CN104854239A - 蛋白质纯化 - Google Patents
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Abstract
本文提供纯化NY-ESO-1相关多肽的方法，以及由这些方法产生的多肽；还提供包含纯的且稳定的NY-ESO-1的组合物。
Description
发明领域
本发明一般性地涉及纯的且稳定的NY-ESO-1相关多肽以及生产它的方法。
发明背景
被称为癌症-睾丸抗原(CT抗原)的、仅在肿瘤细胞和免疫赦免组织中一般性表达的一类蛋白的基因调控，在癌症患者中受到破碎。这导致这些抗原在多种肿瘤中异常表达。癌症患者中一些CT抗原的免疫原性使它们成为癌症疫苗开发的理想靶标。目前感兴趣的用于癌症免疫治疗的癌症睾丸抗原是NY-ESO-1。还鉴别了另一个癌症睾丸抗原，LAGE-1。已描述了两个LAGE-1转录物，LAGE-1a和LAGE1b。LAGE-1b被不完全剪接，并且编码推定的大约210个氨基酸残基的蛋白质(Sun et al. (2006) Cancer Immunol Immunother, 6: 55: 644-652)。
LAGE-1和NY-ESO-1蛋白的N末端区域是高度保守的，并被认为具有超过97%的同一性。但是，LAGE-1与NY-ESO-1的区别在于其中间区域只有62%相同。NY-ESO-1和LAGE-1a的C末端是高度保守的(超过97%的同一性)。但是，LAGE-1b的C末端较长并且不保守，并被认为与LAGE-1a/NY-ESO-1的相同区域的同一性小于50%。关于这些蛋白质的一般信息可以在LICR网站(参见www.cancerimmunity.org/CTdatabase)上找到。
重组CT抗原的纯化是制造基于CT抗原的癌症免疫治疗剂的一个步骤。已研究了各种方法以从重组产生的蛋白质中除去污染物如宿主细胞蛋白，并且有市售的试剂盒帮助开发从宿主细胞如大肠杆菌表达系统生产可溶性和活性重组蛋白的方法。参见，例如，“Tools for Enhancing Solubility of Proteins Expressed in E. coli and refolding screens for Difficult Targets, copyright 2008 EMD Chemicals Inc., an affiliate of Merck KGaA, Damstadt, Germany。尽管如此，在某些情况下，在获得足够纯度水平的CT抗原上遇到困难。
例如，已证明难以用标准的基于大肠杆菌的重组表达系统产生重组NY-ESO-1。参见Murphy (2005) Prep. Biochem. Biotechnol. 35:119-134。这种纯化方案涉及多个色谱步骤，伴随着NY-ESO-1蛋白的大量丧失。此外，所获得的低纯度水平引起了对根据已公开的纯化方法纯化的重组NY-ESO-1的免疫治疗用途的关注，因为可能有污染的大肠杆菌蛋白引起迟发型超敏反应。在解决这些问题上的努力导致使用被突变以兼容替代的表达系统如酵母的重组NY-ESO-1变体。参见Piatesi (2006) Protein Expression and Purification 48:232-242。
发明简述
本文提供NY-ESO-1相关多肽的纯化方法，以及用这些方法产生的多肽。还提供包含纯的且稳定的NY-ESO-1的组合物。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；和(b) 通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化所述混合物，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，合适的缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP。在一些实施方案中，组合物是细胞团块。在一些实施方案中，亲和标签是金属离子结合亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签是his标签。
在一些实施方案中提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(b) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤 (i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，IMAC基质是Ni2+。在一些实施方案中，IMAC基质包含在柱中。在一些实施方案中，第一缓冲液包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、和1 mM TCEP。在一些实施方案中，第二缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和500 mM咪唑。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(b) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽；(e) 将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，通过在葡聚糖 G-25柱上使用色谱进行缓冲液交换步骤。在一些实施方案中，使用包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(b) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽；(c) 将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换获得包含具有亲和标签的多肽的洗脱液；以及(d) 浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，通过切向流动过滤(TFF)进行浓缩和渗滤步骤。在一些实施方案中，在缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行浓缩和渗滤。在一些实施方案中，在包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液中进行浓缩和渗滤。