CN112062830A - 一种快速制备重组人生长激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，属于生物分离工程技术领域。该技术方案首先对发酵所得的菌体进行裂解，使胞内产物得以释放，而后离心收集上清，对所得到的上清液，加入缓冲液并调整pH值，再微滤去除不溶性颗粒，而后以特定条件先后进行层析分离和超滤浓缩，最终得到成品。通过对工艺方法的创新改进，本发明可以快速有效的提取纯化生长激素，得到的生长激素纯度高，同时具有工艺简单、回收率高、生产时间短等优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物分离工程技术领域，具体涉及一种快速制备重组人生长激素的纯化方法。
背景技术
人生长激素(human growth hormone，hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种非糖基化的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。重组人生长激素(recombinant hGH，rhGH)为重组DNA技术生产的基因工程药物，由191个氨基酸残基组成，其结构和氨基酸序列与天然的hGH一致，被广泛用于成人和儿童的生长激素缺乏症。
目前，对人生长激素的纯化，国内外研究者普遍着眼于离子、疏水、分子筛等传统方法，上述纯化工艺存在着步骤繁杂、操作时间长、回收率低、生产成本高等问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，以解决现有技术中，针对重组人生长激素的常规纯化方法，其工艺复杂、工艺步骤多、生产时间长、生产成本高等技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，包括以下步骤：收集菌体，缓冲液裂解提取，离心收集上清，加入缓冲液并调整pH值，层析分离，超滤浓缩。
作为优选，在所述缓冲液裂解提取步骤中，用浓度为1～200mM的磷酸盐缓冲液并调节pH至5～9，室温搅拌提取0.5～3h。
作为优选，所述缓冲液裂解提取步骤，包括：
1)配制浓度为1～200mM的磷酸盐缓冲液并调节pH至5～9；
2)取所述菌体以及步骤1)所得缓冲液，将二者按1～3:30的重量比在搅拌罐中混合，以100～300rpm的转速、4～30℃的温度搅拌0.5～3h。
作为优选，在所述离心收集上清步骤中，离心的转速为8000～14000rpm，离心的时长为10～30min。
作为优选，所述离心收集上清步骤，包括：用落地离心机以8000～15000rpm的转速离心10～30min，收集上清液、弃去固体。
作为优选，在所述加入缓冲液并调整pH值步骤中，用浓度为0.1～0.5M的氢氧化钠溶液调节pH至5～9，而后以0.04～20μm孔径过滤去除不溶性颗粒。
作为优选，所述加入缓冲液并调整pH值步骤，包括：
1)向所述上清中加入0.1～0.5M磷酸盐缓冲液，调整pH至5～9；
2)用0.04～20μm的过滤器进行过滤，收集滤过液。
作为优选，所述层析分离步骤包括：
1)溶液A配制：配制20mM磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15M氯化钠，调节pH至5-9(更优的，该pH值为6～8)；
溶液B配制：配制0.1-0.2M的甘氨酸溶液，调节pH至2.2-5.5(更优的，该pH值为2.5～4.5)；
溶液C配制：配制0.1-0.2M的甘氨酸溶液，调节pH至2.0；
溶液D配制：配制20％乙醇溶液；
2)色谱柱体积CV为40mL-500L；用溶液A平衡色谱柱3-10CV；将所述加入缓冲液并调整pH值步骤所得的产物加入到色谱柱中，上样流速为10-250cm/h；再用溶液A进行清洗3-10CV；用溶液B进行洗脱3-10CV，收集洗脱液；再用溶液C清洗3-10CV；再用溶液D清洗3-10CV，最后保存在溶液D中。
作为优选，在所述层析分离步骤中，所使用的填料是由Thermo scientific公司出品的CaptureSelect Human Growth Hormone Affinity Matrix系列填料。
作为优选，在所述超滤浓缩步骤中，超滤膜包的截留分子量为3000～10000道尔顿；超滤浓缩3～20倍。
作为优选，在所述超滤浓缩步骤中，所使用的超滤膜包是由Merck公司出品的Biomax系列超滤膜包。
本发明提供了一种快速制备重组人生长激素的纯化方法。该技术方案首先对发酵所得的菌体进行裂解，使胞内产物得以释放，而后离心收集上清，对所得到的上清液，加入缓冲液并调整pH值，再微滤去除不溶性颗粒，而后以特定条件先后进行层析分离和超滤浓缩，最终得到成品。通过对工艺方法的创新改进，本发明可以快速有效的提取纯化生长激素，得到的生长激素纯度高，同时具有工艺简单、回收率高、生产时间短等优势。
附图说明
图1是本发明方法的流程图。
图2是本发明实施例1的电泳结果图。
图3是本发明实施例2的电泳结果图。
图4是本发明实施例3的电泳结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
收集发酵生产的菌体按1:5加入10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.0)室温搅拌2hr；使用离心机离心12000rpm离心10min，收集离心上清液；上清液使用0.04-20μm过滤，收集滤液，调节pH至7.0。
层析：流速3ml/min(33cm/hr)、CV＝39mL、柱直径＝26mm
层析填料：CaptureSelect Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo)
缓冲液：溶液A：20mM PB+0.15M NaCl(pH 7.0)
溶液B：0.1M甘氨酸溶液(pH 3.0)
溶液C：0.1M甘氨酸溶液(pH 2.0)
溶液D：20％乙醇溶液。
平衡：用溶液A平衡3倍柱体积(CV)，
上样：将过滤后的样品溶液1400ml上样，
洗涤：上样后用溶液A清洗5CV，
洗脱：用溶液B进行洗脱5CV，收集洗脱的目的蛋白(附图2)，
