CN116377022A - 一种核酸释放试剂及核酸提取方法和提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸释放试剂及核酸提取方法和提取试剂盒。所述核酸释放试剂包括：100～500mM的尿素，体积百分比为0.1～3％的TERGITOL，10～100mM的NaOH，5～100mM的Tris‑HCl，体积百分比为0.05～1％的消泡剂组成，溶剂为水。本发明对多种不同的核酸释放剂进行了平行试验对比，发现本发明的释放剂对于PCR扩增效果具有明显的优势。采用本发明提供的核酸释放试剂，只需将采样拭子放入装有核酸释放试剂的采样管中即可释放出核酸，操作简便，无需单独提取样本的核酸，在很大程度上简化了实验操作步骤，减少核酸损耗，从而提高检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种核酸释放试剂及核酸 提取方法和提取试剂盒。
背景技术
核酸分子检测在病原微生物的检测方面发挥了重大优势，应用较广。而 核酸提取是核酸检测中必不可少的环节。目前常用的核酸提取方法主要有3 种：(1)高温煮沸法：通过高温使细胞裂解，释放出核酸；(2)离心柱法： 裂解液与样本混合，释放出核酸，通过柱层析法吸附核酸，再用洗脱液洗脱 得到纯化的核酸；(3)磁珠法：裂解液裂解细胞，磁珠吸附核酸，再通过洗 脱液洗脱得到纯化好的核酸。
高温煮沸法的缺点是高温处理在一定程度上会破坏核酸，且容易产生气 溶胶，造成环境污染。离心柱法的提取效果好，但操作繁琐，步骤较多，容 易造成核酸损失。磁珠法的提取步骤相对简单，提取的核酸纯度高，易发展 成自动化，但产品的价格相对昂贵。
发明内容
本发明的目的是，提供种一种核酸释放试剂及核酸提取方法和提取 试剂盒。主要解决现有技术中核酸提取方法存在的成本高、操作繁琐、破坏 核酸等缺点和不足。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种核酸释放试剂，包括：100～500mM的尿素，体积百分比为0.1～3％ 的TERGITOL，10～100mM的NaOH，5～100mM的Tris-HCl，体积百分比为 0.05～1％的消泡剂组成，溶剂为水。所述TERGITOL为壬基酚聚氧乙烯醚。
作为优选实施方案，所述释放试剂包括：200～300mM尿素，体积百分比 为1.5-2.5％的TERGITOL，30-50mMNaOH，10-30mM Tris-HCl，体积百分比 为0.2-0.4％的消泡剂组成，溶剂为水
作为优选实施方案，所述释放试剂包括：250mM尿素，体积百分比为2％ 的TERGITOL，40mM NaOH，20mM Tris-HCl，体积百分比为0.3％的消泡剂 组成，溶剂为水。
本发明还提供所述的核酸释放试剂提取核酸的方法，该方法为：将待提 取样本与所述核酸释放试剂充分混合、放置，即得到目的核酸。
作为优选实施方案，所述样本为采样拭子。
作为优选实施方案，所述采样拭子为咽拭子或鼻咽拭子。
作为优选实施方案，所述核酸为RNA。
本发明还提供一种核酸提取试剂盒，所述提取试剂盒包含所述的核酸释 放剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1，本发明对多种不同的核酸释放剂进行了平行试验对比，发现本发 明的释放剂对于PCR扩增效果具有明显的优势。
2，采用本发明提供的核酸释放试剂，只需将采样拭子放入装有核酸 释放试剂的采样管中即可释放出核酸，操作简便，无需单独提取样本的 核酸，在很大程度上简化了实验操作步骤，减少核酸损耗，从而提高检 测的灵敏度。
3，本发明提供的核酸释放试剂可以对咽拭子、鼻咽拭子等未知样本 中的核酸进行快速、准确的测定，且试剂用量少，成本低，使用安全。
附图说明
图1A是实施例1和对比例中的核酸释放剂提取新型冠状病毒2019-nCoV 临床样本1的ORF1ab基因的荧光PCR扩增曲线图。
图1B为实施例1和对比例中的核酸释放剂提取新型冠状病毒2019-nCoV 临床样本1的N基因的扩增结果。
图2A是本发明核酸释放试剂和市场产品(对照组)提取新型冠状 病毒2019-nCoV临床样本2、3、4ORF1ab基因的荧光PCR扩增曲线图。
图2B本发明核酸释放试剂和市场产品(对照组)提取新型冠状病毒2019-nCoV临床样本2、3、4N基因的荧光PCR扩增曲线图。
图3A是本发明核酸释放试剂提取的核酸放置0天的荧光PCR扩增 曲线图。
图3B是本发明核酸释放试剂提取的核酸放置3天的荧光PCR扩增 曲线图。
图4A是本发明核酸释放试剂在45℃放置0天的荧光PCR扩增曲线 图。
