CN109072234B - 基于蛋白质的样品采集基质和装置 - Google Patents

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Abstract

本文提供了使用基于蛋白质的样品收集基质有效地分离核酸的方法和组合物。

Description

基于蛋白质的样品采集基质和装置
发明背景
从固体或半固体收集基质中回收核酸在分子诊断中被广泛接受。基质的典型实例包括拭子和纸基底。因为从基底材料中的无效提取，以及使用移液或其他液体处理装置的材料的潜在干扰，从这些材料中回收核酸可以是挑战性的。另外，仪器中固体物质的存在可以触发错误信号，导致中止提取或其他延迟。
通过使用苛刻和/或毒性条件例如苯酚/氯仿可以增强核酸回收的效率，并且实际上这已用聚合物拭子进行尝试。然而，现有的固体基底不溶于胍盐和其他较温和的离液溶液中。
发明概述
本文提供的是基于蛋白质的样品收集基质，其允许有效的核酸回收、与仪器的相容性、以及离液缓冲剂（例如，基于胍盐）的应用。
本文提供的是用于从生物样品中收集核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含a）配置为收集样品的基于蛋白质的基质；以及b）溶液，其包含约3-6M离液剂、约0.5-10%去污剂、约50-500 mM还原剂和使溶液的pH维持在约5-8的缓冲剂。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质形成拭子。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质形成条带，以收集液体样品（例如，血液、血液组分、尿、唾液、粘液等）。在一些实施方案中，将基于蛋白质的基质润湿并且用作擦拭物，以从表面（例如，在医院或法医背景中或者在皮肤上）收集样品。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含处理容器，例如用于增溶结合样品的基于蛋白质的基质。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含过滤管、磁性玻璃珠（MGP）或用于分离目的分析物（例如核酸）的其他组分。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括洗涤缓冲液（或储备溶液或干燥的洗涤缓冲液组分以再水合）。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括洗脱缓冲液（或储备溶液或干燥的洗脱缓冲液组分以再水合）。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括蛋白酶，例如蛋白酶K。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括用于贮存结合样品的基于蛋白质的基质的容器。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基质包括丝，例如丝织物。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质进行修饰，例如以增加对于分析物的亲和力，例如用带正电荷的部分进行修饰以结合核酸。
在一些实施方案中，离液剂是胍盐或胍盐的组合。在一些实施方案中，去污剂是非离子型去污剂，例如聚多卡醇（polydocanol）或Tween。在一些实施方案中，还原剂是DTT或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，溶液的pH为5.8-7，例如6-6.8。
进一步提供的是用于收集样品中的核酸的方法，该方法包括使含有核酸的样品与基于蛋白质的基质接触，从而收集分析物。在一些实施方案中，该方法进一步包括将结合样品的基于蛋白质的基质置于容器中用于贮存。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质包括丝。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质经修饰的，例如以增加对于分析物的亲和力，例如用带正电荷的部分进行修饰以结合核酸，或用抗体部分进行修饰以结合特异性蛋白质靶。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使基于蛋白质的基质与溶液接触，所述溶液包含约3-6 M离液剂、约0.5-10%去污剂、约50-500 mM还原剂和使溶液的pH维持在约5-8的缓冲剂，从而增溶溶液中的基于蛋白质的基质。在一些实施方案中，将基于蛋白质的基质浸入溶液中至少5分钟，例如10-180分钟、20-60分钟等。在一些实施方案中，将溶液和基于蛋白质的基质加热例如到30-60℃，以加速基质的溶解。在一些实施方案中，离液剂是胍盐或胍盐的组合。在一些实施方案中，去污剂是非离子型去污剂，例如聚多卡醇或Tween。在一些实施方案中，还原剂是DTT或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂。在一些实施方案中，溶液的pH为5.8-7，例如6-6.8。
