルコール、水及び無機又は有機の塩を含有する群から選択される少なくとも１つの構成物質を含む。

この組成物は、たとえば、溶解緩衝液（フェノール、溶解酵素、イソアミルアルコール、クロロホルム）、結合緩衝液（カオトロピック塩）、洗浄緩衝液（アルコール、無機又は有機の塩）又は溶出緩衝液（無機又は有機の塩）であることができる。

本発明によれば、少なくとも１つのそのような組成物を含む要素のキットがさらに提供される。特に好ましくは、このキットは、上述のような少なくとも反応容器と、さらに生物試料における若しくはそれに由来する生体分子の分析のための、又は生物試料の形態の分析のための試薬とをさらに含む。

ここで採用することができる、生体分子の解析のための試薬は、特に核酸、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質の検出又は定量のための試薬である。当業者は、彼自身の発明的行動なしで技術文献からそのような試薬を見つけることができる。そのような試薬は、特に解析される生体分子については、キットとしてすでに入手可能な既製品であることが多い。そのような試薬には、特に、細胞又は細胞の構成物質を染色するための色素、任意で蛍光色素又は酵素で標識された抗体、吸収性マトリクス、たとえば、ＤＥＡＥセルロース又はシリカの膜、酵素のための基質、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、エタノール又はフェノールのような溶媒、水性緩衝液、ＲＮＡ分解酵素を含まない水、溶解試薬、アルコール性溶液などが挙げられる。

この背景において、組成物をすでに容器に導入することができる。しかしながら、キットは、さらなる構成要素として計量装置を含み、それは組成物で満たされ、それによって組成物の規定された部分を好ましくは無菌条件下で容器に導入することができることも考えられる。そのような計量装置は、たとえば、石鹸分配器の形態で構築することができる。

本発明に従って、遠心機を含む、試料から生体分子、好ましくは核酸を精製するための装置がさらに提供され、装置は、ユーザーの介入無しで遠心する間、自動化手順によって異なったレベルでの加速度値による少なくとも２つの遠心工程の包含を可能にする手段を含むことを特徴とする。この目的で、多段式遠心のプロトコールを保存する及び／又は保存することができる保存装置を有するマイクロプロセッサ制御が一般に必要である。

本発明に従って、試料から生体分子を精製するための上述の方法を実行するための手段をしかるべく含む遠心装置が同様に提供される。この背景において、ユーザーの介入無しで遠心する間、自動化手順によって異なったレベルでの加速度値による少なくとも２つの遠心工程の包含を可能にするマイクロプロセッサ制御が特に意図される。

そのような遠心装置は、自動化手順によって本発明に係る方法を実行するための手段を含む。これには、とりわけ、言及されたマイクロプロセッサ制御に加えて、たとえば、ピペット操作ロボットが含まれる。

本発明に従って、本発明に係る方法、組成物、キット及び／又は装置によって調製することができる精製された核酸がさらに提供される。この核酸は、特に、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡ又はｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔ−ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡである。

下記で示され、議論される実施例及び図面によって本発明をさらに詳細に説明する。ここでは、実施例は、記述的な特徴のみを有し、いかなる形態でも本発明を限定することは意図されないことが留意されるべきである。

図１は、多段式遠心工程を伴う本発明に係る方法に係る遠心プロトコールの一例としての経過を時間グラフとして示す。 図２Ａは、実施例２Ａの実験結果を示す。 図２Ｂは、実施例２Ｂの実験結果を示す。 図２Ｃは、実施例２Ｃの実験結果を示す。 図３は、本発明に係る方法で使用するための、珪酸塩マトリクス３１を含有する反応容器３０を示す。 図４は、本発明に係る方法に係る２つのさらなる遠心プロトコールの例証としての経過を図１のような時間グラフとして示す。

（実施例１）基礎的手順（従来技術に係る１工程法）
寒天プレートで増殖し、単離されるべきプラスミドを含有する細菌コロニーを採取し、各３ｍＬのＬＢ液体培養培地に懸濁し、複製のために３７℃で一晩インキュベートする。一晩培養で飽和した３ｍＬの細菌を卓上遠心機にて１３０００ｒｐｍで沈殿物にする。ビンボイン（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）の方法によってキアゲンからの改変標準プロトコールによってプラスミドＤＮＡを単離する。細菌培養の上清を除き、捨てる。２５０μＬの緩衝液Ｐ１（キアゲン）を沈殿物に加えて沈殿物を再浮遊させる。２５０μＬの緩衝液Ｐ２（キアゲン）の添加及び慎重に４〜５回振盪することによって細菌を溶解し（アルカリ溶解）；さもなければゲノムＤＮＡが動きだすので、溶解反応は、５分を超えてはならない。従って、３５０μＬの緩衝液Ｎ３（キアゲン）の添加及び直ちに穏やかに振盪することによって溶解反応を停止させる。溶解した細菌壁構成物質を１３０００ｒｐｍにて１０分間で沈殿物にする。

