CN115786327A - 一种无醇清洗液及其在新冠病毒核酸提取中的应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断技术领域,具体涉及一种无醇清洗液及其在新型冠状病毒核酸提取中的应用方法。本发明通过配置不含乙醇的清洗液以及配合无蛋白酶K的新冠检测试剂盒,科学配比,同时避免了两种组分带来的缺陷,且依然与现有的试剂盒的准确度、精确度等性能指标一致,且在安全性和重复性上均有所提高。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断技术领域,具体涉及一种无醇清洗液及其在新冠病毒核酸提取中的应用方法。
背景技术
核酸提取试剂盒(磁珠法)操作简便,可满足高通量、快速提取核酸的要求。现有的核酸提取试剂盒(磁珠法)主要组分包括:裂解液、蛋白酶K、清洗液、洗脱液。其原理是:待检测样本经裂解液裂解细胞释放核酸,磁珠特异性地吸附核酸分子,并利用磁性分离器使磁珠吸附于磁棒套,并通过洗涤、洗脱、纯化过程得到高纯度的核酸。
然而,目前的核酸提取试剂盒(磁珠法)存在一些缺陷,例如蛋白酶K需要单独包装、提取过程需单独添加的蛋白酶K,使操作繁琐,不适用于大批量的检测,市面上虽然也有不含蛋白酶K的核酸提取试剂盒,但是都添加了大量乙醇来沉降蛋白杂质,而面对大规模疫情形势,为确保及时检测,核酸提取试剂盒的需要大批量的航空运输,然而,以乙醇作为主要成分的清洗液因其易挥发、高温易燃,含有安全隐患,不适用于航空运输。
因此,寻求一种其不包含蛋白酶K,其清洗液又不添加乙醇的核酸提取试剂盒是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种无醇清洗液,将其应用于不含蛋白酶K的核酸提取试剂盒,达到了与现有的试剂盒相比,准确度、精确度等性能指标一致,且在安全性和重复性上均有所提高。
具体的,本发明的技术方案如下:
一种无醇清洗液,所述无醇清洗液的组分包括PEG、Tris-HCl、NaCl、异丙醇;所述PEG的浓度为5%~20%(v/v)。
进一步的,所述PEG的分子量为6000~10000。聚乙二醇PEG可沉淀核酸提取过程中的杂质,同时也避免了乙醇残留对下游实验的影响。无醇清洗液为钠盐和PEG溶液。钠盐为离子,核酸更好地与磁珠吸附。经PEG和钠盐的清洗去杂,可得到高纯度和高浓度的核酸产物。
所述表面活性剂为Tween-20、TritionX-100、NP-40、SDS的一种或者多种。
进一步的,所述无醇清洗液的成分和含量如下:
所述Tris-HCl的pH值为7.5~8.5。
本发明还提供无醇清洗液在新型冠状病毒核酸提取中的应用。
进一步的,所述无醇清洗液配合不含蛋白酶K的新型冠状病毒核酸提取试剂盒,实现对新型冠状病毒核酸的提取。
进一步的,一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒,包括无醇清洗液,还包括裂解液、洗脱液,不包括作为单独组分添加的的蛋白酶K及其溶液。
所述裂解液的组分包括胍盐、Tris-HCl、表面活性剂;
所述洗脱液由DEPC水组成。
进一步的,所述裂解液包括如下含量的组分:
所述洗脱液由DEPC水组成。
进一步的,所述裂解液还包括磁珠,所述磁珠为超顺磁性羟基纳米磁珠,浓度为20~100mg/ml。
本发明所述的无醇清洗液和新型冠状病毒核酸提取盒,适用于生物样本的核酸提取,所述生物样本包括咽拭子样本、鼻拭子样本、血液样本、唾液样本。
本发明所述的无醇清洗液和新型冠状病毒核酸提取盒,适用于全自动核酸提起仪,如BNP-96全自动核酸提取仪,利用实时荧光定量PCR进行测定利用进行测定,具体操作方法如下:
1.裂解液、清洗液和洗脱液三种试剂分别置于96人份深孔板。裂解液(含磁珠)置于板位1,加入量为600μL;清洗液置于板位2,加入量为500μL;洗脱液置于板位6,加入量为100μL。
2.在板位1(裂解液加磁珠)中加入200ul样本,样本需平衡至室温(请在加样1h内上机运行程序)。
3.按照提示将深孔板放入对应的板位,将磁棒套放入磁棒上。
4.选择程序“DNA-RNA-F”并运行,不同机型运行程序不同,具体程序见表1。
5.自动化程序结束后,将板位6的核酸取出,用封口膜封好保存于-80℃。
本发明的有益效果在于:
本发明的清洗液不含乙醇,提高了试剂盒的安全性,适合航空运输,此外,本发明的试剂盒还不包括作为单独组分添加的蛋白酶K,在无蛋白酶K及无醇的情况下依然与现有的试剂盒的准确度、精确度等性能指标一致,且在安全性和重复性上均有所提高。
