CN106350512A - 一种真核细胞核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真核细胞核酸提取方法。本发明提供了一种核酸提取方法,包括如下步骤:将待测样本和碱性液体混匀后在高温条件下反应,得到核酸。本发明的实验证明了本发明的方法,与现有的DNA提取方法相比,省去了多次清洗、温浴和离心等操作步骤,通过在样本周围创造一种碱性高温的液体环境,加速真核细胞膜破裂和蛋白质变性,能够使真核基因组DNA的提取效率大大提升,实现了快速的DNA提取;在样本类型及实验室条件方面无特殊要求,是一种适用面广,适合普遍推广应用的核酸提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种真核细胞核酸提取方法。
背景技术
自PCR技术在上世纪八十年代问世以来,其在分子生物学相关领域的应用越来越广泛。尤其是近年来,随着人们对临床诊断的灵敏度和特异性要求的提高,以及精准医疗概念的提出和推广,PCR技术凭借其在临床诊断中快速、敏感、特异等优点,已经迅速广泛的应用到了临床诊疗,通过检测患者样本中的基因,从而帮助医生诊断疾病、指导临床用药。另外,PCR技术也已普遍应用于司法鉴定和农业育种等领域,它已成为多个产业发展的一种基础技术。
而样本的核酸提取是PCR技术应用的前提。核酸提取方法的研究存在6个发展趋势,分别是:用非有机试剂替代传统的有机试剂提取,减少环境污染;用更加少的操作步骤替代繁琐的离心和移液等步骤,减少操作和出错风险;实现更高的核酸回收效率,更加适用于微量样本的核酸提取;便于批量操作,易于实现自动化;所用仪器、试剂和耗材的成本更低;适用的样本类型和下游的核酸检测方法更多。
核酸提取常用方法有:酚-氯仿抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、柱提法、磁珠法和Chelex-100法等。相比于其它方法,Chelex-100法具有适用样本类型多,操作相对简单,样本量要求低等,目前已在司法鉴定、微生物鉴定、基因分型等多个领域广泛应用。Chelex-100是一种螯合树脂,通过螯合细胞裂解后释放的镁离子抑制DNA酶的活性,从而有效减少DNA的降解,达到较高质量核酸提取的目的。由于Chelex-100树脂不溶于水,因此不容易均匀的加入到核酸提取容器中,对实验操作要求非常高;并且,目前所用的Chelex-100法操作步骤多,耗时长,不适合大批样本的快速核酸提取。
随着PCR技术的不断成熟,所用到DNA聚合酶的保真度越来越高,杂质的存在对于PCR反应的干扰显著降低;同时,对于DNA浓度的要求降低,PCR酶的灵敏度更高,扩增速度更快,扩增效率更好。因此,PCR技术对于核酸的要求更加小,这也允许核酸提取方法进行更多的简化和改进。
发明内容
本发明要解决目前DNA提取方法中存在的抽提步骤繁琐,操作难度大,耗时长、所需试剂较多以及成本较高,大批量抽提适用性差,抽提方法适用的样本种类较少等问题。
本发明的一个目的是提供一种真核细胞核酸提取方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
1)将待测样本和碱性液体混合,得到混合后的溶液;
2)将所述混合后的溶液在高温条件下反应,得到核酸,实现真核细胞核酸提取。
上述方法中,所述碱性液体为pH值为8-13的DEB溶液;
所述DEB溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液;上述方法中,所述DEB溶液的浓度为1μmol/L-0.1mol/L。
上述方法中,所述高温为80-100℃。
上述方法中,所述反应的时间为1min-50min;
上述方法中所述反应的时间为10min。
上述方法中,所述核酸为DNA和/或RNA。
上述方法中,所述待测样本为全血、干血片、唾液、口腔拭子、细胞保存液、发根、血斑或精斑。
本发明的另一个目的是提供一种真核细胞核酸提取试剂盒。
本发明提供的一种核酸提取试剂盒,所述试剂盒的试剂为上述碱性液体。
上述试剂盒中,所述碱性液体为pH值为8-13的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液;或者所述碱性液体为1μmol/L-0.1mol/L的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
上述的核酸提取方法所得核酸在PCR扩增中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明,本发明与现有的DNA提取方法相比,省去了多次清洗、温浴和离心等操作步骤,通过在样本周围创造一种碱性高温的液体环境,加速真核细胞膜破裂和蛋白质变性,能够使真核基因组DNA的提取效率大大提升,实现了快速的DNA提取,且提取后的核酸可直接进行PCR扩增,便于自动化核酸提取和少量样本的核酸提取及其后续实验;省去了Chelex-100试剂和其它有机试剂,降低了实验操作的难度和复杂度,减少了环境污染;克服了真核细胞基因组DNA提取中的难题,实现多种样本类型的快速核酸提取;极大程度的降低了DNA抽提的时间成本和试剂成本。是一种快捷、廉价、高效的DNA抽提方式。适用于干血片、全血、唾液、口腔拭子、FTA卡、细胞保存液、发根、血斑、精斑等多种样本类型。同时,本方法在样本类型及实验室条件方面无特殊要求,是一种适用面广,适合普遍推广应用的核酸提取方法。
附图说明
图1为DNA抽提操作对比。
附图1是以全血抽提为例,通过对比两种方法抽提所需步骤数及所需时间(×10min),其中Chelex-100抽提法获取DNA需要9步,本专利中所涉及的新方法需要3步,抽提方法更简单。另外,抽提时间方面,Chelex-100抽提法获取DNA需要80min,本专利中所涉及的新方法需要12min.,抽提时间显著压缩。
图2为PCR产物进行凝胶电泳的对比结果。
附图2中所示电泳结果是分别采用Chelex-100法和本专利中所涉及的新方法抽提全血、毛根、唾液、干血片、口腔拭子、细胞保存液等样本,经PCR扩增后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,扩增片段大小为1116bp。结果显示新方法抽提的DNA在PCR应用中达到了与Chelex-100法相同的效果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、核酸提取方法的建立
1、提取溶液配置
提取溶液为DEB(DNA extraction buffer)溶液;
DEB溶液为碱性水溶液,溶剂是双蒸水,溶质是碱性化学试剂(如氢氧化钠或氢氧化钾),配置方法为:取一定量双蒸水,加入氢氧化钠或氢氧化钾粉末,不断搅拌至溶解,测定pH值,pH值为8-13,优选为10。
2、提取
以96孔板批量抽提为例,具体操作步骤如下:
1)将待提取样本分别加入96孔板中;
2)向1)中加入一定量(如120μL)的DEB(DNA extraction buffer)溶液(pH在8-13之间的水溶液),用8联管或膜将96孔板密封好;
3)100℃煮沸10min,冷却后,得到核酸。
上述方法得到的核酸可作为DNA模板进行后续的PCR反应;本发明的方法取样后操作需要3个步骤,时间需要12min即可。
实施例2、全血中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组:按照实施例1中的提取液和方法进行提取:
1)将充分混匀的2μL人离体静脉全血加到96孔板中;
2)向1)中加入120μL的DEB溶液(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10),全血和DEB的体积比为1/60,用膜将96孔板密封好;
3)100℃沸水浴10min;冷却后,得到DEB提取核酸。
对照组:Chelex-100抽提法
1)取10μL全血加到1.5mL离心管中;
2)加人500μL纯水,剧烈振荡,室温下放置15min;
3)13,000rpm离心3min,去上清;
4)重复上述两个步骤1次,尽可能地减少血红素;
5)沉淀中加入200μL 5%Chelex-100溶液(5%Chelex-100为悬浊液,使用前要充分振摇,使Chelex-100颗粒悬浮),在振荡器上反复振荡30s;
6)放入56℃温浴30min以上;
7)取出后振荡,100℃保温10min;
8)振荡后,13,000rpm离心3min,收集上清液得到Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
比对上述实验组和对照组的提取方法的抽提所需步骤数及所需时间(×10min)(图1):
Chelex-100抽提法获取DNA需要9步,本发明方法需要3步,抽提方法更简单;
Chelex-100抽提法获取DNA需要80min,本发明方法需要12min,抽提时间显著压缩。
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例全血样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
表1、DNA浓度检测结果
3、核酸的PCR验证
选择针对人的GAPDH基因的引物进行目的片段的扩增。所用引物采用PrimerBlast自行设计,由华大基因(BGI)合成。
引物序列分别见序列1和序列2,具体序列如下。
序列1:5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGAT-3’(GAPDH-F)
序列2:5’-GCCAGACCCTGCACTTTTTAAG-3’(GAPDH-R)
PCR反应体系:上述一的两种方法分别提取的核酸2μL,10×Buffer(无Mg2+)2.5μL,2.5Mm dNTP 2μL,25mM MgCl2 1.5μL,引物混合液10mM 0.5μL,高保真Taq酶0.5μL,ddH2O补齐剩余体积。
PCR扩增过程:94℃3min,(94℃15s,60℃60s,72℃1min)×35cycles 72℃3min,4℃∞。
采用琼脂糖凝胶电泳。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例3、干血片中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组:
1)用取直径为3mm的新生儿足跟血干血片(打孔获得)加入到96孔板中;
2)与实施例2的实验组的2)相同,(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10,);
3)实施例2的实验组的3)相同,得到碱性DEB提取核酸。
对照组:
1)取直径为3mm的干血片,加到1.5mL的离心管中;
2)-8)同实施例2的对照组的2)-8),得到Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
与实施例2相同;
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例干血片样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
3、核酸的PCR验证
方法与实施例2相同。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例4、唾液中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组:
1)取10μL混匀的人的唾液加到96孔板中;
2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10);
3)实施例2的实验组的3)相同,得到碱性DEB提取核酸。
对照组:
1)取10μL唾液加到1.5mL离心管;
2)-8)同实施例2的对照组的2)-8),得到Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
与实施例2相同;
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例唾液样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
3、核酸的PCR验证
方法与实施例2相同。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例5、口腔拭子中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组:
1)将采集人口腔上皮细胞的口腔拭子置于含500μL的DEB溶液(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10))的1.5mL离心管中震荡1min,得到液体;
2)取10μL上述液体于96孔板中;
3)100℃沸水浴10min;冷却后,得到碱性DEB提取核酸。
对照组:
1)将口腔拭子加入到含500μL纯水的2mL离心管中;
2)-8)同实施例2的对照组的2)-8),得到Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
与实施例2相同;
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例口腔拭子样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
3、核酸的PCR验证
方法与实施例2相同。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例6、细胞保存液中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组
1)取150μL人宫颈上皮脱落细胞保存液(保存液配方来源见专利CN101999343B)加入96孔板中,4000rpm,离心10min,去上清;
2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10);
3)与实施例2的实验组的3)相同,得到碱性DEB提取核酸。
对照组:
1)取500μL细胞保存液与于1mL离心管中;
2)2)-8)同实施例2的对照组的2)-8),得到Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
与实施例2相同;
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例宫颈脱落细胞保存液样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
3、核酸的PCR验证
方法与实施例2相同。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例7、发根中核酸提取
一、本发明的方法与Chelex-100抽提法
实验组:
1)用镊子夹住毛发的根部,剪去其余部分,将毛根放入96孔板中;
(注:处理毛发时很容易遗失,应小心操作,最好在桌面上铺一张白纸。加人纯水洗一次);
2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液;pH值10);
3)实施例2的实验组的3)相同,得到碱性DEB提取核酸。
对照组:
用镊子夹住毛发的根部,剪去其余部分,将毛根放入0.5mL离心管中(处理毛发时很容易遗失,应小心操作,最好在桌面上铺一张白纸。),加人纯水洗一次,然后加入30μL5%的Chelex-100和2μL 5mg/mL的PK酶,放入56℃保温6小时以上。取出振荡,100℃保温8min,振荡,13000rpm离心3min,上清即为Chelex-100抽提核酸。
二、两种方法提取核酸的比较
1、抽提所需步骤数及所需时间
与实施例2相同;
2、核酸提取效率
采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例发根样本DNA浓度,结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。
3、核酸的PCR验证
方法与实施例2相同。
结果如图2所示,新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致,说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。
实施例8、一种试剂盒及其应用
试剂盒的试剂组成:1μmol/L-0.1mol/L的氢氧化钠水溶液或1μmol/L-0.1mol/L氢氧化钾水溶液。
本试剂盒可用于上述实施例中核酸样本的提取,但不局限用于上述实施例中样本种类核酸的提取。
序列表
<110>深圳华大基因股份有限公司
<120>一种真核细胞核酸提取方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 1
tccaaaatca agtggggcga t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gccagaccct gcacttttta ag 22
Claims (10)
1.一种真核细胞核酸提取方法,包括如下步骤:
1)将待测样本和碱性液体混合,得到混合后的溶液;
2)将所述混合后的溶液在高温条件下反应,得到核酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述碱性液体为DEB溶液,所述DEB溶液为pH值为8-13的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述DEB溶液的浓度为1μmol/L-0.1mol/L。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法,其特征在于:所述高温为80-100℃。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于:所述反应的时间为1min-50min;或所述反应的时间为10min。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于:所述核酸为DNA和/或RNA。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于:所述待测样本为全血、干血片、唾液、口腔拭子、细胞保存液、发根、血斑或精斑。
8.一种真核细胞核酸提取试剂盒,其特征在于:所述试剂盒的试剂为权利要求1-7任一所述方法中的所述碱性液体。
9.根据权利要求8中所述的试剂盒,其特征在于:所述碱性液体为pH值为8-13的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液;或者所述碱性液体为1μmol/L-0.1mol/L的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。
10.权利要求1-7任一权利要求所述的核酸提取方法所得核酸在PCR扩增中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170125 |
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