在一些实施方案中，该方法进一步包括使溶液与过滤管或磁性玻璃珠（MGP）接触，用洗涤缓冲液洗涤过滤管或MGP，并且用洗脱缓冲液从过滤管或MGP中洗脱核酸，从而从样品中分离核酸。在一些实施方案中，样品是液体样品，例如血液、血液组分、尿、唾液、粘液等。在一些实施方案中，将基于蛋白质的基质润湿并且用作擦拭物，以从表面（例如，在医院或法医背景中或者在皮肤上）收集样品。
附图简述
图1显示了三个管，每个管含有在不同溶液中的基于蛋白质的基质条带（丝）。
图2显示了离液溶液（4 M硫氰酸胍）对基于蛋白质的基质的作用。
图3显示了蛋白酶K溶液对基于蛋白质的基质的作用。
图4显示了离液溶液和蛋白酶K（最终浓度2 M硫氰酸胍）的50-50混合物的作用。
发明详述
I. 引言
本文提供的是基于蛋白质的样品收集基质，其允许有效的核酸回收、与仪器的相容性、以及离液缓冲剂（例如，基于胍盐）的应用。基于蛋白质的基质可以用于收集样品和结合样品中的核酸。核酸无需从基质中洗脱或以其他方式去除，因为基于蛋白质的基质溶解于离液溶液中。这导致有效的核酸回收。溶解的（增溶的）蛋白质也不会干扰移液或检测仪器。取决于预期用途，基质也可以方便地形成为各种形状。例如，条带可以用于收集液体样品（例如，血液或唾液液滴），拭子可以用于收集细胞样品（例如，颊或宫颈），或者擦拭物可以用于就来自任何来源的微生物或核酸的存在（例如，在医院或法医环境中）测试表面。
基于蛋白质的基质可以用作初始核酸捕获步骤，并且与例如使用固体支持物的另外的核酸纯化步骤组合。可替代地，增溶的核酸-蛋白质溶液可以直接用于检测测定中。
II. 定义
术语“基于蛋白质的基质”或“基于蛋白质的基底”指主要由蛋白质组成的物质，其可以用于捕获生物样品的组分，包括样品中的核酸、蛋白质等，同时保持不溶于水和生理液体中。然而，基于蛋白质的基质可以在如本文所述的离液条件下增溶（降解或分散）。可以用于基于蛋白质的基质中的蛋白质包括在水和生理样品条件下保持不溶的那些蛋白质，并且理想地可以形成为多重形式（扁平条带、孔、阵列位置、纤维拭子或擦拭物），并且在与皮肤或粘膜接触时是良好耐受的。实例包括但不限于丝、角蛋白、胶原、白蛋白、乳蛋白及其任何数目的组合。基于蛋白质的基质的非蛋白质组分可以包括改善所需分析物的吸附、特异性靶向或稳定，或者改善基质的机械性质的材料。
术语“固体（或半固体）载体”在本文中用于指示试剂例如核酸可以固定至其的惰性表面或主体。非限制性实例包括玻璃、二氧化硅、塑料、硝化纤维素、膜、芯片和颗粒（例如磁性玻璃颗粒或MGP）。
例如提及溶液中的固体支持物的术语“在溶液中”，可以指示固体支持物暴露于溶液（例如，与溶液中的试剂接触）或固体支持物本身在溶液中（例如，悬浮于液体中的珠或颗粒）。该术语用于区分其中基质实际上在液体中增溶、溶解或降解的情况，以及其中颗粒保持完整但悬浮于溶液中的情况。
术语“贮器”、“容器”、“管”、“孔”、“腔室”、“微腔室”等指可以容纳干燥和/或液体组分、基质、试剂或测定的容器。如果贮器在试剂盒中并且容纳携带样品的基质、试剂或扩增反应，则可以将它封闭或密封以避免污染或蒸发。如果贮器待用于测定，则它至少在测定的设置期间可以是开放的或可接近的。
在结合核酸的基质或固体支持物的背景下，术语“固定（immobilize）”、“固定（immobilizing）”、“捕获（capture）”、“捕获（capturing）”、“结合（bind）”或“结合（binding）”指非共价结合。固定可以包括其中样品保留在基于蛋白质的基质中的空隙内的吸收，和/或其中样品组分被吸引到基于蛋白质的基质的表面的吸收。样品通常在本文所述的基于蛋白质的基质上干燥或捕获，使得核酸粘附至基质。适合于构建基于蛋白质的基质的天然蛋白质可以对目的分析物具有有限的亲和力，因此天然蛋白质可以与具有更高亲和力的不同蛋白质或多肽序列（例如，带正电荷的氨基酸，以吸引带负电荷的核酸）连接或混合。这种混合蛋白质可以重组生产，或通过部分水解进行修饰以改变等电点。还可以通过引入结构或化学部分来修饰蛋白质，以增加所需分析物的保留。修饰包括抗体、半抗原以及硫醇、胺和羧酸部分。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指核苷酸（例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的聚合物，并且包括天然存在的（腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷）、非天然存在的和经修饰的核酸。