CN104805071A - 一种草莓基因组dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种草莓基因组DNA的提取方法，用液氮将样品麿成粉末，加入CTAB提取液，55～65℃水浴后冷却至室温，加入醋酸钾后冰浴，再加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心，再在所得上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液；在上清液中加入异丙醇后，离心得沉淀物；离心后去除上清液，加入含RNase的TE缓冲液在37℃水浴，然后加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀、静置、离心分离得上清液，向上清液中加入醋酸钠和无水乙醇后，离心去除上清液，向沉淀中加入TE缓冲液溶解沉淀，即为草莓基因组DNA溶液。本发明综合了CTAB和SDS提取方法的特点，最终得到高糖多酚类植物草莓高质量的基因组DNA。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种草莓基因组DNA的提取方法。
背景技术
草莓是一种蔷薇科多年生草本植物，一年可以多次开花结果，是我国冬季重要的一种时令水果。草莓叶片和果实中含有丰富的多糖、蛋白质、酚酸、维生素等次生物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。因为这些粘性极强的次生物会与DNA共沉淀或者捆绑在一起，严重影响了DNA质量，导致后续的扩增、酶切等分子生物学难以进行。
高质量基因组DNA的提取分离是分子生物学研究的基础，常用的基因组DNA最基本的提取方法有：CTAB法和SDS法，其它如试剂盒法、高盐法等都是在这2种方法的基础上进行的改良或简化。这几种方法对极细嫩的组织会有效，但对于老叶片，果实，往往最后得到的DNA样品非常粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，缠搅在其中的粘性物致使DNA检测时上样困难、电泳困难。凝胶电泳检测显示DNA得率很低，上样孔或样道非常亮(见图1～2)。因此，开发一种适合草莓DNA提取的方法，能大大方便地进行分子生物学操作。
发明内容
本发明针对现有中的缺点，公开了一种草莓基因组DNA的提取方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种草莓基因组DNA的提取方法，包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的CTAB提取液，在55～65℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次使其混合，得到混合物Ⅰ；在粉末中加入预热过的CTAB提取液，在60～65℃下保温30～60分钟，晃动3～4次，使其充分混合。
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4～1/3，冰浴条件下放置1-2h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2-5℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40～100μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应30～60min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置30～60min，然后在2-5℃离心，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
作为优选，步骤(1)中，CTAB提取液包括，1-3％(m/V)的CTAB，80-120mM的Tris-HCl，10-25mM的EDTA，1-2M的NaCl和1-3％的PVP；CTAB提取液的pH值为7.5-8.5。
作为优选，CTAB提取液包括，2％(m/V)的CTAB，100mM的Tris-HCl，20mM的EDTA，1.4M的NaCl和2％的PVP；CTAB提取液的pH值为8.0。
作为优选，将CTAB提取液在110-120℃灭菌20-40min，使用时在每100mlCTAB提取液中加入1-3ml的β-巯基乙醇。
作为优选，步骤(7)中，乙醇为无水乙醇。
作为优选，氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
作为优选，离心时，转速控制在10000～12000rpm，离心10～15分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明综合了CTAB法和SDS提取方法的特点，利用CTAB的高裂解力和去除多糖的效果，加上SDS法提取DNA中的，高盐浓度(醋酸钾)和降低温度(冰上保温)的办法沉淀除去蛋白质和多糖(在低温条件下醋酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿/异戊醇抽提，反复抽提后用异丙醇沉淀，再用Rnase去除RNA后用氯仿/异戊醇抽提，再用乙醇沉淀水相中的DNA，得到高质量的与杂质彻底分离的草莓基因组DNA。经检测用本发明方法得到的草莓基因组DNA质量较高；用该草莓基因组DNA进行PCR扩增，得到较好的扩增结果。进而，本发明解决了草莓次生物含量高导致的高质量DNA提取困难的问题。
附图说明
图1是传统CTAB法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。
图2是传统SDS法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。
图3是本发明方法提取的草莓DNA凝胶电泳检测图片。
图4是本发明方法提取的DNA的检测草莓镶脉病毒的凝胶电泳检测图片。
图5是本发明、传统CTAB法、传统SDS法提取的草莓DNA凝胶电泳检测结果对比图。
具体实施方式
实施例1
一种草莓基因组DNA的提取方法，CTAB提取液包括，1％(m/V)的CTAB，80mM的Tris-HCl，10mM的EDTA，1M的NaCl和1％的PVP；CTAB提取液的pH值为7.5。将CTAB提取液在110℃灭菌20min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入1ml的β-巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到55℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5ml预热后的CTAB提取液，在55℃下保温30分钟，其间晃动3次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4，冰浴条件下放置1h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应30min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置30min，然后在2℃离心，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
