CN108474024B - 磁性玻璃颗粒对核酸的连续捕获 - Google Patents
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Abstract
本文提供了使用磁性玻璃颗粒连续捕获核酸的方法和组分。
Description
背景技术
“液体活组织检查”的概念在近年来已经引起注意。不是从固体组织取样品,液体活组织检查捕获细胞、细胞外囊泡诸如外来体和/或无细胞分子诸如DNA、RNA或蛋白。可以将这些组分收集在生物流体诸如血液(或血浆或血清)、尿、痰等。这些组分的存在可以与例如癌症、肿瘤、自身免疫疾病、心血管事件、病毒、细菌或病原性感染有关,或与药物应答有关。目标分子经常与细胞外体诸如外来体有关,或可以在流体中是“无细胞”的。
液体活组织检查可以使用几种生物流体中的任一种进行,且可以是微创伤的(例如,通过静脉切开术的血液收集)或非侵袭性的(尿收集)。由于容易收集、容易重复收集用于患者监测、更高的患者默许的可能性、患者对样品收集的熟悉和较不专门的收集部位,液体活组织检查因而是有吸引力的。
液体活组织检查的一个缺点是,核酸的浓度可以是相对低的,以致于需要大体积才能得到足够的材料用于下游分析。核酸捕获试剂盒和装置通常针对小样品体积(通常在0.2-1 ml的范围内)设计。
尽管磁性颗粒对于核酸捕获是非常有用的,但是铁磁性颗粒在暴露于磁场以后变得各自被磁化。目前不建议在最初的磁性分离步骤以后连续重复使用磁性颗粒,因为据信,所述颗粒不能有效地结合另外的核酸。例如,一旦所述颗粒各自被磁化,它们形成阻断任何未被占据的核酸结合位点的团块。
发明概述
本文提供了用于核酸捕获的方法和组合物,其使用相同的磁性玻璃颗粒(MGP)进行多个连续轮的磁性捕获和纯化。这些方法可用于在自动化系统所用的相对小的容器中处理大液体样品体积。
提供了用于捕获液体样品中的核酸的方法,所述方法包括:(a)在允许来自所述液体样品的核酸非共价地结合MGP的条件下在容器中使所述液体样品的第一等分试样与MGP接触,其中所述MGP包含至少一个在玻璃中的磁性芯,且是铁磁性的和无孔的;(b)给所述MGP施加磁场;(c)从所述MGP除去未结合的液体样品;(d)使所述液体样品的第二等分试样与所述MGP接触;(e)将所述MGP重悬于所述液体样品的第二等分试样中;(f)抽吸所述MGP以在所述液体样品的第二等分试样中混合所述MGP;(g)给所述MGP施加磁场;(h)从所述MGP除去未结合的液体样品;和(i)任选地针对液体样品的至少一个另外等分试样(例如,第三、第四、第五或第六等分试样)重复步骤(d)-(h)。在某些实施方案中,步骤(f)包括将所述MGP抽吸至液体样品的第二个(或之后的)等分试样的顶部,并分配所述MGP。在某些实施方案中,针对所述液体样品的3、4、5或6个等分试样实践所述方法。
在某些实施方案中,所述MGP具有0.5-15µm的平均直径,例如,1-10µm、0.8-2µm。在某些实施方案中,所述玻璃包含至少一种金属氧化物。在某些实施方案中,所述金属氧化物选自SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和ZnO。在某些实施方案中,按照摩尔百分比的次序,所述玻璃包含SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和ZnO。在某些实施方案中,按照摩尔百分比的次序,所述玻璃包含SiO2、B2O3、Al2O3、K2O和CaO。
在某些实施方案中,在有离液剂(例如,硫氰酸胍、盐酸胍或脲)存在下进行步骤(a)-(i)。在某些实施方案中,所述方法还包括从所述MGP洗脱核酸,例如,在包含与步骤(a)-(i)中存在的浓度相比更低浓度的离液剂的液体或缓冲液中,或基本上缺少离液剂(例如,水或缓冲液)的液体或缓冲液中。在某些实施方案中,步骤(c)包括从所述MGP除去未结合的液体样品,洗涤所述MGP,和从所述MGP除去未结合的物质。在某些实施方案中,步骤(h)包括从所述MGP除去未结合的液体样品,洗涤所述MGP,和从所述MGP除去未结合的物质。在某些实施方案中,步骤(c)和(h)包括从所述MGP除去未结合的液体样品,洗涤所述MGP,和从所述MGP除去未结合的物质。
在某些实施方案中,所述液体样品是血液、血浆、血清、尿、唾液、精液、脑脊液或其裂解物。在某些实施方案中,所述液体样品是血浆或血清。在某些实施方案中,所述液体样品是尿。在某些实施方案中,所述液体样品具有至少2 ml的体积,例如,4、5、10、50、2-10、4-50或2-100 ml。在某些实施方案中,所述液体样品具有2-100 ml的体积。