该术语不受聚合物的长度（例如，单体数目）限制。核酸可以是单链或双链的，并且一般含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他键合。单体通常称为核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“经修饰的核苷酸”指含有经修饰的含氮碱基、糖或磷酸基的核苷酸，或者在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸、生物素化的、胺化的、脱氨基的、烷基化的、苄化的和荧光团标记的核苷酸。
术语“引物”指短核酸（寡核苷酸），其在合适的条件下充当通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成的起始点。多核苷酸合成和扩增反应通常包括适当缓冲剂、dNTP和/或rNTP、以及一种或多种任选的辅因子，并且在合适的温度下进行。引物通常包括至少一个靶杂交区域，其至少与靶序列基本上互补（例如，具有0、1、2或3个错配）。该区域的长度通常为长度约8至约40个核苷酸，例如12-25个核苷酸。术语“探针”指能够选择性结合特异性预期的靶生物分子的任何分子。例如，探针可以是与目的核酸序列具有互补序列的核酸。
词语“互补的”或“互补性”指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一种核酸形成碱基对的能力。例如，序列A-G-T（RNA为A-G-U）与序列T-C-A（RNA为U-C-A）互补。互补性可以是部分的（其中仅一些核酸根据碱基配对匹配）或完全的（其中所有核酸都根据碱基配对匹配）。如果探针或引物与靶序列至少部分互补，则它被视为对于靶序列“特异性的”。取决于条件，与靶序列的互补性程度对于较短的核酸例如引物通常高于（例如，大于80%、90%、95%或更高）较长序列。
在两种或更多种核酸、或者两种或更多种多肽的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”指如使用具有缺省参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查测量，相同的或者具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸的两个或更多个序列或子序列（当在比较窗或指定区域上就最大对应进行比较且比对时，例如约60%的同一性，例如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性中的任一种）。参见例如在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST处的NCBI网站。此类序列随后被视为是“基本上相同的”。通常在最佳比对序列上确定同一性百分比，使得该定义适用于具有缺失和/或添加的序列、以及具有取代的那些序列。本领域常用的算法考虑了间隙等等。通常，同一性存在于包含长度至少约8-25个氨基酸或核苷酸的序列的区域上、或长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上、或参考序列的整个长度上。
术语“试剂盒”指包括至少一种试剂的任何制品（例如包装或容器），所述试剂例如如本文所述的为用于捕获、加上标签/转换、扩增或检测RNA或DNA的溶液或缓冲剂。
术语“样品”或“生物样品”指含有或推测含有核酸的任何组合物。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分离的组分，例如DNA、RNA、蛋白质、无细胞部分或细胞裂解产物。在目前公开的装置的背景下，样品是液体，例如血液或血液组分（血浆或血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、泪、淋巴液、脑脊髓液、口腔/咽喉冲洗、支气管肺泡灌洗、从拭子洗涤的材料等。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物的组成成分和组分，包括细胞系。液体样品也可以从直接得自个体的样品中部分处理，例如细胞裂解产物或耗尽红血细胞的血液。
在本公开内容的上下文中，术语“未结合的液体”或“未结合的样品”指未与固体支持物或MGP结合的液体和其他组分（例如，蛋白质材料或细胞碎片），例如耗尽核酸或其他靶的液体。未结合的液体可能仍包括残留量的核酸或靶。
