CN101675163A - 用于生物分子纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于从样本中纯化生物分子的方法，该方法包括以下步骤：a)将含有结合基质的反应容器放置在离心机中，其中在这一步骤之前或之后在反应容器中制备含有生物分子的样本的溶液或悬浮液或将其加入所述反应容器中；以及b)合并使用至少一个多级离心步骤，该步骤包括至少一个具有第一个加速度值的第一个离心步骤和至少一个具有大于所述第一个加速度值的第二个加速度值的第二个离心步骤；其中c)步骤b)可以是结合步骤、洗涤步骤、和/或洗脱步骤。

Description

用于生物分子纯化的方法

发明领域

本发明涉及生物分子纯化的方法，尤其涉及诸如DNA和RNA分子的核酸纯化的方法。

技术背景

对来自生物样本的生物分子的纯化和分析在基础生物医学研究、临床研究和诊断、法医分析、种群遗传学研究、流行病学分析以及与之相关的专门领域中发挥着越来越大的作用。这尤其适用于诸如DNA和RNA分子的核酸，但也适用于氨基酸、寡肽、多肽、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸和/或脂质。

在过去的二十年间，生物学已经发展出了一套全面的分子生物学手段。因此预计分子生物学在未来会有更广泛的应用，例如在医学和临床诊断、法医学、制药中的药物开发和评价、食品分析以及食品生产的监测、农业科学中的作物和家畜育种以及环境分析和许多研究领域中。

通过分析转录组(即细胞中的mRNA)，可以直接确定基因的活性。采用现代分子生物学方法(如例如实时逆转录酶PCR(实时RT PCR)或基因表达芯片分析)的细胞内转录图谱(mRNA图谱)的定量分析，可以例如检测缺陷表达的基因，作为其结果，可以检测例如代谢疾病、感染或癌症疾病的倾向性。

采用如例如PCR、NASBA、RFLP、AFLP或测序的分子生物学方法的基因组(即完整的细胞DNA)分析可以例如检测遗传缺陷或确定HLA类型和其他遗传标记。用于司法、种群遗传学或食品法规分析的DNA指纹识别也属于这一范畴。基因组DNA和RNA分析也用于对感染性病原体(如病毒、细菌等等)的直接检测。

对诸如例如氨基酸、寡肽、多肽、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸和/或脂质等其他生物分子的分析可以提供例如关于特殊生理状态、食品中的污染、特殊营养成分含量等等的信息。

然而，所有这些方法的一个前提条件是对样本中所包含的生物分子(尤其是核酸)进行分离或纯化，从而随后可以对其使用所述的一种方法。

由于待检测的生物分子经常以非常低的浓度存在，对样本中所含生物分子的有效且高收率的纯化具有重大价值。

存在大量从生物样本中纯化生物分子的方法。这里经常使用离心步骤，其中将溶解的样本导入含有结合基质的离心管中。离心过程中，所述溶液流经所述基质，并且待纯化的生物分子以结合的形式保留在所述基质上。在所述程序的随后过程中，将其从基质上洗脱并收集。

例如EP389063中公开的所谓“栅栏原理(boom principle)”方法是一种按照这一原理纯化核酸的方法。

该方法中，在离液盐存在的情况下将含有核酸的样本导入含有硅酸盐基质的管中。随后对该管进行离心或使用真空。这导致核酸结合在所述硅酸盐基质上，而该样本的所有其他组分(尤其是细胞碎片、细胞器、蛋白质等等)流经所述硅酸盐基质并加以丢弃。随后用适当的试剂洗脱所结合的核酸并进行进一步分析。

例如Melzak等(1996)Driving Forces for DNA Adsorption to Silica inPerchlorate Solutions(高氯酸盐溶液中DNA吸附至二氧化硅的驱动力)，Journalof Colloid and Interface Science 181(2)，635-644中描述了与所述结合相关的机理。