本发明的核酸提取试剂盒与配套的核酸自动提取仪,通过完全自动化的方法,可快速、自动化地提取高纯度、高浓度的核酸。本发明所述的无醇清洗液和核酸提取试剂盒变异系数CV<4%,具有较好的重复性;精确性,其配伍性能良好,增加了试剂的稳定性和重复性。与市售各种试剂盒具有良好地匹配效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中本发明核酸提取试剂盒(含无醇清洗液)与竞争品对照组核酸提取试剂盒提取咽拭子样本的的核酸扩增曲线。
图2为本发明实施例2中本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取非定制质控品准确性试验的ct值。
图3为本发明实施例2中新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取非定制质控品重复性试验FAM通道的ct值。
图4为本发明实施例2中新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取非定制质控品重复性试验ROX通道的ct值。
图5为本发明实施例2中新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取非定制质控品重复性试验HeX通道的ct值。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
健康人咽拭子样本
本实施例新型冠状病毒核酸提取试剂包括裂解液、清洗液、洗脱液的成分和含量如下(磁珠购自洛阳吉恩特生物科技有限公司):
(1)试剂配制
配方1:
裂解液的成分和含量如下:
清洗液的成分和含量如下:
洗脱液由DEPC水组成。
配方2:
裂解液的成分和含量如下:
洗涤液的成分和含量如下:
洗脱液由DEPC水组成。
配方3:
裂解液的成分和含量如下:
洗涤液的成分和含量如下:
洗脱液由DEPC水组成。
注:本实验操作过程中,所有试剂均适用0.1%的DEPC水配置,所有耗材均无菌无RNA酶污染。
(2)核酸提取:
适用96深孔板按以下表2预分装试剂:
表2新型冠状病毒核酸提取试剂盒预分装
取200μl质控品分别加入A1-H1/A7-H7孔位中,每个样本重复三次,置于核酸自动提取仪进行核酸提取,按照表1DNA/RNA-F程序运行,程序运行结束,取A6-H6/A12-H12核酸提取产物进行核酸检测。
(3)核酸扩增
根据圣湘新型冠状病毒2019-nCOV核酸检测试剂盒(荧光OCR法)说明书要求,按照表3配置实时荧光定量PCR反应体系。
表3单人份扩增体系配制体系如下:
2019-nCOV反应液 | 2019-nCOV酶混合液 | 扩增体系 |
26μl | 4μl | 30μl |
将配置好的扩增体系置于PCR管中,加入20μl已提取的核酸产物,充分混匀,简短离心后备用。
置于ABI7500实时荧光定量PCR仪上运行表4中的程序:
表4 PCR反应程序
仪器运行结束后,导出数据,对检测靶基因以及内标的扩增曲线分别进行分析。
(4)实验结果
采用本发明提供的新型冠状病毒核酸提取试剂盒实施例1提取咽拭子样本,对比三种配方与对照核酸提取试剂盒的核酸扩增结果。
表5咽拭子样本核酸扩增结果:
实施例2
新型冠状病毒核算非定值质控品的核酸提取:
本实施例采用假病毒制备新冠病毒核糖核酸非定值质控品。新冠假病毒核糖核酸标准物质是将新冠病毒重要特征基因核衣壳蛋白N基因和开放阅读框ORF1ab基因片段克隆至慢病毒载体pCDH上,构建出包装有新冠病毒重要特征基因RNA的假病毒。新冠假病毒核糖核酸标准物质购自郑州标源生物科技有限公司,-70℃保存。
采用质控品验证新型冠状病毒核酸提取试剂盒,避免咽拭子样本因人为采集不规范或采样手法差异,造成的生物学重复差异,相比之下实验数据更具有参考意义。
表5配方1质控品核酸检测结果(ct值)
表6配方2质控品核酸检测结果(ct值)
表7配方3质控品核酸检测结果(ct值)
质控品提取后扩增ct值数据如表5、表6、表7,可以看出本发明核酸提取试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响,核酸提取试剂盒依然保持良好的提取效果。
实施例3
新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取咽拭子样本
