CN103724425B - 一种重组人生长激素粗提中的提取方法 - Google Patents

一种重组人生长激素粗提中的提取方法 Download PDF

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Abstract

一种重组人生长激素粗提中的提取方法，用于重组人生长激素的粗提阶段，包括：配制20mM磷酸盐缓冲液(PBS)，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比例是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；菌体加入缓冲体系裂解。离心、收集上清液；上清液中加入梯度硫酸铵盐析，离心，收集离心沉淀。离心沉淀使用解缓冲液溶解，离心，得含蛋白的上清液,完成粗提，本发明的积极效果是：用本发明破菌缓冲体系裂解冻融菌体，能够使在大肠杆菌菌体中的重组尿酸氧化酶通过破菌缓冲体系的压差释放量更高，可获得较高的重组人生长激素产量，比10mMTE缓冲体系的蛋白收率高20％-30％，该方法经济、高效、容易操作，利于工业规模的生产。

Description

一种重组人生长激素粗提中的提取方法
技术领域
本发明属于医药技术，具体涉及重组人生长激素粗提取。
背景技术
生长激素能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖类及脂肪的代谢，对人体新陈代谢等各种生理功能有广泛的调节功能。现有技术中重组人生长激素粗提过程包括用由TPS-Hgh为菌体(以大肠杆菌做载体，通过基因工程的技术构建，中国专利：20120580558.2)，经Tris-EDTA缓冲液(TE)在磁力搅拌器上搅拌裂解，离心，收集离心上清液。在上清液中加入梯度硫酸铵和梯度氯化钠，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析，离心，收集离心沉淀。离心沉淀使用裂解缓冲液进行溶解，溶解后离心，收集上清样品，其后，再进入精提取步骤。现有的提取方法中目标蛋白收率较低，而且杂质较多。破菌比例大，浪费原材料，在实际生产中造成成本增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人生长激素粗提中的提取方法，用于重组人生长激素的粗提阶段，克服现有的粗提过程存在的上述不足。
本发明的方法包括以下步骤：
1、制备破菌缓冲体系：配制20mM磷酸盐缓冲液(PBS),盐酸调节pH至7.5-8.0，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比例是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；
2、菌体称定：等量称量2份TPS-Hgh工程菌菌体备用；
3、菌体裂解：将步骤2所取菌体按菌体：缓冲体系为1:6，放在磁力搅拌器上裂解1h至菌体完全溶解；
4、裂解液离心：将步骤3所得裂解液等量称量后，对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，收集离心上清液；
5、上清液盐析：在步骤4所得上清液中加入梯度硫酸铵，硫酸铵和上清液的质量体积比是243g、277g、313g、351g、390g、430g、472g/1000ml；氯化钠和上清蛋白盐析液的质量体积比分别是233g、263g、292g、321g、351g/1000ml，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析30min，再次离心，参数同上，收集离心沉淀。
6、沉淀溶解：离心沉淀使用20mM磷酸盐缓冲液(PBS)，溶解后对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，得含蛋白的上清液,完成粗提，
本发明的积极效果是：用本发明破菌缓冲体系裂解冻融菌体，能够使在大肠杆菌菌体中的重组尿酸氧化酶通过破菌缓冲体系的压差释放量更高，可获得较高的重组人生长激素产量，比10mMTE缓冲体系的蛋白收率高20％-30％，该方法经济、高效、容易操作，利于工业规模的生产。
图1本发明所得粗提物不同梯度硫酸铵盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。
图2.本发明所得粗提物硫酸铵和氯化钠盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。
图3.本发明所得粗提物和现有技术TE缓冲体系所得粗提物硫酸铵盐析SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
1、制备破菌缓冲体系：配制20mM磷酸盐缓冲液(PBS),盐酸调节pH至7.5-8.0，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比例是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；
2、菌体称定：等量称量2份TPS-Hgh工程菌菌体备用；
3、菌体裂解：将步骤2所取菌体按菌体：缓冲体系为1:6，放在磁力搅拌器上裂解1h至菌体完全溶解；
4、裂解液离心：将步骤3所得裂解液等量称量后，对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，收集离心上清液；
5、上清液盐析：在步骤4所得上清液中加入梯度硫酸铵，硫酸铵和上清蛋白盐析液的质量体积比是243g、277g、313g、351g、390g、430g、472g/1000ml；氯化钠和上清蛋白盐析液的质量体积比分别是233g、263g、292g、321g、351g/1000ml，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析30min，再次离心，参数同上，收集离心沉淀。
6、沉淀溶解：离心沉淀使用20mM磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，溶解后对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，得含蛋白的上清液,得粗提物。
本发明实施例所得粗提物相关检测
参照《中国药典》三部附录VIB蛋白质测定法第二法“Lowry”进行蛋白含量测定。将样品稀释31倍，用紫外分光光度计检测蛋白含量。数据如下：公式为C＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×1.23×稀释倍数
表1.PB缓冲液下紫外分光光度检测蛋白浓度
盐析种类梯度 OD280 OD260 稀释倍数 蛋白浓度(mg/ml)
5.5MNaCl 0.264 0.256 31 7.4
6MNaCl 0.314 0.303 31 8.8
40％(NH4)2SO4 0.578 0.614 31 14.6
45％(NH4)2SO4 0.586 0.633 31 14.5
50％(NH4)2SO4 0.605 0.655 31 15.0
在相同稀释倍数下，硫酸铵比氯化钠盐析的蛋白浓度高。
表2.表2TE缓冲液下紫外分光光度检测蛋白浓度
盐析种类梯度 OD280 OD260 稀释倍数 蛋白浓度(mg/ml)
5.5MNaCL 0.138 0.10 31 4.81
6MNaCL 0.132 0.096 31 4.62
40％(NH4)2SO4 0.383 0.390 31 10.20
45％(NH4)2SO4 0.434 0.452 31 11.15
50％(NH4)2SO4 0.453 0.481 31 11.48
在相同稀释倍数下，TE破菌缓冲体系比PB破菌缓冲体系的蛋白含量低。
表3.TE/PB缓冲体系紫外分光光度检测蛋白浓度
盐析梯度 OD280 OD260 稀释倍数 蛋白浓度(mg/ml)
TE45％ 0.416 0.438 31 10.86
TE50％ 0.450 0.471 31 11.59
PB45％ 0.638 0.651 31 16.91
PB50％ 0.603 0.636 31 15.40
在相同稀释倍数下，PB破菌缓冲体系下45％硫酸铵的蛋白浓度最高。
鉴别条件
SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白含量
样品处理：将收集的上清液样品取40μl，加入40μl还原型缓冲液，混匀，沸水浴5min，离心5min(10000rpm/min、温度8℃)。
上样：取样品20μl进行点样，Marker上样5μl。进行电泳、脱色、照相、分析。其中，用硫酸铵盐析本实施例所得粗提物的到电泳图(图1)中，第二道电泳道即45％的硫酸铵浓度下得到的粗蛋白量最大，杂质最少。用硫酸铵和氯化钠盐析本实施例所得粗提物后的到电泳图(图2)中，第三道即45％硫酸铵处得到的粗蛋白量最大，杂质最少。用硫酸铵盐析本实施例所得粗提物和现有技术TE缓冲体系所得粗提物硫酸铵盐析电泳图(图3)中，第三道即45％的硫酸铵处得到的粗蛋白量最大，杂质最少。最终确定PB裂解缓冲体系下，用45％的硫酸铵盐析，电泳带含量高，杂质少。