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(b) 使该混合物澄清；(c) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽；(d) 将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换获得包含具有亲和标签的多肽的洗脱液；以及(e) 浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，澄清步骤进一步包括离心混合物。在一些实施方案中，澄清步骤进一步包括混合物的过滤。在一些实施方案中，澄清步骤进一步包括离心混合物和混合物的过滤二者。在一些实施方案中，离心步骤以15,900 x g进行。在一些实施方案中，过滤步骤使用0.45/0.22um PES滤器进行。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 破碎包含具有亲和标签的多肽的细胞，以获得组合物； (b) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(c) 使该混合物澄清；(d) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽；(e) 将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换获得包含具有亲和标签的多肽的洗脱液；以及(f) 浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 破碎包含具有亲和标签的多肽的细胞，以获得组合物； (b) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(c) 使该混合物澄清；(d) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽；(e) 将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换获得包含具有亲和标签的多肽的洗脱液；以及(f) 浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽；和(g) 使具有亲和标签的多肽过滤，以获得具有亲和标签的纯的多肽。
在一些实施方案中，过滤是无菌过滤。在一些实施方案中，在0.45/0.2 Sartobran? 300乙酸纤维素囊包上进行过滤。
在一些实施方案中，提供纯化具有his标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 通过以下子步骤破碎包含具有his标签的多肽的细胞，所述子步骤包括 (i) 使细胞悬浮于包含50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、和10 mM EDTA的缓冲液中；(ii)应用细胞破碎技术，例如高压均质机、弗氏压碎器、或渗透压冲击；(iii)以15,900 x g离心细胞，以获得沉淀；(iv)在包含50 mM Tris pH 8和150 mM NaCl的缓冲液中洗涤沉淀；(b) 在包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP的缓冲液中溶解沉淀，以获得混合物；(c) 通过以下子步骤使该混合物澄清：(i)以15,900 x g离心混合物，以获得上清；(ii) 通过0.45/0.22um PES滤器过滤上清；(d) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在Ni2+ -IMAC 琼脂糖凝胶柱上；(ii) 用包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、和1 mM TCEP的缓冲液洗涤柱；(iii) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑的缓冲液洗涤柱；(iv) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP和500 mM咪唑的缓冲液洗脱具有his标签的多肽以获得包含具有his标签的洗脱液；(e) 将具有his标签的多肽在葡聚糖 G-25柱上使用包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换，以获得包含具有his标签的多肽的洗脱液；(f) 通过在包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行TFF，浓缩并渗滤具有his标签的多肽；和(g) 使具有his标签的多肽在0.45/0.2 Sartobran? 300醋酸纤维素囊包上无菌过滤。
在一些实施方案中，提供纯化具有his标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 通过以下子步骤破碎包含具有his标签的多肽的细胞，所述子步骤包括 (i) 使细胞悬浮于包含50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、和10 mM EDTA的缓冲液中；(ii) 应用细胞破碎技术，例如高压均质机、弗氏压碎器、或渗透压冲击；(iii)以15,900 x g离心细胞，以获得沉淀；(iv) 在包含50 mM Tris pH 8和150 mM NaCl的缓冲液中洗涤沉淀；(v) 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、5%Triton X-100，pH 8.0洗涤沉淀一次；(vi) 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、150mM NaCl，pH8.0洗涤沉淀两次；(b) 在包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP的缓冲液中溶解沉淀，以获得混合物；(c) 通过以下子步骤使该混合物澄清：(i)以15,900 x g离心混合物，以获得上清；(ii) 通过0.45/0.22um PES滤器过滤上清；(d) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤(i) 将混合物加样在Ni2+ -IMAC 琼脂糖凝胶柱上；(ii) 