上清のプラスミドを慎重に取り出し、調製されたキアゲンのスピンカラムにピペットで入れる。次いでその後の手順は以下のとおりである。

（実施例２Ａ）１工程遠心法と２工程遠心法（結合工程）の間のＤＮＡ収量の比較
プラスミドｐｕｃ１９を含有する細菌培養物（ＤＨ１０Ｂ）３ｍＬを回収し、上述のように溶解し、スピンカラム（ＱＩＡプレップモデル）に移し、次いで従来の１工程（「手動１工程プロトコール）遠心法又は２工程（「手動２工程結合」）遠心法に供した。方法のパラメータは以下のとおりであった。

遠心プロトコールでの本質的な差異は、灰色の背景を有する。緩衝液、Ｐ１、Ｐ２、Ｎ２、ＰＥ及びＥＢは、ＱＩＡプレップキットの構成物質である。次いでプラスミドＤＮＡの収量を検討した。各場合で８回の並行した実験を行い、結果を統計的に評価して、図２Ａに示す。１工程法で８４５４ｎｇのＤＮＡ収量が達成された一方で、２工程法では９５４０ｎｇの収量が達成された。差は有意である。２工程法によるＤＮＡ収量がおよそ１３％高かったことを明らかに見ることができる。

（実施例２Ｂ）
１工程遠心法と２工程遠心法（洗浄工程）の間のＤＮＡ収量の比較
たとえば、以下の表で示されるように、二段階として結合工程の代わりに洗浄工程を設計した場合、同様の差異が見い出されるべきであった。

遠心プロトコールでの本質的な差異は、灰色の背景を有する。各場合で８回の並行した実験を行い、上記実施例のように評価を行った。結果を図２Ｂに示す。１工程法で４０２２ｎｇのＤＮＡ収量が達成された一方で、２工程法では４８０３ｎｇの収量が達成された。差は有意である。２工程法によるＤＮＡ収量がおよそ１９％高かったことを明らかに見ることができる。

（実施例２Ｃ）１工程遠心法と２工程遠心法の間のＲＮＡ収量の比較
常法（キアゲン、ＲＮｅａｓｙ）によってＪｕｒｋａｔ細胞を溶解し、スピンカラム（ＲＮｅａｓｙモデル）に移し、次いで従来の１工程（「手動標準プロトコール）遠心法又は２工程（「手動２工程結合」）遠心法に供した。方法のパラメータは以下のとおりであった。

遠心プロトコールにおける差異は灰色の背景を有する。緩衝液、ＲＰＥ、ＲＷＩ及びＲＬＴは、ＲＮｅａｓｙキットの構成物質である。次いでＲＮＡの収量を検討した。各場合で８回の並行した実験を行い、結果を統計的に評価して、図２Ｃに示す。

１工程法で１８３６ｎｇのＲＮＡ収量が達成された一方で、２工程法では２０１１ｎｇの収量が達成された。差は有意である。２工程法によるＲＮＡ収量がおよそ９％高かったことを明らかに見ることができる。

図１は、多段式遠心工程を伴う本発明に係る方法に係る遠心プロトコールの一例としての経過を時間グラフとして示す。示された例では、多段式遠心工程は遠心によって生体分子が結合マトリクスに結合する結合工程である。

このために、精製されるべき試料に結合緩衝液が添加され、次いで最初に５００×ｇにて１分間遠心が行われる。次いで８０００×ｇの加速度値が達成されるまで遠心機が加速し、さらに７５秒間この値で試料が遠心される。この手順の間に核酸は珪酸塩マトリクスに結合するが、残りの構成物質はすべて珪酸塩マトリクスを通過して、これを廃棄することができる。次いで洗浄緩衝液によって洗浄が行われ、溶出緩衝液によって核酸はカラムから洗い出され、回収される。

図２は、実施例２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに記載された実験の結果を示す。これでは、一方で核酸の絶対的な収量がｎｇで示され、他方で特定の２工程法の性能有利性が％で示される。

