CN109402113A - 基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组提取试剂盒及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组DNA提取试剂盒，包括以下组分：聚苯乙烯磁珠、裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液。所述聚苯乙烯磁珠为聚苯乙烯包被伽马‑三氧化二铁的羟基磁珠。本发明还提供一种提取干血片基因组DNA的方法，使用上述试剂盒进行提取，包括以下步骤：S1：将干血片用蛋白酶K和所述裂解液裂解，取上清，得到裂解产物；S2：向所述裂解产物中加入所述聚苯乙烯磁珠和结合液，混匀，转移至磁力架，弃掉溶液；S3：使用所述洗涤液洗涤；S4：使用所述洗脱液从所述挂载有DNA。的磁珠上洗脱DNA，即得到基因组DNA。

Description

基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明涉及血液样品检测领域，更特别地，涉及一种基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组DNA提取试剂盒以及提取干血片基因组DNA的方法。
背景技术
随着各项基因检测技术发展，干血片逐渐成为基因检测主要样本之一，干血片采集方法比传统采集全血方法有一定的优势。它需求较少的血量，可减少动物使用，方便血样采集、存储运输，是罕见疾病筛查过程中的一项有效工具。
基因组DNA包含细胞中全部的遗传信息，从干血片提取基因组DNA血量需求少，方便采集和运输，DNA完整性好，是基因检测提取DNA的主要方法之一。
目前有多种基因组DNA提取试剂盒可应用于多种领域，但传统的提取技术需要进行沉淀、离心等操作，并需要大量的生物样本，导致基因组DNA提取存在诸多缺点，如提取过程复杂、样本处理时间长、样本处理丢失大量DNA、提取步骤易错、易造成样本交叉污染、需多种仪器等。
磁珠法是采用磁珠为载体的分离技术，属于固相抽提法。由于磁珠法提取核酸操作简单，快速，重复性好，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在临床疾病诊断、法医学鉴定、环境微生物检测、和分子生物学研究等多种领域。相比传统的DNA提取方法，磁珠法无需离心和大量器材，也无需接触酚/氯仿等有毒试剂，且操作简单方便，可实现自动化操作，基于磁珠法的核酸提取具备传统DNA提取无法比拟的优势。
发明内容
我们在研究中发现，聚苯乙烯磁珠相较于普通磁珠，具有均一性好，粒径小，分散佳，不易沉降的特点，DNA结合效率更高，更适合于自动化操作。
因此，本发明提供了一种基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组DNA提取试剂盒，包括以下组分：聚苯乙烯磁珠、裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液。
在一个优选实施方案中，所述聚苯乙烯磁珠为聚苯乙烯包被伽马-三氧化二铁的羟基磁珠。
在一个优选实施方案中，所述裂解液包括裂解液I和裂解液II，所述裂解液I包含三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠，所述裂解液II包含盐酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠；
所述结合液包含盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇-8000、无水乙醇、异丙醇；
所述洗涤液包含洗涤液I和洗涤液II，所述洗涤液I包含盐酸胍，三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、无水乙醇、异丙醇、曲拉通X-100，所述洗涤液II包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、无水乙醇；
所述洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸。
在一个优选实施方案中，所述裂解液I中三羟甲基氨基甲烷的浓度为 20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为 50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数；
所述裂解液II中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为 50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数。
在一个优选实施方案中，所述结合液中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20 mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L,聚乙二醇-8000的浓度为 10-50mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数。
在一个优选实施方案中，所述洗涤液I中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20 mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，无水乙醇的浓度为30-70％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数；
所述洗涤液II中三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数。
在一个优选实施方案中，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为 10-50mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，pH为5-10。
本发明还提供了一种提取干血片基因组DNA的方法，使用上述试剂盒进行提取，包括以下步骤：
S1：将干血片用蛋白酶K和所述裂解液裂解，取上清，得到裂解产物。优选地，所述干血片通过使用打孔器加工成5mm直径。加入200μL蛋白酶K和200μL裂解液I，60℃孵育20min；然后加入200μL裂解液II， 70℃孵育10min，离心取上清得到裂解产物。
S2：向所述裂解产物产物中加入所述聚苯乙烯磁珠和结合液，混匀，转移至磁力架，弃掉溶液。优选地，加入20μL聚苯乙烯磁珠和400μL结合液，颠倒混匀，6.转移至磁力架吸附3-5分钟，倒弃溶液。
S3：使用所述洗涤液洗涤。优选地，加入500μL洗涤液I，涡旋重悬磁珠，转移至磁力架，吸附3-5分钟，倒弃溶液；加入500μL洗涤液II，涡旋重悬磁珠，转移至磁力架，吸附3-5分钟，倒弃溶液。
S4：使用所述上洗脱液从所述挂载有DNA的磁珠上洗脱DNA，即得到基因组DNA。优选地，加入20-50μL洗脱液，洗脱DNA。
本发明的方法使用聚苯乙烯磁珠，具有均一性好，粒径小，分散佳，不易沉降的特点，DNA结合效率更高，更适合于自动化操作。
附图说明
图1为实施例2提取的DNA的电泳照片；
图2为实施例3提取的DNA的电泳照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.实施例1
试剂盒的组成
本实施例中试剂盒包括以下组分：聚苯乙烯磁珠、裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液。所述聚苯乙烯磁珠为聚苯乙烯包被伽马-三氧化二铁的羟基磁珠。
所述裂解液包括裂解液I和裂解液II，所述裂解液I包含三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数。
所述裂解液II包含盐酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠，盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为 20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为 50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数。
所述结合液包含盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇-8000、无水乙醇、异丙醇；盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L,聚乙二醇-8000的浓度为10-50mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数。
所述洗涤液包含洗涤液I和洗涤液II，所述洗涤液I包含盐酸胍，三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、无水乙醇、异丙醇、曲拉通X-100；盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，无水乙醇的浓度为30-70％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数，曲拉通 X-100的浓度为1-5％体积分数。
所述洗涤液II包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、无水乙醇；三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20 mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数。
所述洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸；三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-50mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，pH为5-10。
2.实施例2
本实施例提取干血片基因组的方法如下：
1)用打孔器在FTA Card或血片上打1-2个5mm直径的血片，转移2.0 ml离心管中。
2)加入20μL蛋白酶K、200μL裂解液I至样本中，60℃温育20分钟。
3)加入裂解液II，颠倒混匀5-10次，高速涡旋混匀20秒。70℃温育 10分钟。
4)转移裂解产物上清350-400μL至1.5ml离心管中。
5)加入20ul聚苯乙烯磁珠和400μL结合液，颠倒混匀。
6)转移至磁力架吸附3-5分钟，倒弃溶液。
7)加入500μL洗涤液I，涡旋重悬磁珠。转移至磁力架，吸附3-5 分钟，倒弃溶液。
8)加入500μL洗涤液II，涡旋重悬磁珠。转移至磁力架，吸附3-5 分钟，倒弃溶液。
9)加入20-50μL洗脱液,洗脱DNA。
使用以上方法提取了8个干血片样品的DNA，结果如图1和表1所示。
表1实施例2所提取的DNA的结果
样本编号 nanodrop浓度(ng/ul) 260/280 260/230 qubit浓度(ng/ul) 体积(ul)
1 11.2 1.82 1.72 9.5 30
2 7.5 1.8 1.96 6.9 30
3 10.5 1.85 1.65 9.2 30
4 8.7 1.83 2.03 7.5 30
5 7.9 1.82 2.05 6.9 30
6 9.5 1.79 1.88 8.7 30
7 9.3 1.83 1.79 8.2 30
8 9.2 1.78 1.99 8.1 30
3.实施例3
本实施例提取干血片基因组的方法如下：
1)用打孔器在FTA Card或血片上打1-2个5mm直径的血片，转移2.0 ml离心管中。
2)加入20μL蛋白酶K、200μL裂解液I至样本中，60℃温育20分钟。
3)加入裂解液II，颠倒混匀5-10次，高速涡旋混匀20秒。70℃温育 10分钟。
4)转移裂解上清液350-400μL至96孔板1/7排,并加入20μL聚苯乙烯磁珠。
5)96孔2/8排加入700μL洗涤液I。
6)96孔3/9,4/10排加入700μL洗涤液II。
7)96孔5/11排加入50μL洗脱液。
8)运行核酸提取仪，结束后将5/11排洗脱液转移至1.5ml离心管。
使用以上方法提取了16个干血片样品的DNA，结果如图2和表2所示。
表2实施例3所提取的DNA的结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于聚苯乙烯磁珠的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，包括以下组分：聚苯乙烯磁珠、裂解液、结合液、洗涤液和核酸洗脱液。
2.根据权利要求1所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述聚苯乙烯磁珠为聚苯乙烯包被伽马-三氧化二铁的羟基磁珠。
3.根据权利要求1所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括裂解液I和裂解液II，所述裂解液I包含三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠，所述裂解液II包含盐酸胍、乙二胺四乙酸、氯化钠、曲拉通X-100、十二烷基磺酸钠；
所述结合液包含盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、聚乙二醇-8000、无水乙醇、异丙醇；
所述洗涤液包含洗涤液I和洗涤液II，所述洗涤液I包含盐酸胍，三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、氯化钠、无水乙醇、异丙醇、曲拉通X-100，所述洗涤液II包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、无水乙醇；
所述洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸。
4.根据权利要求3所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液I中三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数；
所述裂解液II中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数，十二烷基磺酸钠的浓度为1-5％体积分数。
5.根据权利要求3所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述结合液中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L,聚乙二醇-8000的浓度为10-50mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数。
6.根据权利要求3所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液I中盐酸胍的浓度为1-8mol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，氯化钠的浓度为50-500mmol/L，无水乙醇的浓度为30-70％体积分数，异丙醇的浓度为20-50％体积分数，曲拉通X-100的浓度为1-5％体积分数；
所述洗涤液II中三羟甲基氨基甲烷的浓度为20-80mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，无水乙醇的浓度为30-80％体积分数。
7.根据权利要求3所述的干血片基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10-50mmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为5-20mmol/L，pH为5-10。
8.一种提取干血片基因组DNA的方法，其特征在于，使用权利要求1-7中任一项所述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：
S1：将干血片用蛋白酶K和所述裂解液裂解，取上清，得到裂解产物；
S2：向所述裂解产物中加入所述聚苯乙烯磁珠和结合液，混匀，转移至磁力架，弃掉溶液；
S3：使用所述洗涤液洗涤；
S4：使用所述洗脱液从所述挂载有DNA的磁珠上洗脱DNA，即得到基因组DNA。
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