“对照”样品或值指充当用于与测试样品或测试条件比较的参考，通常为已知参考的值。例如，对照可以对于反应条件进行制备。例如，关于核酸存在的阳性对照可以包括检测已知存在于样品中的序列的引物或探针（例如管家基因，例如β肌动蛋白、β珠蛋白、DHFR或琥珀酸脱氢酶，或例如具有指定长度的已知添加的多核苷酸）。阴性对照的实例是不含核酸的对照，或者包括对于序列特异性的引物或探针的对照，所述序列不存在于样品中，例如来自不同物种。对照还可以表示从多个测试或结果中收集的平均值或范围。技术人员将理解，阳性和阴性对照的选择将取决于特定测定，例如，使得对照是细胞类型和生物体适当的。本领域技术人员将认识到，对照可以设计用于评估任何数目的参数，例如蛋白质溶解度、核酸稳定性、核酸产率等。对照对于确定数据的显著性也是有价值的。例如，如果关于给定参数的值在对照中广泛变化，则测试样品的变化将不被视为显著的。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与由本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。参见例如，Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier（第4版2007）；Sambrook等人，MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, ColdSprings Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。术语“一个”或“一种”预期意指“一个或多个/一种或多种”。当在步骤或元件的叙述之前时，术语“包含（comprise）”、“包含（comprises）”和“包含（comprising）”预期意指更多步骤或元件的添加是任选的并且不排除。
III. 含有核酸的样品
用于核酸扩增的样品可以从怀疑含有核酸的任何来源获得。在一些实施方案中，样品是液体样品，例如尿、唾液、血液或血液级分（例如血浆或血清）、细胞培养物、泪、精液、淋巴液、乳、胎盘液、粘液和非基于动物的液体。在一些实施方案中，将样品收集在拭子或擦拭物上，例如粘膜组织、颊样品、阴道或宫颈样品、皮肤或来自器械或表面擦拭物的样品。样品可以是细胞的或非细胞的。
在包括细胞的样品中，可以分离出（例如，使用基于大小的过滤或离心）细胞，从而留下无细胞核酸（cfNA），包括外来体、微泡、病毒颗粒中的核酸或自由循环的核酸。可替代地，在基于蛋白质的样品收集基质的存在下、或在将细胞裂解产物加入基于蛋白质的样品收集基质之前，可以裂解细胞以获得细胞核酸。
IV. 用于增溶基于蛋白质的基质的溶液
本文所述的基于蛋白质的基质保留其结构，并且将核酸结合在水和生理学上可接受的液体中，但丧失结构并且可以在高度离液溶液中增溶。在一些实施方案中，溶液中的离液剂浓度为2 M或更高，例如约3-8 M、3-6 M、3.5-5.5 M、3.5-5 M、3 M、4 M、5 M、6 M、7 M或8 M（例如，直到溶解度的限制）。离液剂用于破坏膜，使蛋白质变性并且使其与核酸解离，并且抑制核酸酶活性。适当的离液剂包括硫氰酸胍、盐酸胍、异氰酸胍、碳酸胍、尿素、碘化钠、高氯酸钠、三氯乙酸钠、硫脲及其任何数目的组合。
增溶溶液可以包括其他组分，例如去污剂、还原剂、螯合剂和/或缓冲剂。在一些实施方案中，溶液包含约3-6 M离液剂、约0.5-10%去污剂、约25-500 mM还原剂和使溶液的pH维持在约3.5-8下的缓冲剂的溶液。在一些实施方案中，溶液包含约3.5-5 M离液剂、3-5%去污剂、100-150 mM还原剂和以pH 6-6.5的柠檬酸盐缓冲剂，其中柠檬酸盐浓度范围为10-500 mM，例如30 -200 mM。在一些实施方案中，柠檬酸盐缓冲剂包含30 mM柠檬酸钠和0.48mM柠檬酸。
合适当的去污剂包括非离子型去污剂（例如聚多卡醇、Tween 20、Tween 80、Triton X100、Igepal、NP-40）和离子型去污剂（例如肌氨酸、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基硫酸锂（LDS）、牛磺脱氧胆酸钠（NaTDC）、NaTC、甘氨胆酸钠（NaGC）、脱氧胆酸钠（NaDC）、胆酸钠、NaABS、N-月桂酰肌氨酸（NLS））、盐及其任何数目的组合。在一些实施方案中，去污剂在溶液中以约0.5-10%，例如2-5%、3-6%、约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%存在。