这一方法经常使用所谓的“离心柱”。这是含有盘状硅酸盐基质的微反应容器，其底部是开口的，并放置在另一个底部闭合的微反应容器中。含有核酸的样本与离液盐一起用移液管转移至所述微反应容器中。随后将所述两个微反应容器的组合移至离心机中并以约10000xg的加速度离心。在此过程中，所述核酸与所述硅酸盐基质结合，而所述样本的所有其他组分流经所述硅酸盐基质并转移至第二个底部封闭的微反应容器中。随后将后者丢弃，而所结合的核酸用适当的试剂洗脱并进行进一步分析。

这样的和类似的产品以及其他产品可从本发明申请人处获得，但也可以从竞争者(如普利马公司(Promega)、安拜公司(Ambion)、M&N公司(Macherey undNagel)和因维曲根公司(Invitrogen))处获得。

这样的用于生物分子纯化的方法的一个关键特征是在许多情况下所实现的收率不够。尤其是样本中的生物分子量如此之低使得采用常规纯化方法的收率不足以对所述分子随后进行检测的情况下更是如此。这样的样本是例如司法样本或对其中微弱表达的基因的RNA进行分析的样本。

本发明的目的

本发明基于克服现有技术所导致的所述缺点这一目的。具体地说，本发明的一个目的是改进所述的方法以提高所实现的生物分子的收率，从而使得也能在不利情况下从生物样本中纯化生物分子(尤其是核酸)并使其能够易于随后的分析。

发明概述

这一目的是通过所提交的主要权利要求的特征实现的。附属权利要求描述了优选的实施方式。这里需要指出，所规定的特定区间总是理解为包括具体的临界值。

相应地设想提供了一种用于从样本中纯化生物分子的方法，该方法包括以下步骤：

a)将含有结合基质的反应容器放置在离心机中，其中在这一步骤之前或之后在所述反应容器中制备含有生物分子的样本的溶液或悬浮液或将其导入所述反应容器中；以及

b)包括至少一个多级离心步骤，所述步骤包括至少一个具有第一个加速度值的第一个离心步骤和至少一个具有大于所述第一个加速度值的第二个加速度值的第二个离心步骤；其中

c)步骤b)可以是结合步骤、洗涤步骤和/或洗脱步骤。

优选地，所述多级步骤b)是一个结合步骤，其中所述生物分子通过离心与所述结合基质结合。如实施例中所展示的，在这种情况下实现了生物分子收率的显著提高。然而，这一步骤同样也可以优选地是一个洗涤步骤。

可以进一步设想，在第一个离心步骤之前、在第一个和第二个离心步骤之间或在第二个离心步骤之后任选进一步包括其他离心步骤。

在一种进一步优选的实施方式中，进一步设想，所述方法包括至少一个结合步骤、一个洗涤步骤和一个洗脱步骤，这些步骤总是包括至少一个任选的多级离心步骤。

尤其优选地，设想所述生物分子是选自下组的物质：核酸、氨基酸、寡肽、多肽、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸和/或脂质。

在下文中，术语“核酸”理解为具体表示RNA和DNA。在这里，DNA可以是具体的质粒、基因组、病毒和线粒体DNA，而RNA可以是具体的mRNA、siRNA、miRNA、rRNA、snRNA、t-RNA、hnRNA以及总RNA。

原则上，这里所介绍的核酸可以是任何类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶基的N-糖苷或C-糖苷。所述核酸可以是单链、双链或多链的、线性的、分支的或环状的。它可以对应于细胞中存在的分子，诸如例如基因组DNA或信使RNA(mRNA)，或可以体外产生，诸如互补DNA(cDNA)、反义RNA(aRNA)或合成的核酸。所述核酸可以由少量核苷酸或也可以由几千个核苷酸构成。

