CN102731642B - 从人血浆组分四沉淀制备高纯Apoa-I的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从血浆组分四沉淀中制备高纯度载脂蛋白Apoa-I的生产工艺，是通过一步离心加一步离子柱层析法从血浆组分四沉淀中制备高纯度Apoa-I。本发明的生产工艺具有设备简单、操作方便、步骤少、生产周期短、蛋白回收率高、适于工业化大规模生产等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种从血浆组分四沉淀中制备高纯度载脂蛋白Apoa-I的生产工艺。
背景技术
载脂蛋白a-I(Apolipoprotein a-I，简称Apoa-I)是高密度脂蛋白(High DensityLipoprotein，HDL)的主要载脂蛋白，为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量28.3kD。HDL主要功能是参与胆固醇逆向转运(Reverse Cholesterol Transport，RCT)，将外周组织细胞中的胆固醇移出并转运至肝脏转化清除，因而具有对抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)发生及发展的重要作用，而Apoa-I是HDL抗AS功能的主要承担者。同时，Apoa-I也具有抗炎抗内毒素的功能，因此是脂类代谢研究重点之一。另外，由于Apoa-I具有肝脏靶向作用的特点，在靶向药物研究中也有良好的应用前景。
目前Apoa-I的常用制备方法有超速离心法、有机溶剂沉淀法和高效液相法等，虽能得到高纯度Apoa-I，但具有一些很明显的缺点：①制备量小，不适于工业生产；②蛋白得率低，经超离心、有机溶剂沉淀、柱层析等多步处理，在制备过程中损失了大部分Apoa-I；③成本高，需要超速离心机等贵重仪器；④安全性差，乙醇、丙酮、三氯乙酸等有机溶剂不仅具有生理毒性，而且易燃易爆，不利与安全生产。
另一方面，血浆组分四是人血浆经Cohn低温乙醇法处理后的剩余部分，因不能利用而被丢弃，其主要蛋白成分是白蛋白和β脂蛋白。本发明提供一种工艺方法，从组分四中纯化得到高纯度Apoa-I，使血浆资源得到更充分的利用。
发明内容
本发明的目的是以目前尚未被充分利用的人血浆组分四沉淀为原料，提供一种工序简单，操作方便，生产周期短，得率高，适用于工业化大规模生产的高纯载脂蛋白Apoa-I纯化工艺，产品用于治疗动脉粥状硬化等心脑血管疾病。
本发明提供的技术方案是通过一步离心加一步离子柱层析法从血浆组分四沉淀中制备高纯度Apoa-I，从而具有设备简单、操作方便、步骤少、生产周期短、蛋白回收率高、适于工业化大规模生产等优点。
本发明利用Apoa-I的理化特性如等电点，密度等，通过调解悬浮液的酸度与离子强度获得合适的分离条件，离心获得富含Apoa-I的蛋白沉淀，然后复溶沉淀，上离子交换层析柱，选用合适的上样与洗脱条件，实现Apoa-I与杂蛋白的高效分离，达到了纯化目的。
本发明技术方案的关键点在于离心获得Apoa-I蛋白沉淀然后以一步阴离子交换层析纯化Apoa-I。在离心步骤中，获得富含Apoa-I的蛋白沉淀。在阴离子交换层析步骤中，选择合适的上柱条件，Apoa-I与某些杂蛋白被一起结合到层析柱上，其它杂蛋白则随流穿液除去，然后以含一定浓度的尿素缓冲液洗脱，最终获得高纯Apoa-I蛋白溶液。
本发明提出的Apoa-I生产工艺流程参见附图1
具体操作步骤如下：
(1)组分四沉淀溶解
将组分四沉淀溶解于缓冲液(pH5.5～11.0左右)中，搅拌使之充分溶解。
所述溶解用缓冲液可为：醋酸盐缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。溶解用缓冲液温度为0～30℃，优选2-15℃。
组分四湿沉淀与溶解液重量比一般控制在1∶5～1∶20
(2)离心获得Apoa-I沉淀
在悬浮液中加入一定浓度的盐(0.2～6％W/W)，然后调解pH值至酸性(pH4.8～6.8)，降温(-3～20℃)，而后高速离心，收集沉淀，即为Apoa-I沉淀，弃上清液。
所述盐可为氯化钠。
pH调节剂可为：盐酸水溶液、醋酸水溶液等。
高速离心是指离心速度在5000rpm以上。
(3)复溶Apoa-I沉淀
将Apoa-I沉淀充分溶解于缓冲液(pH5.5～11.0左右)中，然后用微孔滤膜(如0.45μm滤膜)过滤。