在某些实施方案中,所述容器容纳5 ml或更少(例如,3、2或1 ml或更少) (例如,具有这样的最大工作能力)。在某些实施方案中,所述容器容纳0.2-1.5或0.5-2 ml。在某些实施方案中,所述容器是在多孔板或筒中的孔。在某些实施方案中,所述容器是试管。
在某些实施方案中,在自动化装置中实施所述方法。在某些实施方案中,在自动化装置中实施步骤(b)-(i)。在某些实施方案中,所述方法还包括从所述MGP洗脱核酸,例如,在自动化装置中。
在某些实施方案中,所述核酸是RNA。在某些实施方案中,所述核酸是DNA。在某些实施方案中,所述方法还包括反转录(例如,如果所述液体样品包括RNA)和/或PCR (例如,以扩增所述液体样品中的DNA或反转录cDNA产物)。在某些实施方案中,在有所述MGP存在下实施所述反转录和/或PCR。在某些实施方案中,在没有所述MGP存在下实施所述反转录和/或PCR,例如,在洗脱以后。在任一种情况下,所述反转录和/或PCR可以在用于分离的相同自动化装置上或在单独的自动化装置上自动化。
附图说明
图1显示了公开的用于连续捕获核酸的方法的一个实施方案,在最初的捕获轮以后有三轮从相同样品的核酸捕获。最初,将样品和磁性玻璃颗粒(MGP)在容器中混合(发生接触),将磁体施加于所述容器以收集核酸-结合的MGP,将未结合的液体吸出,并将磁体除去。图1表明,为珠子断开、混合和抽吸/分配的步骤加入另外的样品。如之前实施珠子捕获和未结合的液体(废裂解物)的除去。
发明详述
I. 介绍
大体积液体样品,例如,来自液体活组织检查、非侵袭性产前测试、和可能含有病原体(病毒、细菌、真菌)的流体,被越来越多地用于诊断测试。这些液体样品相对于与自动化相容的容器(例如,孔或试管)可以是大的,并且经常是稀的,具有低核酸浓度。本发明的方法允许使用一组磁性颗粒实施从大体积的液体的流线化和自动化核酸或蛋白捕获。将液体的等分试样在连续轮中暴露于磁性颗粒。对于每个连续轮,较多的珠子表面变成被来自液体样品的核酸或蛋白占据。通过进行连续轮,可以收集足够的核酸用于下游测定诸如PCR或测序。
所述方法包括:将磁性玻璃颗粒(MGP)暴露于液体样品的第一等分试样的一个最初轮,任选的混合,给所述MGP施加磁场以形成团块(球团),和将未结合的液体与所述MGP团块分离。然后将所述MGP团块暴露于所述液体样品的第二等分试样和物理地断开(例如,用移液器尖部或通过液体抽吸力)。然后将被断开的MGP分散(例如,均匀地分散)在第二等分试样中,从而允许MGP混合和结合样品中的核酸。再次将磁场施加于MGP以形成团块,并将未结合的液体除去。可以实施第三个、第四个、第五个或另外的连续轮,直到收集足够的核酸或蛋白,或直到整个液体样品已经暴露于MGP。
II. 定义
术语“磁性玻璃颗粒”或“MGP”表示这样的颗粒:其包含非共价地结合核酸的玻璃和至少一个与磁场对应的磁性芯(例如,磁性芯的分散体)。所述玻璃不一定是纯的二氧化硅,尽管二氧化硅可以是组分。MGP是足够小的以被吸入标准移液器尖部中并形成悬液(通常为0.5-15µm)。MGP一般而言是大致球形的,且可以是多孔的或无孔的。所述磁性芯可以是铁磁性的或顺磁的(仅在有磁场存在下被磁化)。合适的MGP更详细地描述在例如美国专利号6255477和6545143中。术语“球团”、“团块”等术语表示在有磁场存在下形成的MGP的聚集。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”表示核苷酸(例如,核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物,且包括天然存在的(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度(例如,单体的数目)限制。核酸可以是单链的或双链的,且通常含有5’-3’磷酸二酯键,尽管在某些情况下,核苷酸类似物可能具有其它键。单体通常被称作核苷酸。术语“非天然的核苷酸”或“修饰的核苷酸”表示这样的核苷酸:其含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸酯基团,或其在它的结构中掺入非天然的部分。非天然的核苷酸的例子包括双脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨的、烷基化的、苄基化的和荧光体-标记的核苷酸。