图1和图2分别是传统CTAB和SDS法提取草莓DNA的方法，从图1、图2中可以看出，这两种方法提取的DNA带型弥散、降解严重；由于多糖等物质含量丰富，导致点样孔比较亮，DNA无法迁移，OD260/280值在1左右；在用TE溶解时，混合溶液黏稠，用移液枪精确移取困难，当用大量TE溶解后，导致浓度过低，一般无法满足酶切需求。图3是用本专利方法提取的草莓DNA，从图中可以看出，所提取的草莓DNA带型整齐，点样孔干净，OD260/280比值在1.8附近。用本方法提取达赛拉克草莓叶片DNA后，检测了草莓镶脉病毒的情况，从图4电泳结果可以看出，PCR电泳好，点样孔也干净，是一种比较理想的提取草莓DNA的方法。
由此可见，本发明方法得到的草莓基因组DNA质量较高；用该草莓基因组DNA进行PCR扩增，得到较好的扩增结果。
实施例2
一种草莓基因组DNA的提取方法，所使用的CTAB提取液包括，3％(m/V) 的CTAB，80-120mM的Tris-HCl，25mM的EDTA，2M的NaCl和3％的PVP；CTAB提取液的pH值为8.5。将CTAB提取液在120℃灭菌40min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入3ml的β-巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入10ml预热后的CTAB提取液，在65℃下保温60分钟，其间晃动4次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/3，冰浴条件下放置2h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在5℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在5℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含100μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应60min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在5℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在5℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的 体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置60min，然后在5℃离心，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
实施例3
一种草莓基因组DNA的提取方法，所使用的CTAB提取液包括，2％(m/V)的CTAB，100mM的Tris-HCl，20mM的EDTA，1.4M的NaCl和2％的PVP；CTAB提取液的pH值为8.0。将CTAB提取液在121℃灭菌30min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入2ml的β-巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到50℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入8ml预热后的CTAB提取液，在60℃下保温45分钟，其间晃动3次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的7/24，冰浴条件下放置1.5h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在4℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含80μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应45min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置30～60min，然后在4℃离心，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
实施例4
一种草莓基因组DNA的提取方法，所使用的CTAB提取液包括，1.3％(m/V)的CTAB，82mM的Tris-HCl，15mM的EDTA，1.2M的NaCl和1.3％的PVP；CTAB提取液的pH值为8。将CTAB提取液在112℃灭菌21min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入1.3ml的β-巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到55.5℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5。5ml预热后的CTAB提取液，在55.5℃下保温32分钟，其间晃动3次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4，冰浴条件下放置1.2h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2.5℃离心，转速控制在12000rpm，离心15分钟，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2.5℃离心，转速控制在12000rpm，离心15分钟，；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含42μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应32min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2.5℃离心，转速控制在12000rpm，离心15分钟，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2.5℃离心，转速控制在12000rpm，离心15分钟，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置32min，然后在2.5℃离心，转速控制在12000rpm，离心15分钟，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
实施例5
一种草莓基因组DNA的提取方法，所使用的CTAB提取液包括，2.8％(m/V)的CTAB，112mM的Tris-HCl，23mM的EDTA，1.8M的NaCl和2.9％的PVP；CTAB提取液的pH值为8。将CTAB提取液在118℃灭菌39min， 使用时在每100ml CTAB提取液中加入2.9ml的β-巯基乙醇。所使用的氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到62℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5.5ml预热后的CTAB提取液，在62℃下保温59分钟，其间晃动4次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/3，冰浴条件下放置1.8h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在4.5℃离心，转速控制在10000rpm，离心10分钟，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4.5℃离心，转速控制在10000rpm，离心10分钟；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含98μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应55min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4.5℃离心，转速控制在10000rpm，离心10分钟，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4.5℃离心，转速控制在10000rpm，离心10分钟，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的 体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置55min，然后在4.5℃离心，转速控制在10000rpm，离心10分钟，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