在下文中，术语“含有结合基质的反应容器”理解为表示生化分离原理，其中将与选择性确定的物质结合的一种结合基质放置在反应容器或小型化的柱子中。

在下文中，术语“加速度值”表示通过离心机的旋转速度实现的并作用在被离心物体上的重力加速度的倍数。这用参数g＝9.81ms^-2测量。例如，1000xg表示1000倍重力加速度的加速度值。所述加速度值也被称为“离心系数”，并且不等于离心机的旋转速度，后者按惯例用每分钟旋转数(rpm)表示。在构成上，所述加速度值由离心机桶直径(有效直径)和转速决定。

在下文中，术语“离心步骤”理解为表示通过可定义的时间段和可定义的加速度值加以区分的处理步骤。

所述结合基质优选地包括阴离子交换剂、硅酸盐基材、塑胶基材或含脱乙酰壳多糖的基材。

在下文中，术语“硅酸盐基材”理解为表示具有大的内部表面积的多孔硅酸盐的膜、颗粒、填料或圆盘，它们被放置在所述反应容器中，从而使得在使用真空或离心过程中，驱动导入所述反应容器中的溶液经过所述膜、颗粒、填料或圆盘，这样使得溶液中所含的组分与所述基质的组分相接触。所述硅酸盐基材优选硅土凝胶的基质。所述硅酸盐基材同样可以由加压玻璃纤维或玻璃珠(“微珠”)构成。使用例如申请人以商品名QIAprep和RNeasy在市场上销售的纯化试剂盒中的硅酸盐基材。

阴离子交换剂是现有技术中充分已知的。例如，在这里按惯例使用一种与核酸骨架的带负电的磷酸根相互作用的树脂。所使用的缓冲液的盐浓度和pH值决定所述核酸是否与所述树脂结合或从柱子上洗脱。

例如，申请人以商品名QIAGEN Genomic-tip和Plasmid-tip在市场上销售这样的阴离子交换剂。

脱乙酰壳多糖仅在最近被作为一种针对生物分子的结合剂进行讨论。这是一种β-1，4-糖苷连接的N-乙酰基-氨基葡糖根和氨基葡糖根的共聚物。在生理条件下，脱乙酰壳多糖正的净电荷并因此能够结合许多带负电的生物分子，尤其是核酸、氨基酸、寡肽和多肽、脂肪和脂肪酸。

此外，按照本发明特别优选地设想了所述结合基质包括硅酸盐基材，并且含有生物分子的所述样本在离心前还与至少一种离液盐混合。所述实施方式具体而言适用于核酸。此处使用的分离原理基于已经讨论过的“栅栏原理”的方法。在这种情况下，在离液盐存在的情况下将含有核酸的样本导入含有硅酸盐基质的管中。随后对所述的管进行离心或使用真空。这导致核酸与硅酸盐基质结合，而所述样本的所有其他组分(具体而言细胞碎片、细胞器、蛋白质和其他物质)流经所述硅酸盐基质并加以丢弃。随后用合适的试剂洗脱所结合的核酸并进行进一步分析。

优选地，在这一实施方式中设想了以下步骤：

a)将含有包括硅酸盐基材的结合基质的柱子类反应容器放置在离心机中，其中在此步骤之前或之后在所述反应容器中制备含核酸样本的溶液或悬浮液以及至少一种离液盐或将它们导入所述反应容器中；

b)包含以第一个加速度值的第一个离心步骤；

c)包含以大于所述第一个加速度值的第二个加速度值的第二个离心步骤；

d)在步骤c)和步骤d)之间或在步骤d)之后任选包含进一步的离心步骤；

e)任选包含一个或多个洗涤步骤；以及

f)用洗脱溶液洗脱与硅酸盐基材结合的核酸。

在这一实施方式中，所述多级离心步骤是结合步骤，其中所述核酸与所述硅酸盐基质结合。这一实施方式与现有技术中已知的采用含有硅酸盐基质的“离心柱”的一步方法相比导致了所要纯化的核酸收率的显著提高。另外或此外，然而也可以设想在上述实验方案中将洗涤和/或洗脱步骤设计为多步骤的。