词语“蛋白”、“肽”和“多肽”表示氨基酸聚合物或两个或更多个相互作用的或结合的氨基酸聚合物的集合。该术语适用于这样的氨基酸聚合物:其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物、含有修饰的残基的那些和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”表示天然存在的和合成的氨基酸,以及与天然存在的氨基酸类似地起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些,以及以后经过修饰的那些氨基酸,例如,羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物,例如,与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳,例如,高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这样的类似物可以具有经修饰的R基团(例如,正亮氨酸)或经修饰的肽主链,但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物表示这样的化学化合物:其具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构,但是其与天然存在的氨基酸类似地起作用。
术语“抗体”表示包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段,其特异性地结合和识别抗原或任何期望靶标。通常,“可变区”含有抗体的抗原结合区(或它的功能等同物),并且在结合的特异性和亲和力中是最关键性的。参见Paul, Fundamental Immunology(2003)。
根据同种型可以描述完整抗体,如通过重链恒定区所定义的。将抗体轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、 μ、α、δ或ε,它们又分别定义同种型种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体可以作为完整的免疫球蛋白存在,或作为许多充分表征的包括特异性抗原结合活性的片段中的任一种存在。这样的片段可以通过不同肽酶的消化而产生。胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化抗体以产生F(ab)'2,即Fab的二聚体,其本身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链。可以将F(ab)'2在温和条件下还原以破坏铰链区中的二硫键,由此将F(ab)'2二聚体转化成Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的部分的Fab (参见Fundamental Immunology (Paul编, 第3版. 1993)。尽管以完整抗体的消化的方式定义各种抗体片段,技术人员会明白,可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成这样的片段。因而,本文中使用的术语抗体也包括通过完整抗体的修饰而产生的抗体片段,或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如,单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴别出的那些(参见,例如,McCafferty等人, Nature 348:552-554 (1990))。
术语“捕获”或“结合”在MGP结合核酸的背景下表示非共价结合,例如,通过离液的或离子的相互作用。通过洗脱,例如,使用干扰非共价相互作用的洗脱缓冲液,可以破坏MGP-核酸相互作用。该术语也可以表示MGP与蛋白的结合,例如,经由抗体-抗原、受体-配体或抗生蛋白链菌素-生物素相互作用。在这样的实施方案中,使靶标结合部分(例如,抗体)结合至MGP以允许液体样品中的靶标的特异性亲和纯化。
术语“引物”表示在合适的条件下作为通过核酸聚合酶合成多核苷酸链的起点起作用的短核酸(通常约8-40个、6-20个、12-50个或15-25个核苷酸的寡核苷酸)。除非另有描述,“延伸产物”是在合成后从引物的3’末端延伸的多核苷酸链。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当的缓冲液、dNTP和/或rNTP、和一种或多种任选的辅因子,并且在合适的温度下进行。引物通常包括至少一个可以杂交靶序列并至少与靶序列基本上互补的区域。该区域通常具有约15至约40个核苷酸的长度,且包括0、1、2或3个错配。
