CN109929834B - 一种dna提取试剂盒和提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III以及洗脱缓冲液，裂解液中使用了巯基乙醇作为巯基还原剂，使用时裂解液和结合液以1:1的比例混合，洗涤液中使用了低浓度的NaAc进行离子平衡。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体地，本申请提供了一种包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III以及洗脱缓冲液的DNA提取试剂盒。
背景技术
核酸提取是各种分子生物学检测方法的基础，高效完整地提取DNA是PCR扩增、文库构建、测序等工作的基础。除组织器官样本外，分子生物学检测中最常用的离体样本为血液样本，但采血一方面需要专业人员使用无菌采血设备，成本和复杂程度较高，另一方面采血会给患者带来直接的疼痛和恐惧，受到很多人的排斥，由于以上原因，以血液样本进行分子生物学检测在许多情形下，特别是大范围筛查或鉴定中有诸多不便。
唾液属于可以无损伤轻易提取的生物样品，其成分与血清、血浆中存在较大差异：唾液为无色、无味、无嗅的液体；PH约6～7；粘度明显高于水；唾液中含有淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、粘蛋白、粘多糖、磷脂等物质；其中的粘蛋白、粘多糖是使唾液粘稠主要物质，也是唾液DNA提取中主要问题所在。酚氯仿法、盐析法、吸附柱法、免疫亲和法、磁珠法等现有DNA提取方法中可用于唾液DNA提取的主要有吸附柱法和磁珠法，但吸附柱法提取效果和所提取DNA浓度上都有明显不足，而磁珠法在操作简易型和提取效果上也有很多待改进之处。
发明内容
本申请通过选择合理的裂解液、结合液比例、去垢剂、巯基还原剂和各成分用量(特别是，选用去垢剂NaDC，洗涤时使用低浓度的NaAC保持离子平衡)构建了新型DNA提取试剂盒，实现了与市售进口产品类似或更好的提取效果。
一方面，本申请提供了一种DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III以及洗脱缓冲液。
进一步地，其中裂解液包含Tris、EDTA、NaCl、NaDC、NLS、GuHCl、TritonX100、NH4Cl、巯基乙醇；结合液包括异丙醇、PEG 8000、Brij 58；洗涤液I包括GuHCl、Tris、乙醇；洗涤液II包括乙醇、Tris；洗涤液III包括NaAc；洗脱缓冲液包括Tris、EDTA。
进一步地，其中裂解液包含Tris 40-60mM、EDTA 10-20mM、NaCl 0.1-0.9M、NaDC0.25％-0.7％、NLS 0.6％-0.9％、GuHCl 60％-75％、TritonX100 3％-5％、NH4Cl 0.15％-0.24％、巯基乙醇0.5％-2.5％，pH为7.0-8.5；结合液包括异丙醇65％-90％、PEG 80002％-10％、Brij 58 3％-5％，pH为7.0-8.5；蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 17-22mg/ml；洗涤液I包括GuHCl 2-7M、Tris 10-17mM、乙醇40％-60％，pH为7.5-8.5；洗涤液II包括乙醇70％-80％、Tris 10-15mM，pH为7.5-8.5；洗涤液III包括NaAc 10-20mM，pH为6.0-7.0；洗脱缓冲液包括Tris 10-20mM、EDTA 0.1-0.2mM，pH为8.5-9.5。
进一步地，其中裂解液包含Tris 55mM、EDTA 15mM、NaCl 0.3M、NaDC 0.5％、NLS0.5％、GuHCl 75％、TritonX100 2％、NH4Cl 0.15％、巯基乙醇0.5％，pH为7.0；结合液包括异丙醇65％、PEG 8000 10％、Brij 58 3％，pH为7.0；蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 20mg/ml；洗涤液I包括GuHCl 7M、Tris 10mM、乙醇40％，pH为7.5；洗涤液II包括乙醇70％、Tris15mM，pH为7.5；洗涤液III包括NaAc 10mM，pH为7.0；洗脱缓冲液包括Tris 20mM、EDTA0.2mM，pH为8.0。
另一方面，本申请提供了使用上述DNA提取试剂盒提取唾液DNA的方法。
进一步地，方法具体包括：
(1)取唾液或血液于离心管中，加入裂解液与结合液的混合液,再加入蛋白酶K溶液，最后加入磁珠；
(2)将离心管加热震荡，置于磁力分离架上，移走全部上清液；
(3)将离心管从磁力分离架中取出，加入洗涤液I，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
(4)加入洗涤液II，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
(5)加入洗涤液III，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
(6)加入洗脱缓冲液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，用将上清液移至另一离心管中；
(7)回收得到的DNA。
进一步地，方法具体包括：
(1)取200ul的新鲜唾液或血液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶K溶液，最后加入10ul磁珠；
(2)将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；