図３は、本発明に係る方法で使用するための、珪酸塩マトリクス３１を含有する反応容器３０を示す。核酸と少なくとも１種のカオトロピック塩を含有する試料の溶液又は懸濁液で反応容器３０を満たした後、又は反応容器にてそのような溶液又は懸濁液を調製した後、正確に嵌めこむさらに大きな回収容器３２に反応容器を入れる。示されていない遠心機にて、２つの容器の組み合わせは直ちに、第１の加速度値での第１の遠心工程と第１の加速度値よりも高い第２の加速度値での第２の遠心工程を伴う、本発明に係る遠心プロトコールに供される。この手順の間、核酸は珪酸塩マトリクスに結合するが、残りの構成物質はすべて珪酸塩マトリクスを通過して、これを廃棄することができる。次いで洗浄緩衝液によって洗浄が行われ、溶出緩衝液によって核酸はカラムから洗い出され、回収される。

図４は、本発明に係る方法に係る２つのさらなる遠心プロトコールの例証としての経過を図１のような時間グラフとして示す。上に示すプロトコールでは、種々の加速度値での個々の遠心工程の間で遠心を束の間、止める。さもなければ図１に与えられた説明が適用される。

下に示すプロトコールでは、中間の加速度値でのさらなる遠心工程が第１と第２の遠心工程の間に含まれる。その上さらなる遠心工程が含まれて、それが、時間グラフに幾分階段状の様相を与えていると考えられる。

Claims (18)

1. 試料から生体分子を精製する方法であって、以下の工程
   ａ）結合マトリクスを伴った反応容器の遠心機への配置、但し、生体分子を含有する試料の溶液又は懸濁液は、この工程の前又は後で、反応容器で調製される又は反応容器に導入される、；と
   ｂ）第１の加速度値での少なくとも第１の遠心工程と第１の加速度値より速い第２の加速度値での少なくとも第２の遠心工程を含む少なくとも１回の多段式遠心工程の包含；とを含み、
   但し、
   ｃ）工程ｂ）は、結合工程、洗浄工程及び／又は溶出工程であることができる方法。
2. 生体分子が、核酸、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質を含有する群から選択される物質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 結合マトリクスが、アニオン交換体、珪酸塩基材、プラスチックの基材又はキトサン含有の基材を含むことを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
4. 結合マトリクスが珪酸塩基材を含み、生体分子を含有する試料が遠心の前にさらに少なくとも１種のカオトロピック塩と混合されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記方法が、生体分子を含有する細胞又は組織の溶解の工程によって先行されることを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
6. カオトロピック塩が、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化グアニジン、尿素、硫酸アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム及びチオシアン酸グアニジンを含有する群から選択される塩又は塩の混合物であることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
7. 第１の遠心工程が、５〜２０００×ｇの間の範囲の加速度値で行われることを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
8. 第２の遠心工程が、１００〜２５０００×ｇの間の範囲の加速度値で行われることを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
9. 反応容器が、「振り子型」の遠心ローターで遠心されることを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
10. 前記方法の個々の工程が自動化手順によって進行することを特徴とする先行請求項の１項に記載の方法。
11. 請求項１〜１０の１項に記載の、試料から生体分子を精製するための方法にて使用されるための結合マトリクスを含有する反応容器。
12. 請求項１〜７の１項に記載の、試料から生体分子を精製するための方法にて使用されるための組成物であって、アルカリ剤、フェノール、溶解酵素、イソアミルアルコール、クロロホルム（溶解緩衝液）、カオトロピック塩（結合緩衝液）、アルコール（結合緩衝液）及び無機又は有機の塩（溶出緩衝液）を含有する群から選択される少なくとも１つの構成物質を含む組成物。
13. 請求項１２に記載の少なくとも１つの組成物を含む要素のキット。
14. （ａ）請求項１１に記載の反応容器、及び
    （ｂ）生物試料における若しくはそれに由来する生体分子の分析のための、又は生物試料の形態の分析のための試薬とを
    さらに含む請求項１３に記載の要素のキット。
15. 遠心機を含む、試料から生体分子を精製するための装置であって、ユーザーの介入無しで遠心する間、自動化手順によって異なったレベルでの加速度値による少なくとも２つの遠心工程が包含されることを可能にする手段を含むことを特徴とする装置。
16. 請求項１〜１０の１項に記載の、試料から生体分子を精製するための方法を実行するための手段を含む遠心装置。
17. 請求項１〜１０の１項に記載の、試料から生体分子を精製するための方法を自動化して実行するための手段を含む請求項１６に記載の遠心装置。
18. 請求項１〜１０の１項に記載の方法、請求項１１に記載の反応容器、請求項１２に記載の組成物、請求項１３〜１４の１項に記載のキット及び／又は請求項１５〜１７の１項に記載の装置によって調製することができる精製された核酸。

Images