术语“扩增产物”表示扩增反应的产物。所述扩增产物包括用于开始每轮多核苷酸合成的引物。“扩增子”是为扩增被靶向的序列,且该术语也可以用于表示扩增产物。扩增子的5’和3’边界由正向引物和反向引物限定。
术语“样品”或“生物样品”表示含有或假定含有核酸的任何组合物。该术语包括纯化的或分离的细胞、组织或血液的组分,例如,DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。在本文公开的装置的上下文中,所述样品是液体,例如,血液或血液组分(血浆或血清)、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪液、淋巴液、脑脊液、口腔/喉冲洗液、支气管肺泡灌洗液、从拭子洗下的物质等。样品也可以包括从个体得到的细胞的体外培养物(包括细胞系)的成分和组分。所述液体样品还可以部分地从直接得自个体的样品加工,例如,细胞裂解物或除去了红血细胞的血液。
在本发明的上下文中,术语“未结合的液体”或“未结合的样品”表示没有与MGP结合的液体和其它组分(例如,蛋白性物质或细胞碎片),例如,除去了核酸或其它靶标的液体。所述未结合的液体可以仍然包括残余量的核酸或靶标。
细胞外囊泡(包括外来体、微泡和凋亡小体)是存在于生物流体(例如,血液和尿)中的细胞衍生的囊泡(膜包封体)。细胞外囊泡可以从细胞释放,例如,从质膜直接释放,或当多泡体与质膜融合时形成。细胞外囊泡通常包括组分诸如来自它们的起源细胞的核酸和蛋白。外来体通常具有40-120 nm的直径,微泡通常具有50-1000 nm的直径,且凋亡小体通常具有500-2000 nm的直径。
“对照”样品或值表示充当参照(经常是已知参照)的样品,其用于与测试样品或测试条件对比。例如,测试样品可以取自测试条件,例如,使用本文描述的方法加工的样品,并与来自已知条件的样品对比,例如,来自没有使用本文描述的方法加工过的样品,或来自具有已知量的核酸的样品。对照还可以代表从许多测试或结果收集的平均值或范围。还可以为反应条件制备对照。例如,关于核酸存在的阳性对照可以包括将检测已知存在于样品中的序列的引物或探针,而阴性对照将不含有核酸。本领域技术人员会认识到,可以设计对照用于评估任意数目的参数。可以设计对照用于体外应用。本领域技术人员会理解哪些对照在给定的情形下是有价值的,且能够基于与对照值的对比来分析数据。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如,如果给定参数的值在对照中宽泛地变化,测试样品中的变化不会被视作显著的。
除非另外定义,否则在本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见,例如,Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULARBIOLOGY, Elsevier (2007年第4版); Sambrook等人, MOLECULAR CLONING, ALABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y.1989); Ausubel等人: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley andSons, NY; Pfaffl, Methods: The ongoing evolution of qPCR, 第50卷(2010); vanPelt-Verkuil等人 Principles and Technical Aspects of PCR Amplification,Springer (2010)。
III. 连续核酸捕获的方法和组分
A. 生物样品
在本文公开的方法中使用的生物样品是包括核酸或蛋白的液体。样品类型包括血液(包括血浆或血清)、尿、唾液、精液、口或鼻冲洗液、脑脊液、痰、细胞悬液(诸如血液)、来自细胞或组织的裂解物等。所述样品可以来自单个个体(例如,患者)或个体群体。
本发明的方法还可以应用于液体,例如,从食品或植物样品或从表面拭物(例如,在医院场合)制备。
在包括细胞的样品中,可以将细胞分离出(例如,使用基于大小的过滤或离心),由此剩下无细胞的核酸(cfNA),包括在外来体、微泡、病毒颗粒中的核酸,或自由循环的那些。可替换地,在有MGP存在下或在将细胞裂解物加入MGP之前,可以将细胞裂解以得到细胞核酸。
B. 磁性玻璃颗粒