(3)将离心管从磁力分离架中取出，加入500ul洗涤液I，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(4)加入500ul洗涤液II，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(5)加入500ul洗涤液III，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(6)加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；
(7)回收得到的DNA，保存于-20℃。
另一方面，本申请提供了上述DNA提取试剂盒在制备PCR检测试剂盒中的用途。
进一步地，所述PCR检测试剂盒还包括PCR反应所用的试剂。
进一步地，所述PCR检测试剂盒用于诊断或非诊断目的。
上述技术方案中所使用的试剂如Tris、EDTA、NaCl、NaDC、NLS、GuHCl、TritonX100、NH4Cl、巯基乙醇、Brij 58、NaAc、EDTA、乙醇、异丙醇、PEG 8000，磁珠可以根据需要和产品性能选用进口或国产的各种型号。
当然本申请不仅可以从唾液样本提取DNA也可以从血液样本提取DNA。
可以根据PCR检测对DNA样本的要求，可以在本申请试剂盒基础上加入各种PCR反应试剂，包括但不限于引物、探针、聚合酶、MgCl2、dNTPs、PCR缓冲液等组成各种诊断或非诊断目的的PCR检测试剂盒，也可以将本申请的试剂盒可以与各种诊断或非诊断目的的PCR检测试剂盒配套使用。
附图说明
图1：裂解液和结合液比例优化(左条带为1:2的裂解液：结合液，右条带为1:1的裂解液：结合液)。
图2：不同巯基还原剂的效果验证(条带从左至右分别为DTT、TCEP、巯基乙醇、空白)。
图3：不同唾液样本量的效果验证(从左至右唾液样本的量依次为50ul、100ul、150ul、200ul)。
图4：本申请试剂盒与Baomanbio的效果对比(左条带为Baomanbio DP7003，右条带为本申请试剂盒)。
图5：本申请试剂盒不同血液样本量的效果验证(从左至右血液样本的量依次为50ul、100ul、150ul、200ul)。
具体实施方式
主要试剂和仪器
Tris、EDTA、NaCl、NaDC、NLS、GuHCl、TritonX100、NH4Cl、巯基乙醇、Brij 58、NaAc、EDTA由sigma生产；
乙醇、异丙醇、PEG 8000由国药集团生产；
磁珠由Qiagen生产(取自Magattract DNAKit)；
DP7003DNA提取试剂盒由Baomanbio生产。
检测样本来源
由于需要样本量较少，为简便起见，验证本申请试剂盒DNA提取效果时使用的唾液样本直接采集自申请人公司工作人员志愿者；
实际PCR检测时的样本来源来自合作医疗检测机构正常采集的样本。
实施例1试剂配制和基本提取过程
按照以下配方配制提取试剂1：
裂解液包含Tris 55mM、EDTA 15mM、NaCl 0.3M、NaDC 0.5％、NLS 0.5％、GuHCl75％、TritonX100 2％、NH4Cl 0.15％、巯基乙醇0.5％，pH为7.0；
结合液包括异丙醇65％、PEG 8000 10％、Brij 58 3％，pH为7.0；
蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 20mg/ml；
洗涤液I包括GuHCl 7M、Tris 10mM、乙醇40％，pH为7.5；
洗涤液II包括乙醇70％、Tris 15mM，pH为7.5；
洗涤液III包括NaAc 10mM，pH为7.0；
洗脱缓冲液包括Tris 20mM、EDTA 0.2mM，pH为8.0。
按照上述试剂1的配方(将巯基乙醇替换为DTT 0.5％)配制试剂2；
按照上述试剂1的配方(将巯基乙醇替换为TCEP 0.5％)配制试剂3；
按照以下步骤进行DNA提取：
(1)取新鲜唾液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液的混合液,再加入20ul蛋白酶K溶液，最后加入10ul磁珠；
(2)将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；
(3)将离心管从磁力分离架中取出，加入500ul洗涤液I，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(4)加入500ul洗涤液II，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(5)加入500ul洗涤液III，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
(6)加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；
(7)回收得到的DNA，保存于-20℃。
实施例2本申请试剂盒配方和使用方法的优化
1裂解液和结合液的比例
使用试剂1，以1:2和1:1的比例制备裂解液和结合液的混合液后提取同一份唾液样本后电泳检测，结果如图1所示，可见1:1的比例条带较深，提取效率较好。
2裂解液配方的优化
为验证不同巯基还原剂的效果，以实施例1中的试剂1、试剂2、试剂3提取同一份唾液样本(1:1裂解液：结合液)后电泳检测验证，结果如图2所示，可见三者中巯基乙醇和TCEP效果较好，结合成本考虑，选用巯基乙醇。
3唾液样本量选择
以实施例1中的试剂1提取同一份唾液样本(1:1裂解液：结合液)后电泳检测验证，结果如图3所示，可见唾液样本的量为150ul-200ul较为适宜。