实施例6
一种草莓基因组DNA的提取方法，包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到55℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5ml预热后的CTAB提取液，在55℃下保温30分钟，其间晃动3次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4，冰浴条件下放置1.2h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2℃，转速控制在11000rpm，离心12分钟，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5(4)℃，转速控制在11000rpm，离心12分钟；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含50μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应36min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2.5℃， 转速控制在11000rpm，离心14钟，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在4℃，转速控制在11000rpm，离心12分钟，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和无水乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入无水乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；
-20℃放置55min，然后在4.5℃，转速控制在11000rpm，离心14分钟，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
实施例7
(1)在1g草莓老叶片中加入液氮研磨成粉末；
(2)在草莓叶片粉末中加入65℃、9mL的CTAB提取液，然后加入180μlβ-巯基乙醇充分混匀，在65℃水浴下保温40分钟，其间晃动4次，使其充分混匀，得混合物Ⅰ；
(3)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入3ml的5M醋酸钾溶液，冰上放置1h；
(4)再加入12ml氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，再在4℃下，12000rpm下离心分离10分钟，取出上清液放置于新的离心管中；在上清液中再次加入12ml氯仿/异戊醇混合液，混匀后4℃离心，取上清液10ml于新的离心管，得到中间相Ⅰ；
(5)向步骤(4)中的中间相Ⅰ中加入6.777ml异丙醇，充分混匀，4℃下，12000rpm下离心分离10分钟，去上清，留沉淀物；
(6)向步骤(5)所得的沉淀物中加600μl含50μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，充分融解，37℃水浴30min，得到混合物Ⅱ；
(7)向步骤(6)的混合物Ⅱ中加入600μl的氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，在4℃下12000rpm下离心分离10分钟，取上清液550μl，再加入550μl氯仿/异戊醇混合液，充分混匀，在4℃下12000rpm下离心分离10分钟，取上清液500μl于新的离心管中，得到中间相Ⅱ；
(8)向步骤(7)中的中间相Ⅱ中加入，50μl 3M醋酸钠和1000μl无水乙醇，-20℃放置1h，
然后在4℃下12000rpm下离心15分钟；去上清，沉淀物再用1ml 75％的无乙醇洗涤2次；离心去除上清液，沉淀物即为基因组DNA；
(9)将步骤(8)所得DNA在无菌工作台上吹干残留乙醇，然后向沉淀物中加入100μl TE，溶解后所得混合物即为草莓基因组DNA。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将CTAB提取液预热到55～65℃，每1g草莓果实或叶片粉末中加入5～10ml预热后的CTAB提取液，在55～65℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次使其混合，得到混合物Ⅰ；
(2)将步骤(1)中的混合物Ⅰ中加入5M的醋酸钾溶液，加入醋酸钾溶液的体积为步骤(1)中CTAB提取液体积的1/4～1/3，冰浴条件下放置1-2h，得到混合物Ⅱ；
(3)再加入氯仿/异戊醇混合液，加入的氯仿/异戊醇混合液与混合物Ⅱ等体积；混合后在2-5℃离心，收集上清液；在上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心；重复步骤(3)中操作，直至上清液中无杂质为止，得到中间相Ⅰ；
(4)向步骤(3)所得的中间相Ⅰ中加入异丙醇，加入异丙醇的体积为中间相Ⅰ体积的2/3，产生絮状沉淀，离心得到沉淀物；
(5)向步骤(4)中得到的沉淀物中加入含40～100μg/ml核糖核酸酶的TE缓冲液，然后在37℃的水浴中反应30～60min，得到混合物Ⅱ；
(6)向混合物Ⅱ中加入混合物Ⅱ等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心，取上清液；向上清液中加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇混合液，在2-5℃离心，重复步骤(6)中操作，直至上清液中中无杂质为止，得到中间相Ⅱ；
(7)取步骤(6)所得的中间相Ⅱ，加入3M醋酸钠和乙醇，加入醋酸钠的体积为中间相Ⅱ体积的1/10，加入乙醇的体积为中间相Ⅱ体积的2倍；-20℃放置30～60min，然后在2-5℃离心，收集沉淀物；
(8)向步骤(7)所得的沉淀物中加入TE缓冲液，溶解后即得草莓基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，CTAB提取液包括，1-3％(m/V)的CTAB，80-120mM的Tris-HCl，10-25mM的EDTA，1-2M的NaCl和1-3％的PVP；CTAB提取液的pH值为7.5-8.5。
3.根据权利要求2所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：CTAB提取液包括，2％(m/V)的CTAB，100mM的Tris-HCl，20mM的EDTA，1.4M的NaCl和2％的PVP；CTAB提取液的pH值为8.0。