所述复溶用缓冲液可为：醋酸盐缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。复溶用缓冲液温度为0～30℃，优选10.0-25.0℃。
Apoa-I沉淀与溶解液重量比一般控制在1∶5～1∶20
(4)病毒灭活处理
将溶解好的吐温80及TNBP(磷酸三丁脂)加到滤液中，在25±1.0℃下保温至少6个小时，完成第一步病毒灭活处理。
较佳的，吐温80的添加量为1.0-1.1g/100ml滤液；TNBP的添加量为0.3-0.32g/100ml滤液。
(5)柱层析
将上一步骤获得的Apoa-I滤液以合适的流速上阴离子层析柱，Apoa-I与部分杂蛋白结合到层析柱上，另一部分杂蛋白流穿。然后用含尿素(2-8M)的缓冲液洗脱层析柱，Apoa-I则被洗脱下来，经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的Apoa-I，而杂蛋白洗脱液中基本不含Apoa-I。
滤液上柱前需pH值调节为5.5～11.0，离子强度调节为电导率0.5～15ms/cm。
所述阴离子层析柱优选DEAE FF阴离子层析柱。
pH调节剂可选自：盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液。
离子强度调节剂可选自：氯化钠、醋酸钠等。
上样流速一般为60-240cm/h，优选100-200cm/h。
洗脱用缓冲液可以选自：醋酸盐缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。洗脱用缓冲液的pH值为5.5-11.0。
进一步的，经阴离子柱层析分离纯化的Apoa-I溶液还可经后处理(如超滤等)、病毒灭活、无菌过滤、罐装制成液体制剂，或进一步冻干后制成冻干制剂。
具体的，Apoa-I洗脱液后处理可以为：将洗脱下来的Apoa-I经超滤透析，然后浓缩至合适浓度，并添加稳定剂。调pH值至7.0±02。
浓缩后，Apoa-I在洗脱液中的浓度优选6-8％(g/100ml)。
稳定剂可选自：常见的糖醇类稳定剂如蔗糖，浓度优选为10-30wt％；山梨醇或甘露醇，浓度优选5±0.1％(g/100ml)；也可为白蛋白，浓度优选0.5-2.5％(g/100ml)
病毒灭活可为将以上溶液通过纳米膜(如DV20纳米膜)过滤，完成第二步病毒灭活处理。
本发明的特点：
(1)该工艺制备Apoa-I具有很高的选择性，纯度很高，液体制剂或冻干粉纯度可达95％以上，Apoa-I得率也很高，可达70％以上。
(2)制备过程不涉及有机溶剂，操作安全方便。
(3)中试结果表明，离心与柱层析结合纯化Apoa-I，很容易实现工艺放大，非常适合工业化生产。
附图说明
图1：人血浆载脂蛋白Apoa-I生产工艺流程框图
图2：连续三批Apoa-I小试样品的SDS-PAGE电泳结果图
其中1，5，10分别为实施例1的Apoa-I沉淀溶解液，2，6，8分别为实施例1尿素洗脱液起始段收集样品；3，7，9分别为实施例1尿素洗脱液主体收集样品；4为低分子量标准品。
图3：Apoa-I中试冻干样品复溶液的SDS-PAGE电泳结果图
其中1为低分子量标准蛋白条带，2为白蛋白条带，3，4，5，6，7，8为实施例4中冻干样品复溶液的蛋白条带(Apoa-I)(不同冻干配方)
具体实施方式
实施例1、Apoa-I小试样品制备
(1)组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀50克(湿重，含硅藻土)，溶于450克醋酸盐缓冲液(0～2℃)中，调pH值约6.0左右，充分搅拌使之溶解。
(2)离心获得Apoa-I沉淀
在悬浮液中加入氯化钠使其浓度达到6％左右，然后调解pH值至4.8左右，降温至-3℃左右。然后用Eppendorf centrifuge 5804R高速离心(9000rpm)，收集富含Apoa-I的沉淀约40g，弃上清液。
(3)复溶Apoa-I沉淀
将Apoa-I沉淀40g充分溶解于360g约30℃左右的醋酸盐缓冲液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)S/D处理
加吐温80及TNBP于滤液中，在25℃下保温6个小时。完成第一步病毒灭活处理。
吐温80加量1.0g/100ml滤液，TNBP加量0.3g/100ml。
(5)柱层析