4与现有DNA提取试剂盒的效果比较
以实施例1中的试剂1(1:1裂解液：结合液)以及实施例1中的试剂1对照(1:1裂解液：结合液，洗涤液III中使用200mM NaCl，可代表现有类似磁珠法DNA提取试剂盒)提取同一份唾液样本后，使用
(基于荧光染料法)检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的DNA浓度并检测OD 260/280，并在来自多人的多份唾液样本中验证。
| 所用试剂 | A 260/280 | DNA浓度(ng/uL) |
| 试剂1 | 1.802 | 17.984 |
| 试剂1对照 | 1.571 | 17.633 |
可见，本申请试剂盒中使用的低浓度NaAc(10mM)相比类似试剂盒中的高浓度(200mM)盐能有效的提高所提取DNA的质量。
以实施例1中的试剂1(1:1裂解液：结合液)以及Baomanbio DP7003DNA提取试剂盒提取同一份唾液样本后电泳检测验证，结果如图3所示，可见两者效果基本相当，本申请试剂盒的条带甚至比Baomanbio DP7003的略深。
为进一步验证，使用
(基于荧光染料法)检测仪以及配套的试剂盒检测所提取的DNA浓度并检测OD 260/280，并在来自多人的多份唾液样本中验证。
可见本申请试剂盒和Baomanbio试剂盒提取的DNA质量均较为理想，而且本申请试剂盒所提取的DNA浓度普遍略高于Baomanbio试剂盒，结合价格考虑，本申请的试剂盒是替代现有市售DNA提取试剂盒的良好选择。
实施例3使用本申请试剂盒进行实际检测
使用本申请的试剂盒提取3对6位待测者唾液(与血液样本同步采集)DNA用于亲子鉴定中的STR基因座分型(Promega Power Plex16，16个位点,ABI9700PCR仪器)，与血液中提取的DNA所作的分型相比较，6位待测者全部96的位点的分型情况完全相同。初步证明了本申请的试剂盒提取的样本可用于后续的分子生物学检测。
实施例4使用本申请试剂盒进行血液DNA提取
方法如实施例1所示，本申请试剂盒不同血液样本量的效果验证如图5所示，从左至右血液样本的量依次为50ul、100ul、150ul、200ul。
Claims (7)
1.一种DNA提取试剂盒，包括裂解液、结合液、蛋白酶K溶液、洗涤液I、洗涤液II、洗涤液III以及洗脱缓冲液；其中裂解液包含Tris 55 mM、EDTA 15 mM、NaCl 0.3 M、NaDC 0.5 %、NLS 0.5 %、GuHCl 75 %、TritonX100 2 %、NH4Cl 0.15%、巯基乙醇 0.5%，pH为7.0；结合液包括异丙醇 65%、PEG 8000 10%、Brij 58 3%，pH为7.0；蛋白酶K溶液包括蛋白酶K 20 mg/ml；洗涤液I包括GuHCl 7M、Tris 10 mM、乙醇40%，pH为7.5；洗涤液II包括乙醇 70%、Tris15mM，pH为7.5；洗涤液III包括NaAc 10mM，pH为7.0；洗脱缓冲液包括Tris 20mM、EDTA0.2mM，pH为8.0。
2.使用权利要求1的DNA提取试剂盒提取唾液DNA的方法。
3.根据权利要求2的方法，具体包括：
（1）取唾液于离心管中，加入裂解液与结合液的混合液,再加入蛋白酶K溶液，最后加入磁珠；
（2）将离心管加热震荡，置于磁力分离架上，移走全部上清液；
（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入洗涤液I，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
（4）加入洗涤液II，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
（5）加入洗涤液III，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，移走全部上清液；
（6）加入洗脱缓冲液，震荡，然后将离心管置于磁力分离架上处理，用将上清液移至另一离心管中；
（7）回收得到的DNA。
4.根据权利要求3的方法，具体包括：
（1）取200ul的新鲜唾液于1.5ml离心管内，然后加入总计400ul的裂解液与结合液1:1的混合液,再加入20ul蛋白酶K溶液，最后加入10ul磁珠；
（2）将离心管在60℃条件下震荡10分钟，将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内的磁珠完全被吸附，用枪头在不接触到磁珠的前提下尽可能地移走全部上清液；
（3）将离心管从磁力分离架中取出，加入500ul 洗涤液I，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
（4）加入500ul 洗涤液II，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
（5）加入500ul 洗涤液III，涡旋震荡离心管5-10次，使磁珠充分混匀，然后将离心管置于磁力分离架上1分钟，使得管内磁珠完全被吸附，移走全部上清液；
（6）加入100ul洗脱缓冲液，在60℃温度下震荡5分钟，然后将离心管置于磁力分离架上2分钟，用枪头将上清液移至另一干净离心管中；
（7）回收得到的DNA，保存于-20℃。
5.根据权利要求1的DNA提取试剂盒在制备PCR检测试剂盒中的用途。
6.根据权利要求5的用途，所述PCR检测试剂盒还包括PCR反应所用的试剂。
7.根据权利要求5或6的用途，所述PCR检测试剂盒用于诊断或非诊断目的。
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