优选地使用洗涤缓冲液进行洗涤步骤。具体而言这可以包含乙醇和/或丙酮。

用于洗脱所述与结合基质结合的生物分子(尤其是核酸)的洗脱液可以是例如水(包括双蒸水)或低摩尔浓度溶液。例如，这里可以使用低浓度氯化钠溶液。

优选地，溶液中已经存在离液盐。另外，所述含有核酸的样本可以存在于溶液或悬浮液中并可以随后添加一种离液盐。另外，所述样本和离液盐可以以固体形式存在并共同进入溶液或悬浮液。

在下文中，术语“柱子类反应容器”理解为表示顶部可选地封闭的并且底部可选地开口的管。所述反应容器包含以上所述的硅酸盐基质。上述反应容器的典型的例子是由诸如申请人生产并市场销售的所谓的“离心柱”。所述反应容器可以优选地设置成使其能够放置在可商品化获得的稍大些的反应容器(如例如由Eppendorf市场销售的)中精确吻合。在这种情况下，所述大一些的反应容器作为流经所述结合基质的液体的收集管。

正如申请人的研究所显示的(参见实施例)，如本发明所述的方法具有以下共同特征，通过首次将低加速度值的第一个离心步骤与高加速度值的第二个离心步骤组合，生物分子纯化的收率提高了20％。通过这种方法，分析研究得到了显著推动，并在许多情况下首次成为可能；存在这样的情况，其中例如样本中的核酸量是如此之低，使得采用常规纯化方法的收率不足以对核酸进行扩增和/或检测。

所述的收率的提高是令人惊讶的并且不是精通本领域的人员可以预见的。考虑到目前“柱离心”方法总是以单一的加速度值进行这一事实，浅显考虑时两步骤离心方法似乎是非常没有吸引力的，因为这比单步骤离心方法花费更长的时间。

如本发明所述的方法可以在商品化的、人工操作的台式离心机(如例如实验室设备制造商Eppendorf生产的并在任何一个从事生物科学领域研究的实验室中都有的)中进行。在这种情况下，具有不同加速度值的至少两个离心步骤的离心方案是“手工”完成的，即用户的干预对于包含所述不同的离心步骤是必需的。

不必说，优选地设想如本发明所述的方法在自动化的和/或可编程的离心机中进行。具体而言，这里可以设想所述离心机已经具有一个或多个内部保存的具有不同加速度值的至少两个离心步骤的离心方案。这样的离心机明确地属于本发明的保护范围。

所述生物样本尤其优选选自下组的材料：样本材料、血浆、体液、血液、血清、细胞、白细胞组分、血块黄层、痰、尿液、精液、粪便、法医学样本、涂片、穿刺样本、活组织切片、组织样本、组织部分和器官、食品样本、环境样本、植株和植株部分、细菌、病毒、类病毒、朊病毒、酵母和真菌、以及上述材料的片段或组分、以及/或分离的、合成的或修饰的蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、代谢产物和/或代谢物。

在这里，对于所述样本中或来自所述生物样本的核酸的随后分析而言，可以使用已知的并且精通本领域的人员认为适当的所有方法，优选选自下组的方法：光学显微镜、电子显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、激光显微解剖、扫描电子显微镜、Western印迹、Southern印迹、酶联免疫吸附检测(ELISA)、免疫共沉淀、亲和层析、突变分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、尤其是双向PAGE、HPLC、聚合酶链式反应(PCR)、RFLP分析(限制性片段长度多态性分析)、SAGE分析(基因表达系列分析)、FPLC分析(快速蛋白质液体层析)、质谱，例如MALDI-TOFF质谱或SELDI质谱、微阵列分析、LiquiChip分析、酶活性的减退、HLA分型、测序、WGA(全基因组扩增)、RT-PCR、实时PCR或实时RT-PCR、RNA酶保护分析或引物延伸分析。