4.根据权利要求2或3所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：将CTAB提取液在110-120℃灭菌20-40min，使用时在每100ml CTAB提取液中加入1-3ml的β-巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：步骤(7)中，乙醇为无水乙醇。
6.根据权利要求5所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：氯仿/异戊醇混合液中，氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
7.根据权利要求1所述的草莓基因组DNA的提取方法，其特征在于：离心时，转速控制在10000～12000rpm，离心10～15分钟。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505919A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-04-20 | 安徽农业大学 | 一种高效提取酥瓜基因组dna的方法 |
| CN105505917A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种高质量果实基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
| CN108486102A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-09-04 | 新疆农业大学 | 一种新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法 |
| CN109929922A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-06-25 | 贵州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心（贵州国际旅行卫生保健中心） | 一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法 |
| CN111909926A (zh) * | 2019-05-08 | 2020-11-10 | 青岛华大基因研究院 | 植物基因组dna的提取方法和测序方法及应用 |
| CN113502286A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-10-15 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | 富含次生代谢物的植物组织中dna的提取方法 |
| CN113549615A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-10-26 | 浙江大学 | 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 |
| CN117660443A (zh) * | 2023-12-11 | 2024-03-08 | 南京派森诺基因科技有限公司 | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302509A (zh) * | 2008-07-11 | 2008-11-12 | 东北林业大学 | 一种提取植物dna的方法 |
| CN101486747A (zh) * | 2009-02-20 | 2009-07-22 | 浙江省农业科学院 | 一种同时提取植物dna和rna的方法 |
| CN102286460B (zh) * | 2011-06-21 | 2012-12-05 | 湖南省宇秀生物科技有限公司 | 一种改进ctab法提取杏鲍菇中的dna |
| CN103667427A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 |
-
2015
- 2015-01-30 CN CN201510047761.7A patent/CN104805071A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101302509A (zh) * | 2008-07-11 | 2008-11-12 | 东北林业大学 | 一种提取植物dna的方法 |
| CN101486747A (zh) * | 2009-02-20 | 2009-07-22 | 浙江省农业科学院 | 一种同时提取植物dna和rna的方法 |
| CN102286460B (zh) * | 2011-06-21 | 2012-12-05 | 湖南省宇秀生物科技有限公司 | 一种改进ctab法提取杏鲍菇中的dna |
| CN103667427A (zh) * | 2012-09-07 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 用于鉴定草莓种质资源炭疽病抗性的引物序列及其鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 吕秀兰等: "几种果树高质量、高纯度基因组DNA快速大量提取方法的研究", 《中国园艺学会第九届学术年会论文集》 * |
| 张璐璐等: "改良CTAB法提取草莓基因组DNA", 《现代园艺》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105505917A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-04-20 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司 | 一种高质量果实基因组dna的提取方法及提取试剂盒 |
| CN105505919A (zh) * | 2016-01-25 | 2016-04-20 | 安徽农业大学 | 一种高效提取酥瓜基因组dna的方法 |
| CN108486102A (zh) * | 2018-05-23 | 2018-09-04 | 新疆农业大学 | 一种新疆洋葱野生近缘种花基因组dna的提取方法 |
| CN109929922A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-06-25 | 贵州出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心（贵州国际旅行卫生保健中心） | 一种辣椒及制品中转基因成分检测及应用方法 |
| CN111909926A (zh) * | 2019-05-08 | 2020-11-10 | 青岛华大基因研究院 | 植物基因组dna的提取方法和测序方法及应用 |
| CN113502286A (zh) * | 2021-08-16 | 2021-10-15 | 天津诺禾致源生物信息科技有限公司 | 富含次生代谢物的植物组织中dna的提取方法 |
| CN113549615A (zh) * | 2021-08-30 | 2021-10-26 | 浙江大学 | 一种高质量草莓基因组dna的分离提取方法 |
| CN117660443A (zh) * | 2023-12-11 | 2024-03-08 | 南京派森诺基因科技有限公司 | 一种浆果果实基因组dna高质量提取方法 |
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