图4B是本发明核酸释放试剂在45℃放置3天的荧光PCR扩增曲线 图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试 剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
一种核酸释放试剂，包括如下组分：
尿素：250mM；(尿素在释放剂中的终浓度为250mM)
TERGITOL溶液：2％；(TERGITOL溶液是直接从sigma公司购买 的产品，货号是NP40S；2％是指TERGITOL在释放剂中的体积百分比。)
NaOH：40mM；
pH8.8的Tris-HCl：20mM(这里是指加入的是pH8.8的Tris-HCl缓 冲液，Tris-HCl在释放剂中的终浓度为20mM)
消泡剂：0.3％。(消泡剂是从Sigma购买的消泡剂SE-15)
溶剂为水。
对比例1
一种核酸释放试剂，包括如下组分：
尿素：250mM；
TritonX-100溶液：1％；(TritonX-100溶液是直接从sigma购买的， 1％是指TritonX-100在释放剂中的体积百分比。)
NaOH：40mM；
pH8.8的柠檬酸溶液：20mM；(这里是指加入的是pH8.8的柠檬酸缓 冲液，柠檬酸在释放剂中的终浓度为20mM)
消泡剂：0.3％。(消泡剂是从Sigma购买的消泡剂SE-15)
对比例2
一种核酸释放试剂，包括如下组分：
尿素：250mM；
TritonX-100溶液：1％；(1％是指TritonX-100在释放剂中的体积百 分比)
NaOH：40mM；
pH8.8的Tris-HCl：20mM；(Tris-HCl在释放剂中的终浓度为20mM)
消泡剂：0.3％。
对比例3
一种核酸释放试剂，包括如下组分：
盐酸胍：100mM；
TERGITOL溶液：2％；(2％是指TERGITOL在释放剂中的体积百 分比)
NaOH：40mM；
pH8.8的柠檬酸溶液：20mM；(柠檬酸在释放剂中的终浓度为20mM)
消泡剂：0.3％；
上述实施例1、对比例1-3中的核酸释放试剂的使用方法为：将采 集好的咽拭子或鼻咽拭子临床样本放入装有核酸释放试剂的样本采集管 中，折断采样拭子杆后盖上管盖，振荡数秒后，室温静置10min，再次 振荡数秒，瞬时离心后，上清液即为释放后的核酸溶液。然后将所得的 核酸溶液作为模板，直接吸取加入PCR反应体系中，在PCR仪器上进 行扩增。
实施例2
将实施例1、对比例1-3中的核酸释放试剂，分别对新型冠状病毒 (2019-nCoV)的咽拭子或鼻咽拭子临床样本1进行核酸提取。所得核 酸溶液作为模板，直接吸取加入PCR反应体系中，在ABI Quant Studio5 仪器上进行扩增。
其中新型冠状病毒(2019-nCoV)的核酸检测试剂是本公司自制的 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。PCR体系 如表1：
表1
| PCR反应液(μL) | 酶混合液(μL) | 模板量(μL) | 总体积(μL) |
| 8.5 | 1.5 | 10 | 20 |
具体PCR扩增程序如表2：
表2
PCR扩增结果参见表3和图1A、图1B。图1A是实施例1和对比 例中的核酸释放剂提取新型冠状病毒(2019-nCoV)临床样本1的ORF1ab 基因的荧光PCR扩增曲线图。图1B为实施例1和对比例中的核酸释放 剂提取新型冠状病毒(2019-nCoV)临床样本1的N基因的扩增结果。
表3
PCR扩增结果表明：本发明核酸释放试剂(实施例1)提取新型冠 状病毒样本Ct值比对照组样本(对比例1-3)提前1-5个Ct，说明本发 明核酸释放试剂的提取效果优于对比例的释放剂。
实施例3本发明核酸释放试剂与市场上购买的核酸释放剂的对比 本发明的核酸释放试剂，包括如下组分：
尿素：250mM；
TERGITOL溶液：2％；
NaOH：40mM；
pH8.8的Tris-HCl：20mM
消泡剂：0.3％；
上述核酸释放试剂的使用方法为：分别对新型冠状病毒 (2019-nCoV)的咽拭子或鼻咽拭子临床样本2、3、4放入装有核酸释 放试剂的样本采集管中，折断采样拭子杆后盖上管盖，振荡数秒后，室 温静置10min，再次振荡数秒，瞬时离心后，上清液即为释放后的核酸溶液。然后将所得的核酸溶液作为模板，直接吸取加入PCR反应体系中， 在ABI QuantStudio5仪器上进行扩增。
同时以市场上购买的某公司核酸释放剂作为对照组，取同时平行取 样的拭子临床样本按照厂家说明书进行核酸提取，提取后的核酸同步上 机检测。