调整Apoa-I滤液的酸度pH为6.50左右与离子强度为13ms/cm，以120cm/h流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积30ml，层析填料为DEAESepharose FF，纯化设备为AKTA EXPLORER 100，Apoa-I与某些杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用含尿素(2mol/L)的醋酸盐缓冲液洗脱DEAE层析柱，Apoa-I首先被洗脱下来；收集洗脱液约60ml，再用高浓度氯化钠溶液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂蛋白洗脱除去，经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的Apoa-I，而杂蛋白洗脱液中基本不含Apoa-I。
(6)Apoa-I洗脱液后处理
洗脱下来的Apoa-I经millipore labscale TFF system超滤浓缩，用醋酸盐缓冲液进行透析，然后浓缩至7％左右，并加甘露醇至5％作为稳定剂。调节蛋白浓度至5％并调pH值至7.0左右。
(7)纳米膜过滤
将以上溶液通过DV20纳米膜过滤，完成第二步病毒灭活处理。
(8)无菌过滤及罐装
经纳米膜过滤的溶液再进行无菌过滤，按2ml/瓶分装，成为液体制剂。
(9)或进一步经冻干制成冻干制剂
产物经SDS-PAGE方法检测，纯度为95％以上，分子量为28KD，经试验验证具有Apoa-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为Apoa-I蛋白。计算Apoa-I得率为74.5％(获得的Apoa-I与原料血浆组分四中Apoa-I的重量比)。
实施例2、Apoa-I小试样品制备
(1)组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀50克(湿重，含硅藻土)，溶于450克tris缓冲液(28-30℃)中，调pH值约10.0左右，充分搅拌使之溶解。
(2)离心获得Apoa-I沉淀
在悬浮液中加入氯化钠使其浓度达到0.2％左右，然后调解pH值至5.8左右，降温至20℃左右。然后用Eppendorfcentrifuge 5804R高速离心(9000rpm)，收集富含Apoa-I的沉淀约40g，弃上清液。
(3)复溶Apoa-I沉淀
将Apoa-I沉淀40g充分溶解于360g约5℃左右的tris缓冲液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)S/D处理
加吐温80及TNBP于滤液中，在25℃下保温6个小时。完成第一步病毒灭活处理。
(5)柱层析
调整Apoa-I滤液的酸度pH为8.0左右与离子强度为10ms/cm，以60cm/h流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积30ml，层析填料为DEAESepharose FF，纯化设备为AKTA EXPLORER 100，Apoa-I与某些杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用含尿素(4.5mol/L)的Tris缓冲液洗脱DEAE层析柱，Apoa-I首先被洗脱下来；收集洗脱液约60ml，再用高浓度氯化钠溶液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂蛋白洗脱除去，经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的Apoa-I，而杂蛋白洗脱液中基本不含Apoa-I。
(6)Apoa-I洗脱液后处理
洗脱下来的Apoa-I经millipore labscale TFF system超滤浓缩，用tris缓冲液进行透析，然后浓缩至7％左右，并加甘露醇至5％作为稳定剂。调节蛋白浓度至5％并调pH值至7.0左右。
(7)纳米膜过滤
将以上溶液通过DV20纳米膜过滤，完成第二步病毒灭活处理。
(8)无菌过滤及罐装
经纳米膜过滤的溶液再进行无菌过滤，按2ml/瓶分装，成为液体制剂。
(9)或进一步经冻干后成为冻干制剂。