还原剂破坏二硫键和蛋白质结构，并且使核酸酶失活。适当的还原剂包括二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、2-巯基乙胺、2-氨基乙硫醇、三（羧乙基）膦（TCEP）及其任何数目的组合。在一些实施方案中，还原剂以25-500 mM，例如50-300 mM、80-200 mM、100-150 mM、或约100 mM、130 mM、150 mM或200 mM存在于溶液中。
适当的缓冲剂可以用于将溶液的pH维持在约3.5-8，例如约5-7或约6-6.5下。可以如本文所述使用的缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲系统，例如包括柠檬酸和柠檬酸钠。另外的适当缓冲剂包括三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）、N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸（BES）、1,3-双（三（羟甲基）甲氨基）丙烷（Bis-Tris）、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）、N,N-双（2-羟乙基）甘氨酸（Bicine）、N-[三（羟甲基）甲基]甘氨酸（Tricine）、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸（ADA）、N-（2-乙酰氨基）-2-氨基乙磺酸（ACES）、哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）（PIPES）、碳酸氢盐、磷酸盐、EDTA及其任何数目的组合。柠檬酸钠和EDTA也可以充当螯合剂。本领域技术人员将了解，缓冲剂浓度可以根据缓冲剂和样品类型的选择而变化，并且可以使用相容的酸或碱调整pH。
V. 核酸分离和检测
用于从生物样品中分离核酸的方法是已知的，例如如Sambrook中所述，并且几种试剂盒是商购可得的（例如，可从Roche获得的DNA Isolation Kit for Cells andTissues、DNA Isolation Kit for Mammalian Blood、High Pure FFPET DNA IsolationKit、High Pure RNA Isolation Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、以及MagNAPure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit）。在一些实施方案中，如本文所述的核酸和增溶的基于蛋白质的基质可以用作用于核酸分离方法的输入，使得核酸与蛋白质和其他组分分开。
在一些实施方案中，核酸分离涉及使用例如在过滤管中的过滤器，例如玻璃纤维过滤器。在一些实施方案中，核酸分离涉及使用固体或半固体支持物，例如颗粒（例如，微粒或珠）。在任一情况下，核酸都固定在过滤器或微粒上，而其他组分不结合或以比核酸更低的亲和力结合。
在一些实施方案中，微粒是磁性玻璃颗粒（MGP）。MGP包含非共价结合核酸的玻璃，以及响应磁场的至少一个磁芯（例如，磁芯的分散体）。玻璃不一定是纯二氧化硅，尽管二氧化硅可以是一种组分。MGP足够小以在标准吸管端中移液，并且形成通常为0.5-15 um的悬浮液。MGP平均大致为球形，并且可以是多孔的或无孔的。磁芯可以是铁磁的或顺磁的（仅在磁场的存在下被磁化）。合适的MGP在例如美国专利号6255477和6545143中更详细地描述。
过滤器或MGP的玻璃组分通常是基于二氧化硅的，例如氧化硅和玻璃粉、烷基硅（alkylsilica）、硅酸铝、或NH2活化的二氧化硅。在一些实施方案中，玻璃包含至少一种金属氧化物（例如，SiO2、B2O3、Al2O3、K2O、CaO和/或ZnO）。核酸在离液溶液中与玻璃结合。如上文指示的，离液溶液可以包括硫氰酸胍（GuSCN）、盐酸胍（guanindine hydrochloride）、尿素、碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸根离子、碘离子、高氯酸根离子、硝酸根离子、溴离子、乙酸根离子、氯离子、氟离子、或硫离子或其组合。在一些实施方案中，离液剂以约1-10 M，例如2-8或4-6 M存在于溶液中，以允许核酸结合。
洗涤溶液可以用于去除未结合的组分，例如蛋白质、盐等。洗涤溶液应该保留与固体支持物结合的核酸，这可以例如通过使用在酸性pH下的洗涤或通过维持离液剂的浓度来完成。
核酸通常在分析之前从任何固体支持物中洗脱，尽管MGP与一些测定相容（例如，检测与MGP上的核酸杂交的标记探针、PCR、或其中洗脱作为测定的部分发生，例如DNA印迹）。洗脱缓冲液干扰核酸与MGP的非共价（例如，结合或离子）相互作用，例如水、具有pH >7或者比用于将核酸与MGP结合的更低的离液浓度或离子强度的缓冲剂、和/或升高的温度，如本领域技术人员了解的。