磁性玻璃颗粒(MGP)是本领域已知的,且描述在例如美国专利号6255477和6545143中。用于本文描述的方法的颗粒是铁磁性的。所述颗粒一般而言是大致球形的,具有0.5-15µm (例如,1-10、0.8-2或1-1.5µm)的直径。在某些实施方案中,所述颗粒是无孔的。
所述MGP可以具有单个被玻璃包被的磁性芯,或包含灌入了数个磁性物体的玻璃。所述磁性物质可以是铁或氧化铁如磁石(Fe3O4)或Fe2O3 (例如,γ-Fe2O3)。可以使用钡铁氧体、镍、钴、Al-Ni-Fe-Co合金或其它铁磁性的物质。在磁性芯中还可以包括金属氧化物,例如,氧化铝、氧化铁、氧化铬、氧化铜、氧化锰、氧化铅、氧化锡、氧化钛、氧化锌或氧化锆。
所述玻璃组分通常是基于二氧化硅的,例如,氧化硅和玻璃粉末、烷基二氧化硅、硅酸铝、或NH2-活化的二氧化硅。在某些实施方案中,所述玻璃包含至少一种金属氧化物(例如,SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和/或ZnO)。在某些实施方案中,按照摩尔百分比的次序,所述玻璃包含SiO2、B2O3、Al2O3、K2O和CaO。在某些实施方案中,按照摩尔百分比的次序,所述玻璃包含SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和ZnO。在某些实施方案中,除了SiO2以外,所述玻璃可以包括B2O3 (0-30%)、Al2O3 (0-20%)、CaO (0-20%)、BaO (0-10%)、K2O (0-20%)、Na2O (0-20%)、MgO (0-18%)、Pb2O3 (0-15%)、ZnO (0-6%)。在某些实施方案中,所述玻璃包含约70-75%SiO2、约14-16%B2O3、约4-6%Al2O3、约4-5%K2O、约2-3%CaO和约0-5%ZnO。适当的MGP可从得自Roche的MagNAPure试剂盒中商购得到。
核酸在离液溶液中结合MGP。离液溶液可以包括硫氰酸胍(GuSCN)、盐酸胍、脲、亚碘酸钠、高氯酸钠、硫氰酸根离子、碘离子、高氯酸根离子、硝酸根离子、溴离子、乙酸根离子、氯离子、氟离子或硫离子或它们的组合。在某些实施方案中,所述离液剂以约1-10 M(例如,2-8或4-6 M)在溶液中,以允许核酸结合。
C. 自动化
本发明的方法可以以手工的、半自动化的或自动化的形式实践。对于减少操作多个样品和多步过程所耗费的时间、样品之间和样品内在不同处理步骤的污染、重复损伤和向潜在有害物质(诸如血液样品)的暴露而言,自动化当然是有利的。
可以使用能够用MGP实施磁性分离的任何仪器。取决于装置,可以在多容器筒或平板中或在单个容器中处理样品。用于用在自动化仪器中的容器(例如,处理试管或孔)通常容纳50µl至4 ml(更通常1-2 ml)的液体体积。
可以用于使本文公开的方法自动化的仪器的例子包括、但不限于MagNA Pure仪器(Roche)、Dynamag®仪器(Thermo Fisher) QIAsymphony®系统(Qiagen)和Maxwell®仪器(Promega)。
在本文中,所述仪器可以实施整个过程,例如,从连续等分试样的大体积抽吸样品到处理容器中,在MGP上实施连续轮的核酸捕获,MGP磁性收集,除去未结合的液体,将MGP重新悬浮在下一个样品等分试样中,和从MGP洗脱核酸。在某些安排中,所述仪器在MGP上实施连续轮的核酸捕获,MGP沉降,除去未结合的液体,和将MGP重新悬浮在下一个样品等分试样中。在某些安排中,为连续轮多次使用同一个大液体样品。在某些安排中,用户或仪器将较大液体样品“预先等分”成多个等分试样,对它们接连地使用进行捕获等。
D. 进一步加工和检测
根据标准方法可以完成来自澄清的样品的核酸的进一步纯化,例如,如在Sambrook(出处同上)中所述。存在于液体活组织检查中的核酸经常是短的,例如,50-5000个核苷酸的长度。选择的纯化方法应当予以考虑。传统的方法包括有机提取、乙醇沉淀和重新悬浮;和在玻璃或磁珠上分离,随后洗脱。用于DNA和RNA的试剂盒也是商购可得的,例如,来自Roche的High Pure试剂盒和来自Promega的Wizard试剂盒。
通常在分析之前从珠子洗脱核酸,尽管MGP与某些测定相容(例如,检测与MGP上的核酸杂交的经标记的探针,PCR,或其中洗脱作为测定的部分发生,诸如DNA印迹法)。本领域技术人员会明白,洗脱条件会干扰核酸与MGP的非共价(例如,离液的或离子的)相互作用,例如,水,具有更低离液剂浓度(与用于使核酸结合MGP的浓度相比)的缓冲液和/或升高的温度。