产物经SDS-PAGE方法检测，纯度为95％以上，分子量为28KD，经试验验证具有Apoa-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为Apoa-I蛋白。计算Apoa-I得率为76.8％(获得的Apoa-I与原料血浆组分四中Apoa-I的重量比)。
实施例3、Apoa-I小试样品制备
(1)组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀50克(湿重，含硅藻土)，溶于450克磷酸盐缓冲液(14-16℃)中，调pH值约8.5左右，充分搅拌使之溶解。
(2)离心获得Apoa-I沉淀
在悬浮液中加入氯化钠使其浓度达到1％左右，然后调解pH值至6.50左右，降温至0℃左右。然后用Eppendorf centrifuge 5804R高速离心(9000rpm)，收集富含Apoa-I的沉淀约40g，弃上清液。
(3)复溶Apoa-I沉淀
将Apoa-I沉淀40g充分溶解于360g约15℃左右的磷酸盐缓冲液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)S/D处理
加吐温80及TNBP于滤液中，在25℃下保温6个小时。完成第一步病毒灭活处理。
(5)柱层析
调整Apoa-I滤液的酸度pH为5.5左右与离子强度为0.5ms/cm，以200cm/h流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积30ml，层析填料为DEAESepharose FF，纯化设备为AKTA EXPLORER 100，Apoa-I与某些杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用含尿素(6mol/L)的磷酸盐缓冲液洗脱DEAE层析柱，Apoa-I首先被洗脱下来；收集洗脱液约60ml，再用高浓度氯化钠溶液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂蛋白洗脱除去，经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的Apoa-I，而杂蛋白洗脱液中基本不含Apoa-I。
(6)Apoa-I洗脱液后处理
洗脱下来的Apoa-I经millipore labscale TFF system超滤浓缩，用磷酸盐缓冲液进行透析，然后浓缩至7％左右，并加甘露醇至5％作为稳定剂。调节蛋白浓度至5％并调pH值至7.0左右。
(7)纳米膜过滤
将以上溶液通过DV20纳米膜过滤，完成第二步病毒灭活处理。
(8)无菌过滤及罐装
经纳米膜过滤的溶液再进行无菌过滤，按2ml/瓶分装，成为液体制剂。
(9)或进一步经冻干制成冻干制剂
产物经SDS-PAGE方法检测，纯度为95％以上，分子量为28KD，经试验验证具有Apoa-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为Apoa-I蛋白。计算Apoa-I得率为73.2％(获得的Apoa-I与原料血浆组分四中Apoa-I的重量比)。
实施例4、Apoa-I中试样品制备
(1)组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀5千克(湿重，含硅藻土)，溶于45千克磷酸盐缓冲液(8～10℃)中，调pH值约7.5左右，充分搅拌使之溶解。
(2)离心获得Apoa-I沉淀
在悬浮液中加入氯化钠使其浓度达到2％左右，然后调解pH值至4.80左右，降温至-1℃左右。然后用Beckman离心机(7000rpm)高速离心，收集Apoa-I沉淀约4kg，弃上清液。
(3)复溶Apoa-I沉淀
将Apoa-I沉淀4kg充分溶解于36kg约0℃左右的磷酸盐缓冲液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)S/D处理
加吐温80及TNBP于滤液中，在25℃下保温6个小时。完成第一步病毒灭活处理。
(5)柱层析
调整Apoa-I滤液的酸度pH为11.0左右与离子强度为15ms/cm，以120cm/h流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积3升，层析填料为DEAESepharose FF)，Apoa-I与某些杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用含尿素(8mol/L)的磷酸盐缓冲液洗脱DEAE层析柱，Apoa-I首先被洗脱下来；收集洗脱液约6升，再用高浓度氯化钠溶液洗涤DEAE层析柱，将绝大部分杂蛋白洗脱除去，经SDS-PAGE电泳检测，获得了电泳纯的Apoa-I，而杂蛋白洗脱液中基本不含Apoa-I。