纯化的核酸样品可以用于检测，例如使用下一代测序、微阵列（RNA或DNA）、DNA或RNA印迹、或核酸扩增，例如使用任何引物依赖性方法。基于DNA的方法可以用于扩增和检测，例如PCR。在一些实施方案中，使用实时或定量PCR（RTPCR或qPCR）。qPCR允许可靠地检测和测量在PCR过程的每个循环期间生成的产物。这些技术是本领域众所周知的，并且试剂盒和试剂是例如从Roche Molecular Systems、Life Technologies、Bio-Rad等商购可得的。参见例如，Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR第50卷；PCR Strategies（Innis等人，1995, Academic Press, San Diego, CA）在第14章处；PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications（Innis等人，Academic Press, NY,1990）。
在一些实施方案中，进行初步逆转录步骤，以制备与样品中的RNA互补的cDNA（也称为RT-PCR，不要与实时PCR混淆）。cDNA随后可以用作用于PCR的模板。参见例如，Hierro等人(2006) 72:7148。如本文使用的，术语“qRT-PCR”指逆转录，随后为定量PCR。两种反应均可以在单个管中进行而不中断，例如以添加试剂。例如，聚T引物可以用于逆转录样品中具有聚A尾的所有mRNA，或者可以设计对于特定靶转录物特异性的引物，所述特定靶转录物将被逆转录成cDNA。还可以使用另外的基于RNA的扩增方法，例如基于核酸序列的扩增（NASBA）或转录介导的扩增（TMA）。
检测装置是本领域已知的，并且可以如对于所选标记适当地选择。适合于定量PCR的检测装置包括cobas®和Light Cycler®系统（Roche）、PRISM 7000和7300实时PCR系统（Applied Biosystems）等。
VI. 试剂盒
在一些实施方案中，用于进行本文公开的方法的试剂和材料包括在试剂盒中。
在一些实施方案中，用于捕获核酸的试剂盒包含基于蛋白质的基质。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质形成为条带、拭子或擦拭物。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质基本上由选自丝、胶原、角蛋白、白蛋白和乳蛋白的蛋白质组成。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质是选自丝、胶原、角蛋白、白蛋白和乳蛋白的两种或更多种蛋白质的组合。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质被灭菌且密封。在一些实施方案中，基于蛋白质的基质被形成为条带，并且封装在非蛋白质覆盖物（例如纸、纸板、塑料等）中，具有暴露的区域以添加样品。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包括溶液，所述溶液包含约3-6 M离液剂、约0.5-10%去污剂、约50-500 mM还原剂和使溶液的pH维持在约3.5-8或5-8下的缓冲剂。在一些实施方案中，溶液包含3.5-5.5M胍盐。在一些实施方案中，溶液包含3-5%去污剂，例如非离子型去污剂。在一些实施方案中，溶液包含100-150 mM还原剂。在一些实施方案中，溶液包含以pH 6-7的缓冲剂（例如柠檬酸盐缓冲剂）。在一些实施方案中，溶液包含螯合剂。在一些实施方案中，溶液以浓缩形式（例如，5x或10x）提供，并且当稀释时，具有上文列出的浓度。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于从增溶的蛋白质中分离核酸的组分。在一些实施方案中，此类组分包括磁性玻璃颗粒（MGP）或微珠。在一些实施方案中，此类组分包括过滤管。在一些实施方案中，此类组分进一步包括洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液。在一些实施方案中，洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液以浓缩形式提供且在使用前稀释。
在一些实施方案中，试剂盒进一步包括至少一种对照，例如，容纳具有已知大小和浓度的核酸片段的基于蛋白质的基质。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括消耗品，例如用于核酸捕获和/或分开的板或管、用于样品收集的管等。在一些实施方案中，试剂盒包括用于在处理/增溶之前贮存基于蛋白质的基质的容器。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括使用说明、对网站的提及或软件。
VII. 实施例
实施例1：丝作为基于蛋白质的样品收集基质的评估
丝织物购自Jo Ann Fabrics并且切割成小条带。将条带加入三个试管的每一个中（图1）。三种不同的缓冲剂就增溶丝的能力进行测试，因此允许其被移液且处理用于下游核酸分离。
管1含有1 mL缓冲液（4 M硫氰酸胍、30 mM柠檬酸钠、129.6 mM二硫苏糖醇（DTT）、4%聚多卡醇、0.48 mM柠檬酸，pH6.2）。管2含有0.5 mL蛋白酶K溶液（10 mM Tris-HCL pH、1mM EDTA、5 mM CaCl2、5 mM Ca-EDTA、50%甘油、1 mg/ml蛋白酶K）。管3含有0.5 mL缓冲液和0.5 mL蛋白酶K溶液。
将管在55℃下温育30分钟，冷却并拍照。
如图2中所示，管1中的织造织物中的丝被显著破坏，伴随完整性的丧失。在悬浮液中存在可见的最低限度纤维。图3显示了蛋白酶K在管2中没有可检测的作用。图4显示了组合的缓冲剂导致丝织物的一些破坏。
结果指示基于蛋白质的基质可以用于样品收集并且在离液缓冲剂中有效增溶。
实施例3：在拭子中使用基于蛋白质的基质
拭子广泛用于分子诊断和分子法医学应用中。拭子用于物理保留来自表面的生物样品，包括在MRSA或CT/NG测试的情况下的人皮肤，或者在犯罪现场采样的情况下的惰性表面用于随后的人身份测试。拭子通常由在聚合物圆柱形塑料芯上支持的纺丝或织造的纤维性纤维素组合物制成，并且像这样它们不溶于常规的样品制备液体包括硫氰酸胍中。用由纺丝或织造的蛋白质材料（例如丝）制成的纤维材料产生的拭子仍具有纤维素拭子头的所有期望性质，只要它能够从皮肤或惰性表面取样生物样品。拭子可以收集且保存生物样品用于下游分子分析。
此类拭子可以有效地从表面收集生物材料，并且当悬浮在提取液中时，通过从蛋白质拭子中提取和回收生物材料的效率增加来增强后续分析。由于保留在拭子头内和周围的提取液的体积，从常规拭子中提取和回收生物样品的效率永远不是完全的。
基于蛋白质的（例如丝）拭子头可以溶解，留下固体芯。可替代地，固体芯可以由类似的蛋白质材料构成，使得整个拭子可以溶解并且允许悬浮的生物样品的转移，而没有通过固体芯与例如转移吸管的机械干扰。
实施例4：在织造织物中使用基于蛋白质的基质
该概念可以扩展超过拭子到其他形式，包括织造基底，例如织物。织造丝织物垫可以类似于上述拭子头捕获且释放生物样品。它们可以以多种形式包括过滤器配置，如空气采样中使用的。当用离液盐处理时，此类可溶性过滤材料提供了对更大量的捕获的生物材料的可及性。例如，这可以用于关于生物战剂的空气监测。

Claims (8)

1.一种用于从样品中分离核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a）配置为收集样品的基于蛋白质的基质；和
b）溶液，其包含3.5-5 M离液剂、3-5%非离子型去污剂、100-150 mM还原剂和使所述溶液的pH维持在6-6.5的柠檬酸盐缓冲剂，
其中所述基于蛋白质的基质形成拭子或条带，以收集液体，且是丝；且
其中所述离液剂是胍盐，所述去污剂是非离子型去污剂，且所述还原剂是二硫苏糖醇。
2.权利要求1的试剂盒，其进一步包含处理容器。
3.权利要求1-2中任一项的试剂盒，其进一步包含过滤管或磁性玻璃珠（MGP）。
4.权利要求1-3中任一项的试剂盒，其进一步包含洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。
5.权利要求1-4中任一项的试剂盒，其进一步包含用于贮存所述基于蛋白质的基质和样品的容器。
6.一种用于收集样品中的核酸的方法，所述方法包括：
- 在基于蛋白质的基质上接触含有核酸的样品，从而收集所述核酸，
- 将所述基于蛋白质的基质置于容器中用于贮存，并且
- 使所述基于蛋白质的基质与溶液接触，所述溶液包含3.5-5 M离液剂、3-5%非离子型去污剂、100-150 mM还原剂和使所述溶液的pH维持在6-6.5的柠檬酸盐缓冲剂，从而增溶所述溶液中的所述基于蛋白质的基质，
其中所述基于蛋白质的基质是丝；且
其中所述离液剂是胍盐，所述去污剂是非离子型去污剂，且所述还原剂是二硫苏糖醇。
7.权利要求6的方法，其中将所述基于蛋白质的基质浸入所述溶液中至少10分钟。
8.权利要求6-7中任一项的方法，其进一步包括使所述溶液与过滤管或磁性玻璃珠（MGP）接触，用洗涤缓冲液洗涤所述过滤管或MGP，并且用洗脱缓冲液从所述过滤管或MGP中洗脱所述核酸，从而从所述样品中分离所述核酸。
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