优选地，设想所述方法之前进行裂解含有生物分子的细胞或组织的步骤。

这一裂解步骤可以是例如物理或化学裂解。具体地说，所采用的物理裂解方法是使用超声、连续冻融(冷冻/融化)、使用转叶、使用振动微珠、低渗休克作用、所谓的“弗氏细胞压碎法”或所谓的“细胞炸弹方法”。

具体地说，可以使用的化学裂解方法包括使用苯酚、氯仿和/或异戊醇。酶法同样属于这一范畴，因此例如对细菌使用溶菌酶或对酵母使用β-葡萄糖苷酸酶(“蜗牛肠酶”)。

碱裂解是一种特殊形式。它尤其用于从已经裂解的细菌中分离质粒DNA。通过向细胞提取物添加NaOH，解开染色体和质粒DNA的互补DNA链之间的氢键，质粒DNA由于其构象能够完全复性。通过各个制备步骤已经打断成片段的染色体DNA在用醋酸钾和冰醋酸中和pH后不能复性，并且仅具有短的互补区域的DNA双链和由于许多DNA单链的不匹配连接形成杂乱的DNA团。这可以相对容易地与NaOH一同离心下来，后者由于中和作用而沉淀出来。此外，在这一离心步骤中，细胞膜和细胞壁成分以及蛋白质以颗粒形式沉淀。离心后质粒DNA位于上清液中。

此外，尤其优选地设想如本发明所述使用的离液盐是选自下组的盐或盐的混合物：盐酸胍、硫氰酸胍、碘化胍、尿素、硫酸铵、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、(异)硫氰酸钠和硫氰酸胍。

离液盐是对水具有高亲和力并从而形成水合外层的盐。在这些盐存在的情况下，由于疏水性侧链的溶解度增加破坏了蛋白质中疏水性相互作用的稳定性，蛋白质变性。另一方面，诸如DNA和RNA的核酸不受影响，因为疏水性相互作用对其稳定性不是必需的。此外，高浓度的离液盐的阳离子使得硅酸盐表面(尤其是硅酸盐基质内)的负电荷得以饱和，并产生正的净电荷，这显著促进了核酸与硅酸盐基质的结合。

所述方法的第一个离心步骤优选地在加速度值位于5-2000xg之间的区间内进行。尤其适合的加速度值是10xg、27xg、50xg、150xg、300xg、500xg、800xg、1000xg和1500xg。这一离心步骤可以持续例如5秒-20分钟。尤其优选10秒-10分钟的持续时间。尤其优选30秒-5分钟的持续时间。

所述方法的第二个离心步骤优选地在加速度值位于100-25000xg之间的区间内进行。尤其适当的加速度值为180xg、610xg、1000xg、2500xg、8000xg、12000xg和/或17000xg。这一离心步骤同样可以持续例如5秒-20分钟。尤其优选10秒-10分钟的持续时间。尤其优选30秒-5分钟的持续时间。

正如可以从以上描述中看到的，第一和第二个离心步骤的加速度值的区间重叠。然而，按照本发明，必须保证第一个离心步骤的加速度值总是低于第二个离心步骤的加速度值。

此外，设想所述反应容器在“外旋式”离心转子中离心。在这样的转子中，所需的离心角度只有在转子处于运动状态时才得以确定。在使用固定角度转子的情况下，如本发明所述的方法确实也具有所述的收率的提高，但如果通过例如移液管或在移液机器人的帮助下将物质导入已经放置在转子中的反应容器或离心管中时，优选采用“外旋式”离心转子。

特别优选地，设想所述方法的各个步骤通过自动化程序进行。为此目的，除了其他内容，申请人已经开发了其自己的将移液机器人和可编程离心机的功能加以组合的装置。在这样的自动化过程的帮助下，可以显著提高实验室的生产量并同时可以大量避免加样误差。这两个因素正好在临床、法医学、流行病学和种群遗传学研究中起到重要作用。