纯化的核酸样品可以用于检测,例如,使用下一代测序、微阵列(RNA或DNA)、DNA或RNA印迹或核酸扩增,例如,使用任何引物依赖性的方法。基于DNA的方法可以用于扩增和检测,例如,PCR。在某些情况下,使用实时或定量PCR (RTPCR或qPCR)。qPCR允许在PCR过程的每个循环中产生的产物的可靠检测和测量。这样的技术是本领域众所周知的,且试剂盒和试剂是商购可得的,例如,来自Roche Molecular Systems, Life Technologies, Bio-Rad, 等。参见,例如,Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR vol.50。在某些情况下,支链引物-探针的探针部分被用猝灭剂和荧光团双重标记(例如,TaqMan、CPT、LNA或MGB探针) (参见,例如,Gasparic等人(2010) Anal. Bioanal. Chem.396:2023)。
在某些情况下,实施初步的反转录步骤(也被称作RT-PCR,不要与实时PCR混淆)。参见,例如,Hierro等人(2006) 72:7148。本文中使用的术语“qRT-PCR”表示定量PCR以后的反转录。两个反应可以没有间断(例如,添加试剂)地在单个试管中实施。例如,聚胸苷酸引物可以用于逆转录样品中所有具有聚腺苷酸尾巴的mRNA,或可以设计引物,其对将逆转录成cDNA的特定靶转录物是特异性的。所述cDNA可以形成要与本文描述的支链引物-探针一起使用的最初模板链或它的引物对或引物集合的其它成员。还可以使用另外的基于RNA的扩增方法,例如,基于核酸序列的扩增(NASBA)或转录介导的扩增(TMA)。
检测装置是本领域已知的,且可以选择成对于选择的标记而言适当的。
适用于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统(Roche)、PRISM7000和7300实时PCR系统(Applied Biosystems)等。
通过干扰它们与附着于珠子的靶标结合部分的相互作用,可以洗脱蛋白。可以使用升高的温度,或通过改变pH或盐浓度。对于抗生蛋白链菌素-生物素相互作用,可以使用甲酰胺溶液。
通常使用免疫测定或活性测定来检测蛋白。免疫测定包括不同类型的ELISA、蛋白质印迹、FACS或使用经标记的抗体的其它检测(参见,例如,Rich, The Immunoassay Handbook (Elsevier第4版2013))。技术人员会理解如何根据靶向的蛋白检测适当的活性测定,例如,激酶靶标的磷酸化活性。
IV. 实施例
在可以适应0.5-2 ml范围内的样品体积的典型自动化平台中提供了从大体积的液体(例如,4 ml或更多)纯化核酸的方法。所述方案是使用在MGP上的连续核酸捕获轮,如在图1中所示。
实施例1
将已知量的纯化的细胞系DNA和线性化的质粒掺入PBS中,并通过qPCR测量回收百分比(收率)。将四(4) ml样品在适当大小的试管中与4.5 ml MagNAPure 96裂解缓冲液(Roche)和蛋白水解酶K一起在离板(off-board)裂解。将裂解物涡旋以混合,并然后加到仪器1或仪器2的仪器平台上。将裂解的样品的等分试样加入处理孔中用于在MGP上的自动化核酸捕获。在初步步骤中加入MGP,并通过抽吸与样品混合。使用施加于处理孔的侧壁的磁体捕获MGP,并吸出裂解物,在处理孔中仅剩下核酸结合的MGP。将相同样品的下一个等分试样加入相同处理孔并与MGP混合。所述混合包括通过在孔的底部抽吸来断开磁化的MGP的团块。在此时,将珠子悬浮于液体体积的下一半。将珠子悬液从处理孔的底部抽吸并分配在顶部,从而允许MGP在液体中慢慢移动。重复该过程以确保MGP被彻底暴露于第二等分试样中的核酸。如在第一轮中重复MGP捕获和吸出步骤,并将样品的下一个等分试样加入相同的处理孔中,与MGP混合等。使用相同的MGP在相同处理孔中处理8.5 ml的总样品体积。
使用基线方案1 (缺少珠子断开,但是包括一些吸出和分配)的结合/珠子捕获的应用表明,基因组DNA和线性化的质粒以合理效率捕获在仪器1上(分别是78.6%和79.8%),其与在仪器2上的结合/珠子捕获是相当的(分别是81.7%和85.2%)。
使用经修改的上述方法(方案2)对比了结果,如在图1中所示。方案2(其包括磁化的MGP的机械重新悬浮和混合)导致β珠蛋白的回收率的10.7%增加和pEF056的回收率的22.2%增加。所有连续轮使用该经修改的方案2。结果显示在表1中。
表1:可以以极好的DNA结果收率执行核酸的结合和连续珠子捕获轮
** 两次纯化的平均值。
实施例2