Claims (1)

1.一种重组人生长激素粗提中的提取方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)制备破菌缓冲体系：配制20mM磷酸盐缓冲液(PBS),盐酸调节pH至7.5-8.0，缓冲液成分为：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA、纯化水，用量比例是5.732g:0.624g:0.292g：1000ml；
(2)菌体称定：等量称量2份TPS-Hgh工程菌菌体备用；
(3)菌体裂解：将步骤(2)所取菌体和步骤(1)制备的缓冲液按菌体：缓冲体系为1:6，放在磁力搅拌器上裂解1h至菌体完全溶解；
(4)裂解液离心：将步骤(3)所得裂解液等量称量后，对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，收集离心上清液；
(5)上清液盐析：在步骤(4)所得上清液中加入梯度硫酸铵，硫酸铵和上清液的质量体积比是243g、277g、313g、351g、390g、430g、472g/1000ml；氯化钠和上清蛋白盐析液的质量体积比分别是233g、263g、292g、321g、351g/1000ml，用玻璃棒搅拌至完全溶解，盐析30min，再次离心，参数同上,收集离心沉淀；
(6)沉淀溶解：将步骤(5)得到的离心沉淀使用20mM磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，溶解后对称放入离心机转子腔内，在转速6900rpm，温度4-8℃条件下离心30min，得含蛋白的上清液,完成粗提。
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