再生：用溶液C清洗1.5倍柱体积；再用溶液A清洗2倍柱体积；再用溶液D冲洗3CV，保存。
实施例2
收集发酵生产的菌体按1:15加入10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.0)室温搅拌2hr；使用离心机离心12000rpm离心10min，收集离心上清液；上清液使用0.04-20μm过滤，收集滤液，调节pH至7.0。
层析：流速6ml/min(67cm/hr)、CV＝39mL、柱直径＝26mm
层析填料：CaptureSelect Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo)
缓冲液：溶液A：20mM PB+0.10M NaCl(pH 7.0)
溶液B：0.1M甘氨酸溶液(pH 2.5)
溶液C：0.1M甘氨酸溶液(pH 2.0)
溶液D：20％乙醇溶液。
平衡：用溶液A平衡3倍柱体积(CV)，
上样：将过滤后的样品溶液1400ml上样，
洗涤：上样后用溶液A清洗3CV，
洗脱：用溶液B进行洗脱5CV，收集洗脱的目的蛋白(附图3)
再生：用溶液C清洗1.5倍柱体积；再用溶液A清洗2倍柱体积；再用溶液D冲洗3CV，保存。
实施例3
收集发酵生产的菌体按1:15加入10mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.0)室温搅拌2hr；使用离心机离心12000rpm离心10min，收集离心上清液；上清液使用0.04-20μm过滤，收集滤液，调节pH至7.0。
层析：流速6ml/min(67cm/hr)、CV＝39mL、柱直径＝26mm
层析填料：CaptureSelect Human Growth Hormone Affinity Matrix(Thermo)
缓冲液：溶液A：20mM PB+0.10M NaCl(pH 7.0)
溶液B：0.1M甘氨酸溶液(pH 3.5)
溶液C：0.1M甘氨酸溶液(pH 2.0)
溶液D：20％乙醇溶液。
平衡：用溶液A平衡3倍柱体积(CV)，
上样：将过滤后的样品溶液1400ml上样，
洗涤：上样后用溶液A清洗3CV，
洗脱：用溶液B进行洗脱5CV，收集洗脱的目的蛋白(图4)
再生：用溶液C清洗1.5倍柱体积；再用溶液A清洗2倍柱体积；再用溶液D冲洗3CV，保存。
超滤浓缩步骤是使用Merck生产的Biomax系列的超滤膜包，其截留分子量为5000-8000道尔顿。具体步骤如下：用Merck生产的Biomax系列的超滤膜包，其截留分子量为5000-8000道尔顿，超滤浓缩3-5倍
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：收集菌体，缓冲液裂解提取，离心收集上清，加入缓冲液并调整pH值，层析分离，超滤浓缩。
2.根据权利要求1所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，在所述缓冲液裂解提取步骤中，用浓度为1～200mM的磷酸盐缓冲液并调节pH至5～9，室温搅拌提取0.5～3h。
3.根据权利要求2所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液裂解提取步骤，包括：
1)配制浓度为1～200mM的磷酸盐缓冲液并调节pH至5～9；
2)取所述菌体以及步骤1)所得缓冲液，将二者按1～3:30的重量比在搅拌罐中混合，以100～300rpm的转速、4～30℃的温度搅拌0.5～3h。
4.根据权利要求1所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，在所述离心收集上清步骤中，离心的转速为8000～14000rpm，离心的时长为10～30min。
5.根据权利要求4所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，所述离心收集上清步骤，包括：用落地离心机以8000～15000rpm的转速离心10～30min，收集上清液、弃去固体。
6.根据权利要求1所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，在所述加入缓冲液并调整pH值步骤中，用浓度为0.1～0.5M的氢氧化钠溶液调节pH至5～9，而后以0.04～20μm孔径过滤去除不溶性颗粒。
7.根据权利要求6所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，所述加入缓冲液并调整pH值步骤，包括：
1)向所述上清中加入0.1～0.5M磷酸盐缓冲液，调整pH至5～9；
2)用0.04～20μm的过滤器进行过滤，收集滤过液。
8.根据权利要求1所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，所述层析分离步骤包括：
1)溶液A配制：配制20mM磷酸盐缓冲溶液，并加入0.1-0.15M氯化钠，调节pH至5-9；
溶液B配制：配制0.1-0.2M的甘氨酸溶液，调节pH至2.2-5.5；
溶液C配制：配制0.1-0.2M的甘氨酸溶液，调节pH至2.0；
溶液D配制：配制20％乙醇溶液；
2)色谱柱体积CV为40mL-500L；用溶液A平衡色谱柱3-10CV；将所述加入缓冲液并调整pH值步骤所得的产物加入到色谱柱中，上样流速为10-250cm/h；再用溶液A进行清洗3-10CV；用溶液B进行洗脱3-10CV，收集洗脱液；再用溶液C清洗3-10CV；再用溶液D清洗3-10CV，最后保存在溶液D中。
9.根据权利要求8所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，在所述层析分离步骤中，所使用的填料是由Thermo scientific公司出品的CaptureSelectHuman Growth Hormone Affinity Matrix系列填料。
10.根据权利要求1所述的一种快速制备重组人生长激素的纯化方法，其特征在于，在所述超滤浓缩步骤中，超滤膜包的截留分子量为3000～10000道尔顿；超滤浓缩3～20倍。
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