此外，提供了从样本中纯化生物分子(优选核酸)的方法中使用的含有结合基质的反应容器。这样的反应容器例如如图3中所示。

此外，如本发明所述，提供了从样本中纯化生物分子(优选核酸)的方法中使用的一种组合物，所述组合物包括至少一种选自下组的组分：从包含碱性试剂、苯酚、裂解酶、异戊醇、氯仿、离液盐、醇、水和无机或有机盐。

这一组合物可以是例如一种裂解缓冲液(苯酚、裂解酶、异戊醇、氯仿)、一种结合缓冲液(离液盐)、一种洗涤缓冲液(醇、无机或有机盐)或一种洗脱缓冲液(无机或有机盐)。

如本发明所述，进一步提供了一种包括至少一种所述组合物的试剂盒。特别优选地，这一试剂盒包括至少一个上述反应容器和用于生物样本中或来自生物样本的生物分子的分析或用于生物样本的形态学分析的其他试剂。

具体地说，这里可以用于生物分子分析的试剂是用于对核酸、氨基酸、寡肽、多肽、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸和/或脂质进行检测和定量的试剂。精通本领域的人员可以从技术文献中发现这样的试剂而不需要其自己的创造性步骤。这样的试剂通常是以针对待分析的具体生物分子的试剂盒形式可现成获得的。具体而言，这些试剂包括用于细胞或细胞组分染色的染料、抗体(任选用荧光染料或酶标记的)、吸附基质(诸如例如DEAE纤维素或硅土膜)、酶的底物、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶剂(诸如乙醇或苯酚)、水性缓冲溶液、无RNA酶的水、裂解试剂、含醇的溶液等等。

在这里，所述组合物可以已经导入所述管中。然而，也可以设想所述试剂盒包含作为另一个成分的一种计量装置，该装置含有所述组合物并优选在无菌条件下由其可以将确定量的所述组合物导入所述管中。例如，可以以皂液器的方式构建这样的计量装置。

如本发明所述，进一步提供了一种包括离心机的用于从样本中纯化生物分子(优选核酸)的装置，其特征在于，所述装置包含能够通过在离心过程中无需用户干预的自动化程序将具有不同水平的加速度值的至少两个离心步骤包括在内的机构。为此目的，按照惯例，具有其中存储有和/或可以存储多级离心方案的存储装置的微处理控制器是必需的。

如本发明所述，同样提供了相应地包含用于进行上述从样本中纯化生物分子的方法的机构的离心装置。在这里具体地说，设计了能够通过在离心过程中无需用户干预的自动化程序将具有不同水平的加速度值的至少两个离心步骤包括在内的微处理控制器。

这样的离心装置包含用于通过自动化程序进行本发明所述方法的机构。除了所述的微处理控制器之外，它包括例如移液机器人及其他部件。

如本发明所述，进一步提供了可以通过本发明所述的方法、组合物、试剂盒和/或装置进行制备的纯化的核酸。具体地说，所述核酸是质粒、基因组、病毒和线粒体DNA或mRNA、siRNA、miRNA、rRNA、snRNA、t-RNA和hnRNA。

附图和实施例

通过以下展示和讨论的实施例和附图对本发明进行更详细的解释。需要注意的是，实施例仅具有描述性的特征，并不意味着对本发明进行任何形式的限制。

实施例1：基础程序(如现有技术所述的单步骤方法)

挑取在琼脂平板上生长并含有待分离质粒的菌落，每个悬浮液3ml LB液体培养基并在37℃过夜孵育使其增殖。3ml饱和的细菌过夜培养物在台式离心机中以13000rpm转速离心沉淀。按照Birnboim的方法通过Qiagen的经改良的常规方案分离质粒DNA。除去并丢弃细菌培养物上清。向沉淀中加入250μlP1缓冲液(Qiagen)并将沉淀重悬。通过添加250μl P2缓冲液(Qiagen)并小心地摇动4-5次裂解细菌(碱裂解)；裂解反应持续不应超过5分钟，否则基因组DNA会活动。因此，通过添加350μl N3缓冲液(Qiagen)并立即温和振荡终止裂解反应。13000rpm离心10分钟沉淀裂解的细菌细胞壁成分。