其中新型冠状病毒(2019-nCoV)的核酸检测试剂是本公司自制的 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。
PCR体系配制和扩增程序与实施例2相同。
PCR扩增结果参见表4和图2A、图2B。图2A是本发明核酸释放 试剂和市场产品(对照组)提取新型冠状病毒(2019-nCoV)临床样本2、 3、4ORF1ab基因的荧光PCR扩增曲线图。图2B本发明核酸释放试剂和 市场产品(对照组)提取新型冠状病毒(2019-nCoV)临床样本2、3、4 N基因的荧光PCR扩增曲线图。
表4
PCR扩增结果表明：本发明的核酸释放试剂提取的新型冠状病毒 (2019-nCoV)临床样本Ct值较市场上的样本释放剂提前1-2个Ct值， 说明本发明的核酸释放剂的提取效果优于市场产品的释放剂。
实施例4本发明核酸释放试剂释放出的核酸的稳定性测试 临床样本：选择新型冠状病毒(2019-nCoV)临床阳性样本5、6。
以实施例3为例，利用本发明核酸释放试剂对新型冠状病毒 (2019-nCoV)临床样本5、6释放的核酸进行保存，在室温放置3天后 进行荧光PCR，使用的PCR扩增试剂盒是本公司自制的新型冠状病毒 2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。
PCR扩增结果参见表5和图3A、图3B。图3A是本发明核酸释放 试剂提取的核酸放置0天的荧光PCR扩增曲线图。图3B是本发明核酸 释放试剂提取的核酸放置3天的荧光PCR扩增曲线图。
表5
数据结果表明：核酸室温放置3天后仍能稳定保存，表明本发明核 酸释放试剂释放出的核酸在室温可以保存3天。
实施例5本发明核酸释放试剂45℃破坏3天的稳定性测试
临床样本：选择新型冠状病毒(2019-nCoV)临床阳性样本7。
以实施例3为例，将本发明的核酸释放试剂在45℃放置3天，对新 型冠状病毒(2019-nCoV)临床样本7进行核酸提取，然后进行荧光PCR， 使用的PCR扩增试剂盒是本公司自制的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检 测试剂盒(荧光PCR法)。
PCR扩增结果参见表6和图4A、图4B。图4A是本发明核酸释放 试剂在45℃放置0天的荧光PCR扩增曲线图。图4B是本发明核酸释放 试剂在45℃放置3天的荧光PCR扩增曲线图。
表6
数据结果表明：核酸释放试剂在45℃放置3天后，提取的新型冠状 病毒临床样本7的Ct值较0天相比延后不到1个Ct值，且CV,％均小于 1％，说明本发明的核酸释放剂稳定性较好。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内 容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可 以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之 内。
Claims (8)
1.一种核酸释放试剂，包括：100～500mM的尿素，体积百分比为0.1～3％的TERGITOL，10～100mM的NaOH，5～100mM的Tris-HCl，体积百分比为0.05～1％的消泡剂组成，溶剂为水。
2.如权利要求1所述的核酸释放试剂，其特征在于，所述释放试剂包括：200～300mM尿素，体积百分比为1.5-2.5％的TERGITOL，30-50mM NaOH，10-30mM Tris-HCl，体积百分比为0.2-0.4％的消泡剂组成，溶剂为水。
3.如权利要求1所述的核酸释放试剂，其特征在于，所述释放试剂包括：250mM尿素，体积百分比为2％的TERGITOL，40mM NaOH，20mM Tris-HCl，体积百分比为0.3％的消泡剂组成，溶剂为水。
4.权利要求1-3任一项所述的核酸释放试剂提取核酸的方法，该方法为：将待提取样本与所述核酸释放试剂充分混合、放置，即得到目的核酸。
5.如权利要求4所述的核酸释放试剂提取核酸的方法，其特征在于：所述样本为采样拭子。
6.如权利要求5所述的核酸释放试剂提取核酸的方法，其特征在于：所述采样拭子为咽拭子或鼻咽拭子。
7.如权利要求4所述的核酸释放试剂提取核酸的方法，其特征在于：所述核酸为RNA。
8.一种核酸提取试剂盒，其特征在于：所述提取试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的核酸释放剂。
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