(1)准确性实验
将3个实施例的新型冠状病毒核酸提取试剂盒作为实验组,市场上获得认可的准确度优异的含醇核酸提取试剂盒作为对照组进行对比实验,对10个样本进行检测,检测的结果如表8所示:对比无醇清洗液与有醇清洗液ct值,可以看出无醇清洗液的核酸提取效果均略优于对照组(含乙醇)提取效果。
表8新型冠状病毒核酸提取试剂盒重复性检测结果:
核酸提取试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的核酸提取试剂盒有高度一致性,进一步证明本发明核酸提取试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响,核酸提取试剂盒依然保持良好的准确度。具体见图2。
(2)重复性试验:
采用实施例3和对照组进行对照检测,分别检测质控品,重复测试10次,分别计算测量值的平均值和标准差,并计算出变异系数(C V),检测结果如表9所示:
表9新型冠状病毒核酸提取试剂盒重复性检测结果
由表可以看出,上述实施例3所得试剂重复性CV值均小于对照组变异系数3%,所以,本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒去除乙醇等物质,不会降低核酸提取效果等物质,可以有效提高试剂的重复性。
(3)稳定性实验:
采用核酸提取试剂盒测试质控品的扩增效果,。换算为浓度为1000U/L的样本。采用实施例3和对照组的试剂进行检测,测定结果如表10所示:
利用实施例3配方配制试剂,与对照组在2℃~8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂,实施例3和对照组试剂每3个月车采集咽拭子样本提取核酸测定三次取平均值,与新鲜的对照组试剂检测结果进行比对,从而确定试剂的稳定性。检测结果如表10所示:
表10新型冠状病毒核酸提取试剂盒稳定性试验检测结果
时间 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对照组 | 新鲜对照组 |
3个月 | 28.36 | 29.02 | 28.32 | 29.36 | 28.05 |
6个月 | 28.45 | 29.19 | 28.47 | 28.23 | 28.29 |
9个月 | 29.36 | 28.67 | 29.28 | 30.74 | 28.74 |
12个月 | 28.69 | 29.03 | 28.69 | 34.41 | 28.19 |
从表4可以看出,对照组试剂在2℃~8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存9个月稳定,而实施例3新型冠状病毒核酸提取试剂盒在2℃~8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存12个月稳定,说明实施例2在2-8℃和无腐蚀性气体储存条件下比市场常见的新型冠状病毒核酸提取试剂盒更加稳定。
综上所述,本发明的一种无醇清洗液和新型冠状病毒核酸提取试剂盒具有较好的准确性、重复性和稳定性。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种无醇清洗液,其特征在于,所述无醇清洗液的组分包括PEG、Tris-HCl、NaCl、异丙醇;所述PEG的浓度为5%~20%(v/v)。
3.权利要求1所述的无醇清洗液在新型冠状病毒核酸提取中的应用。
4.权利要求3所述的应用,其特征在于,所述无醇清洗液配合不含蛋白酶K的新型冠状病毒核酸提取试剂盒,实现对新型冠状病毒核酸的提取。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述新型冠状病毒核酸提取试剂盒还包括裂解液、洗脱液:
所述裂解液的组分包括胍盐、Tris-HCl、表面活性剂;
所述洗脱液由DEPC水组成。
7.如权利要求6所述应用,其特征在于,所述裂解液还包括磁珠,所述磁珠为超顺磁性羟基纳米磁珠,浓度为20~100mg/ml。
8.一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒,包括权利要求1所述无醇清洗液,还包括权利要求6所述的裂解液、洗脱液,不包括作为单独组分添加的的蛋白酶K及其溶液。
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