(6)Apoa-I洗脱液后处理
洗脱下来的Apoa-I经millipore pilot system超滤浓缩，用磷酸盐缓冲液进行透析，然后浓缩至7％左右，加甘露醇至5％，调节蛋白浓度至5％并调pH值至7.0左右。
(7)纳米膜过滤
将以上溶液通过DV20纳米膜过滤，完成第二步病毒灭活处理。
(8)无菌过滤及罐装
经纳米膜过滤的滤液再进行无菌过滤，按2ml/瓶分装。
(9)冻干
经冷冻干燥，即制成Apoa-I冻干制剂。
产物经SDS-PAGE方法检测，纯度为95％以上，分子量为28KD，经试验验证具有Apoa-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为Apoa-I蛋白。计算Apoa-I得率为72.1％(获得的Apoa-I与原料血浆组分四中Apoa-I的重量比)。
Claims (10)
1.一种从人血浆组分四沉淀中分离Apoa-I的方法，包括下列步骤：
（1）将组分四沉淀溶解于pH5.5～11.0的缓冲液中；
（2）在悬浮液中加入重量百分比为0.2～6%的氯化钠，调解pH值至酸性，降温至-3～20℃析出沉淀，而后高速离心，收集沉淀，获得Apoa-I沉淀，弃上清液；
（3）复溶Apoa-I沉淀：将Apoa-I沉淀溶解于pH5.5～11.0的缓冲液中，然后用微孔滤膜过滤；
（4）病毒灭活处理；
（5）柱层析：先将经步骤（4）处理的Apoa-I滤液上阴离子层析柱，所述阴离子层析柱为DEAE FF阴离子层析柱，然后用含2-8M尿素的缓冲液洗脱层析柱并收集洗脱液，获得电泳纯的Apoa-I溶液；
（6）将洗脱收集液进行超滤，加稳定剂，调pH值后进行无菌过滤，后罐装；
所述血浆组分四是人血浆经Cohn低温乙醇法处理后的剩余部分；
步骤（1）中溶解用缓冲液及步骤（3）中复溶用缓冲液均选自醋酸盐缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中溶解用缓冲液及步骤（3）中复溶用缓冲液的温度均为0-30℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）的病毒灭活处理方法为：将溶解好的吐温80及TNBP加到步骤（3）获得的滤液中，24-26℃下保温至少6个小时，完成病毒灭活处理。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述吐温80的添加量为1.0-1.1g/100ml滤液；所述TNBP的添加量为0.30-0.32g/100ml滤液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，滤液上柱前需pH值调节为5.5-11.0，离子强度调节为电导率0.5-15ms/cm。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，调节pH用调节剂选自：盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液,调节离子强度用调节剂选自：氯化钠、醋酸钠。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述DEAE FF阴离子层析柱的上样流速为60-240cm/h。
8.如权利要求1-7任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，洗脱用缓冲液选自：醋酸盐缓冲液、tris缓冲液或磷酸盐缓冲液，洗脱用缓冲液的pH值为5.5-11.0。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述稳定剂为糖醇类稳定剂或白蛋白。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经步骤（6）获得的Apoa-I溶液经无菌灌装制成液体制剂，或进一步制成冻干制剂。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant |