CN104480102A - 一种人体血清miRNA的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人体血清miRNA的提取方法，主要针对实验室常用的Trizol法提取血清miRNA的纯度和浓度较低进行优化，优化环节包括血清的制备、血清的预处理和具体的提取过程。优化后的方法操作步骤简单、成本较低，效果较好，稳定性也较好，尤其是血清经过预处理后，效果尤为明显，所得血清miRNA纯度高（OD260/OD280值为1.85-1.95）且产率也较高（RNA提取率为45-60μg/ml血清），用qRT-PCR检测血清的内参基因 miR-16 的Ct值在24-26之间，表明该方法提取的血清miRNA完全满足qRT-PCR的需要。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人体血清miRNA的提取方法。
背景技术
微小RNA（microRNA或miRNA）是一类长度很短的具有调控基因表达功能的内源性非编码单链小RNA，长约19-25个核苷酸不等，几乎参与了调控细胞活动的各个环节。在人体血清等体液中检测到的稳定性良好的miRNA称为循环miRNA。Lawrie等（2008）首先发现癌细胞可释放miRNA进入血液，认为此类miRNA可被开发用于检测早期癌症。近年来，血清miRNA作为一种新的生物标志物被广泛用于诊断各种癌症、感染性疾病等人类重大疾病。采用的方法主要是提取血清miRNA，利用基因芯片或实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测miRNA的表达水平变化。分离获得高纯度和完整的miRNA是开展此类临床诊断的关键。人体血清中富含蛋白质，增加了提取和分离miRNA的难度。实验室常用的RNA提取方法，如酚/氯仿和Trizol试剂分离获得的miRNA纯度和浓度均较低，而目前市场上的一些血清miRNA提取试剂盒可用于获得较高纯度的miRNA，但价格昂贵，一定程度上限制了对miRNA的研究。因此，针对实验室常用的Trizol提取血清miRNA的方法进行优化，使之适合于分离获得高纯度和完整的血清miRNA，并能满足qRT-PCR需要，可大大节约科研或临床miRNA检测成本。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足而提供了一种人体血清miRNA的提取方法，该方法成本低廉且能够高效获得高纯度和完整的人体血清miRNA。
本发明采用正交法从血清体积、温度、时间和转速等因素，优化Trizol提取人体血清miRNA的方法，优化的环节包括血清的制备、血清的预处理和具体的提取过程。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种人体血清miRNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）人体血清的制备，使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，于30-38℃温浴10-30min，室温2000-5000rpm离心3-10min；（2）人体血清的预处理，取步骤（1）制得的人体血清，添加灭菌的体积浓度为0.1%的焦炭酸二乙酯水溶液，并混合均匀，其中人体血清与焦炭酸二乙酯水溶液的体积配比为1:1-10；（3）人体血清miRNA的提取，向步骤（2）预处理的人体血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min后，加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡并室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min，取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇以沉淀RNA，并于-20℃放置0.5-12h后于4℃ 12000×g离心10min，然后倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min后倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并于室温放置使乙醇彻底挥发，然后用灭菌的体积浓度为0.1%的焦炭酸二乙酯水溶液于55-60℃温浴15min充分溶解RNA，用于检测纯度和含量，并经反转录后用于qRT-PCR检测。
本技术方案中，由于血清含有较丰富的蛋白质，降低了Trizol法获得的血清miRNA的纯度和浓度，影响qRT-PCR的检测，故对该方法进行优化。收集的血浆样品于30-38℃温浴10-30min，使血清在接近人体温度环境下析出，有利于miRNA的稳定；向获得的血清中按1:1-10（V/V）的不同比例添加灭菌的体积浓度为0.1%的焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液，将血清适当地稀释，可在离心分离后获得较多的上清（含miRNA），提高了miRNA的产率，此外可将血清中所含蛋白稀释，使离心后所得上清中蛋白含量降低，从而提高血清miRNA的纯度。与现有血清miRNA提取试剂盒相比，在低成本的前提下可获得高效高纯的血清miRNA。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
采用正交法对实验室常用的Trizol提取血清miRNA的方法进行优化，优化的具体操作步骤如下：
（1）血清的制备
所用血液样品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，放于30℃温浴30min，室温2000rpm离心10min；
（2）血清的预处理
取血清，按1:1（V/V）的比例加入灭菌的体积浓度为0.1%的 DEPC水溶液，并充分混合均匀；
（3）血清miRNA的提取
步骤a：向预处理的血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min；
步骤b：加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min；
步骤c：取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇，-20℃放置30min，4℃ 12000×g离心10min；
步骤d：倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min；
步骤e：倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并室温放置使乙醇彻底挥发；
步骤f：加入15μl灭菌的体积浓度为0.1%的 DEPC水溶液，55-60℃温浴15min充分溶解，用于检测纯度和含量，并用于qRT-PCR检测。
实施例2
采用正交法对实验室常用的Trizol提取血清miRNA的方法进行优化，优化的具体操作步骤如下：
（1）血清的制备
所用血液样品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，放于38℃温浴10min，室温5000rpm离心3min；
（2）血清的预处理
取血清，按1:10（V/V）的比例添加灭菌的体积浓度为0.1%的DEPC水溶液，并充分混合均匀；
（3）血清miRNA的提取
步骤a：向预处理的血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min；
步骤b：加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min；
步骤c：取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇，-20℃放置过夜（12h），4℃ 12000×g离心10min；
步骤d：倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min；
步骤e：倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并室温放置使乙醇彻底挥发；
步骤f：加入15μl灭菌的体积浓度为0.1%的 DEPC水溶液，55-60℃温浴15min充分溶解，用于检测纯度和含量，并用于qRT-PCR检测。
实施例3
采用正交法对实验室常用的Trizol提取血清miRNA的方法进行优化，优化的具体操作步骤如下：
（1）血清的制备
所用血液样品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，放于37℃温浴20min，室温3000rpm离心5min；
（2）血清的预处理
取血清，按1:5（V/V）的比例添加灭菌的体积浓度为0.1%的DEPC水溶液，并充分混合均匀；
（3）血清miRNA的提取
步骤a：向预处理的血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min；
步骤b：加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min；
步骤c：取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇，-20℃放置1h，4℃ 12000×g离心10min；
步骤d：倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min；
步骤e：倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并室温放置使乙醇彻底挥发；
步骤f：加入15μl灭菌的体积浓度为0.1%的 DEPC水溶液，55-60℃温浴15min充分溶解，用于检测纯度和含量，并用于qRT-PCR检测。
实施例4
（1）血清的制备
所用血液样品均取自正常的自愿者。使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，室温放置1h，室温3000rpm离心5min；
（2）血清miRNA的提取
步骤a：向血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min；
步骤b：加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min；
步骤c：取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇，室温放置10min，4℃ 12000×g离心10min；
步骤d：倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min；
步骤e：倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并室温放置使乙醇彻底挥发；
步骤f：加入15 μl灭菌的体积浓度为0.1%的 DEPC水溶液，55-60℃温浴15min充分溶解RNA，用于检测纯度和含量，并经反转录后用于qRT-PCR检测。
附表说明：
表1 按本发明实施例3和实施例4的方法提取血清miRNA的纯度和浓度比较
由表1，与按实施例4提取获得的血清miRNA相比，按实施例3所得的血清miRNA纯度较高（OD260/OD280值为1.85-1.95），产率也较高（RNA提取率为45-60μg/ml血清），qRT-PCR检测血清的内参基因miR-16的Ct值在24-26之间（Ct值越低表明qRT-PCR扩增效率越高），因此本发明的方法提取的血清miRNA完全满足qRT-PCR的需要。
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
Claims (1)
1.一种人体血清miRNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）人体血清的制备，使用血清采集管采集静脉空腹血，颠倒混匀后，于30-38℃温浴10-30min，室温2000-5000rpm离心3-10min；（2）人体血清的预处理，取步骤（1）制得的人体血清，添加灭菌的体积浓度为0.1%的焦炭酸二乙酯水溶液，并混合均匀，其中人体血清与焦炭酸二乙酯水溶液的体积配比为1:1-10；（3）人体血清miRNA的提取，向步骤（2）预处理的人体血清中加入等体积的Trizol，室温放置5min后，加入1/5 Trizol体积的氯仿，剧烈震荡并室温放置2-3min后，4℃ 12000×g离心15min，取上清液至新的离心管中，加入1/2 Trizol体积的异丙醇以沉淀RNA，并于-20℃放置0.5-12h后于4℃ 12000×g离心10min，然后倒掉上清，加入与Trizol等体积的体积浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃ 7500×g离心5min后倒掉上清，4℃ 12000×g离心2min，将残留乙醇用吸头除尽，并于室温放置使乙醇彻底挥发，然后用灭菌的体积浓度为0.1%的焦炭酸二乙酯水溶液于55-60℃温浴15min充分溶解RNA，用于检测纯度和含量，并经反转录后用于qRT-PCR检测。
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