小心地取出上清液中的质粒并移液至准备好的Qiagen离心柱中。随后的程序如下：

实施例2A.单步骤和双步骤离心方法(结合步骤)之间DNA收率的比较

如上所述对3ml含有质粒puc 19的细菌培养物(DH10B)进行收集和裂解并转移至离心柱(QIAprep型)，并随后进行常规的单步骤(“人工单步骤方案”)或双步骤(“人工双步骤结合”)离心处理。过程参数如下：

离心方案中的主要差别具有灰色的背景。缓冲液P1、P2、N2、PE和EB是QIAprep试剂盒的成分。随后研究了质粒DNA的收率。在每种情况下进行了8个平行实验，对结果进行了统计学评价并展示在图2A中。虽然采用单步骤方法实现了8454ng的DNA收率，采用双步骤方法达到了9540ng的收率。该差异是显著的。可以清楚地看到，采用双步骤方法的DNA收率高了约13％。

实施例2B.单步骤和双步骤离心方法(洗涤步骤)之间DNA收率的比较

洗涤步骤取代结合步骤被设计成两个阶段时，发现了类似的差异，例如下表中所示：

离心方案中的主要差别具有灰色的背景。每种情况下进行了8个平行实验，并且如上一实施例进行了评价。结果显示在图2B中。虽然采用单步骤方法实现了4022ng的DNA收率，采用双步骤方法实现了4803ng的收率。所述差异是显著的。可以清楚地看到，采用双步骤方法的DNA收率高了约19％。

实施例2C.单步骤和双步骤离心方法之间RNA收率的比较

用常规方法(Qiagen RNeasy)裂解Jurkat细胞并转移至离心柱(RNeasy型)中，并进行常规的单步骤(“人工常规方案”)或双步骤(“人工双步骤结合”)离心处理。过程参数如下：

离心方案中的主要差别具有灰色的背景。缓冲液RPE、RW1和RLT是RNeasy试剂盒的成分。随后研究了RNA的收率。每种情况下进行了8个平行实验，并对结果进行了统计学评价并显示在图2C中。

虽然采用单步骤方法实现了1836ng的RNA收率，采用双步骤方法实现了2011ng的收率。所述差异是显著的。可以清楚地看到，采用双步骤方法的RNA收率高了约9％。

作为举例，图1显示了按照如本发明所述方法的具有多级离心步骤的离心方案过程的时间曲线。在所示的例子中，所述多级离心步骤是结合步骤，其中生物分子通过离心与结合基质相结合。

为此，向待纯化的样本添加结合缓冲液并最初以500xg进行离心1分钟。随后将离心机加速至加速度值达到8000xg，并将所述样本以该值离心75秒。在这一过程中，核酸与硅酸盐基质结合，而所有其他组分流经硅酸盐基质并可以丢弃。随后用洗涤缓冲液进行洗涤，用洗脱缓冲液将核酸从柱子上洗脱并收集。

图2显示了实施例2A、2B和2C中所述描述的实验的结果。在此，一方面显示了以ng表示的核酸的绝对收率，另一方面显示了用％表示的具体双步骤方法的性能优越性。

图3显示了在本发明所述方法中使用的含有硅酸盐基质31的反应容器30。将含核酸样本的溶液或悬液以及至少一种离液盐加入反应容器30后、或是这样的溶液或悬液在所述反应容器中制备后，将所述反应容器放置在精确匹配的稍大些的管32中。现在所述两个管的组合在离心机中(未显示)按照本发明的离心方案进行离心，其中该方案包含具有第一个加速度值的第一个离心步骤和具有大于所述第一个加速度值的第二个加速度值的第二个离心步骤。在此过程中，核酸与硅酸盐基质结合，而所有其他组分流经硅酸盐基质并可以丢弃。随后用洗涤缓冲液进行洗涤，用洗脱缓冲液将核酸从柱子上洗脱并收集。