如在图1中所示,重复珠子断开方法。在该实施例中,将已知量的靶DNA片段掺入血液中,并通过qPCR测量回收百分比(收率)。使用八(8) ml血浆,这要求将4个等分试样应用于珠子,将所述珠子在所有4轮核酸结合中重复使用。另外,极大地降低了用于在连续结合轮以后从珠子除去核酸的洗脱温度。这(可能与用作靶标的小片段长度组合)导致了与表1中所示的那些相比更低的收率。
如果珠子不能在连续轮中有效地结合靶核酸,可以预见到的最大收率是25%,即,4轮中仅第一轮将产生靶核酸。但是,如在表2中所示,显著的靶核酸在连续轮中被结合并回收用于qPCR。
表2
PCR靶标 | 收率百分比 | CV (%) |
66 bp | 49.5% | 3.4 |
86 bp | 66.1% | 1.1 |
150 bp | 48.3 | 1.6 |
尽管为了清楚和理解的目的已经比较详细地描述了上述发明,但是本领域技术人员通过阅读本发明将清楚,可以在形式和细节上做出各种变化。例如,上述的所有组合物和技术可以用在不同的组合中。
Claims (15)
1.一种用于捕获液体样品中的核酸的自动化方法,所述方法包括:
(a)在允许来自所述液体样品的核酸非共价地结合磁性玻璃颗粒(MGP)的条件下在容器中使所述液体样品的第一等分试样与MGP接触,其中所述MGP是无孔的且包含至少一个在玻璃中的铁磁性的磁性芯;
(b) 给所述MGP施加磁场以形成MGP的团块;
(c) 从所述MGP的团块除去未结合的液体样品;
(d) 使所述液体样品的第二等分试样与所述MGP的团块接触;
(e) 通过在容器的底部抽吸以断开MGP的团块将所述MGP重悬于所述液体样品的第二等分试样的下一半中;
(f) 将所述容器中的MGP从所述第二等分试样的下一半抽吸至所述第二等分试样的顶部并由此在所述第二等分试样中分配所述MGP;
(g) 给所述MGP施加磁场以形成MGP的团块;
(h) 从所述MGP的团块除去未结合的液体样品;和
(i)为液体样品的至少一个另外等分试样任选地重复步骤(d)至(h)。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述MGP具有在0.5-15µm之间的平均直径。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述玻璃包含至少一种金属氧化物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述至少一种金属氧化物选自SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和ZnO。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述液体样品是血液、血浆、血清、尿或其裂解物。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述液体样品具有至少2 ml的体积。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述液体样品具有2 ml至100 ml的体积。
8.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中所述容器容纳0.5 ml至2 ml的体积。
9.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,所述方法还包括从所述MGP洗脱和分离所述核酸。
10.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中步骤(e)包括抽吸所述液体样品中的MGP。
11.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中所述核酸是RNA。
12.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中所述核酸是DNA。
13.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中所述容器是多孔板中的孔或试管。
14.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中步骤(c)包括从所述MGP除去未结合的液体样品,洗涤所述MGP,和从所述MGP除去未结合的物质。
15.根据权利要求1、2、4和7中的任一项所述的方法,其中步骤(h)包括从所述MGP除去未结合的液体样品,洗涤所述MGP,和从所述MGP除去未结合的物质。
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