作为举例，与图1相似，图4显示了按照如本发明所述方法的其他两种离心方案过程的时间曲线。在顶端所示的方案中，离心机在具有不同加速度值的各个离心步骤之间暂时停止。对图1的描述同样适用。

在底部所述的方案中，在第一和第二个离心步骤之间包括另一个具有中间加速度值的离心步骤。可以认识到，可以包括其他额外的离心步骤，这会使得时间曲线具有更多或更少的台阶状外观。

Claims (18)

1.一种用于从样本中纯化生物分子的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将含有结合基质的反应容器放置在离心机中，其中在这一步骤之前或之后在所述反应容器中制备含有生物分子的样本溶液或悬浮液或将其导入所述反应容器中；以及

b)包括至少一个多级离心步骤，所述步骤包括至少一个具有第一个加速度值的第一个离心步骤和至少一个具有大于所述第一个加速度值的第二个加速度值的第二个离心步骤；其中

c)步骤b)可以是结合步骤、洗涤步骤和/或洗脱步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物分子是选自下组的物质：核酸、氨基酸、寡肽、多肽、单糖、寡糖、多糖、脂肪、脂肪酸和/或脂质。

3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述结合基质包括阴离子交换剂、硅酸盐基材、塑胶基材或含脱乙酰壳多糖基材。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结合基质包含硅酸盐基材，并且所述含生物分子的样本在离心前与至少一种离液盐混合。

5.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述方法之前对含有生物分子的细胞或组织进行裂解步骤。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述离液盐是选自下组的盐或盐的混合物：盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化胍、尿素、硫酸铵、碘化钠、碘化钾、高氯酸钠、(异)硫氰酸钠和硫氰酸胍。

7.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述第一个离心步骤在加速度值为5-2000xg的区间内进行。

8.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述第二个离心步骤在加速度值为100-25000xg的区间内进行。

9.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述反应容器在“外旋式”离心转子中离心。

10.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于，所述方法的各个步骤通过自动化程序进行。

11.一种用于如权利要求1-10之一所述的从样本中纯化生物分子的方法的含有结合基质的反应容器。

12.一种用于如权利要求1-7之一所述的从样本中纯化生物分子的方法的组合物，其特征在于，所述组合物包括至少一种选自下组的组分：碱性试剂、苯酚、裂解酶、异戊醇、氯仿(裂解缓冲液)、离液盐(结合缓冲液)、醇(结合缓冲液)以及无机或有机盐(洗脱缓冲液)。

13.一种包含至少一种如权利要求12所述的组合物的试剂盒。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包含

(a)至少一个如权利要求11所述的反应容器，以及

(b)用于对生物样本中或来自生物样本的生物分子进行分析或用于分析生物样本形态学的试剂。

15.一种包括离心机的用于从样本中纯化生物分子的装置，其特征在于，所述装置包含能够通过在离心过程中无需用户干预的自动化程序进行具有不同水平加速度值的至少两个离心步骤的机构。

16.一种包含用于进行如权利要求1-10之一所述的从样本中纯化生物分子的方法的机构的离心装置。

17.如权利要求16所述的离心装置，其特征在于，所述离心装置包含用于自动化进行如权利要求1-10之一所述的从样本中纯化生物分子的方法的机构。

18.一种可通过如权利要求1-10之一所述方法、如权利要求11所述的反应容器、如权利要求12所述的组合物、如权利要求13-14之一所述的试剂盒和/或如权利要求15-17之一所述的装置进行制备的纯化的核酸。

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