用包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、和1 mM TCEP的缓冲液洗涤柱；(iii) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑的缓冲液洗涤柱；(iv) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP和500 mM咪唑的缓冲液洗脱具有his标签的多肽，以获得包含具有his标签的多肽的洗脱液；(e) 将具有his标签的多肽在葡聚糖 G-25柱上使用包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换，以获得包含具有his标签的多肽的洗脱液；(f) 通过在包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行TFF，浓缩并渗滤具有his标签的多肽；和(g) 使具有his标签的多肽在0.45/0.2 Sartobran? 300醋酸纤维素囊包上无菌过滤。
在一些实施方案中提供包含多肽的组合物，其中所述多肽包含按w/w计至少95%的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的单体 + 二聚体 + 三聚体种类。在一些实施方案中，提供包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述组合物进一步包含不超过5%的宿主细胞蛋白含量。在一些实施方案中，提供包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述组合物进一步包含低复杂度溶液。
在一些实施方案中，多肽包含选自下列的下述特征中的一个或多个：(a) 可溶性多肽聚集体，水动力学尺寸为大约22 nm；(b) 浓度为至少大约2 mg/mL；(c)重均分子量为大约640 kDa；(d) 正Zeta-电势为大约23 mV；(e) 由MS测定的100%游离半胱氨酸；和(f) 包含10mM Na-Ac pH 5.0的低复杂度溶液。在一些实施方案中，NY-ESO-1多肽(SEQ ID NO:1)形成大约77%的单体；14%的二聚体；和2.5%的三聚体，如SDS-PAGE所测量的。
在一些实施方案中，提供包含N-月桂酰肌氨酸、TCEP、和一种或多种包含全长NY-ESO-1蛋白的癌症睾丸抗原的组合物。在一些实施方案中，全长NY-ESO-1蛋白包含选自包含SEQ ID NOS:1-2的组的氨基酸序列。在一些实施方案中，全长NY-ESO-1蛋白进一步包含融合配偶体或载体蛋白。
附图简述
图1/4. 显示描述NY-ESO-1构建体发酵过程的流程图。
图 2/4. 显示His/NY-ESO-1纯化的流程图。
图3/4. 考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，其比较了用已公开方法单独进行三次运行产生的多肽。图例 (逐个泳道，从左至右)：1. 分子量标准；2. P-036 DNYEAHA005 (8μg)；3. P-037 DNYEAHA006 (8μg)；和4. P-038 DNYEAHA007 (8μg)。
图4/4. 使用α- 大肠杆菌BLR DE3蛋白的多克隆抗体通过Western 印迹分析来分析三次单独运行中产生的NY-ESO-1多肽。图例 (逐个泳道，从左至右)：(1) 大肠杆菌BL21 DE3提取物，20μg；(2) 大肠杆菌BL21 DE3提取物，5μg；(3) 大肠杆菌BL21 DE3提取物，2μg；(4) 大肠杆菌BL21 DE3提取物，1μg；(5) P-036-DNYEAHA005，20μg；(6) P-036-DNYEAHA005，20μg + 1μg HCP掺料(5%污染)；(7) P-037-DNYEAHA006，20μg；(8) P-037-DNYEAHA006，20μg + 1μg HCP掺料(5%污染)；(9) P-038-DNYEAHA007，20μg；(10) P-038-DNYEAHA007，20μg + 1μg HCP掺料(5%污染)。
详述
定义
“NY-ESO-1相关多肽”在本文中其它部分定义。
“纯的”或“纯度水平”当用于NY-ESO-1相关多肽上下文时，指这样的NY-ESO-1相关多肽组合物，其中总多肽中有至少给定百分比是NY-ESO-1相关多肽，如所选择的测定方法所确定的。在一些实施方案中，用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶、考马斯亮蓝G-250在还原条件下确定NY-ESO-1相关多肽的纯度水平(得自Invitrogen Corporation, 5791 Van Allen Way, PO Box 6482, Carlsbad, California 92008)。使用市售的BSA产生标准曲线，并使用市售的扫描显像密度测定，例如ImageQuant软件进行显像密度测定分析(得自GE Healthcare)。在一些实施方案中，根据本文公开的方法产生的NY-ESO-1相关多肽组合物包含至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%的NY-ESO-1相关多肽单体 + 二聚体 + 三聚体种类，w/w。在一些实施方案中，NY-ESO-1多肽组合物包含至少60%、65%、70%、75%、80%或更多的单体NY-ESO-1种类，w/w。
“宿主细胞蛋白含量”当用于NY-ESO-1相关多肽上下文时，指使用选择的测定方法在NY-ESO-1相关多肽组合物中检测到的宿主细胞蛋白的百分比。在一些实施方案中，使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶，在还原条件下，并使用针对宿主细胞的特定菌株的抗大肠杆菌抗体，通过Western 印迹确定宿主细胞蛋白含量。抗体可以是单克隆或多克隆，并且可以用常规方法产生或者可以从市场上购买。在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽组合物包含不超过5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%的宿主蛋白含量，如所选择的测定方法所确定的。在一些实施方案中，根据本文公开的方法产生的NY-ESO-1相关多肽组合物包含少于5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%的宿主细胞蛋白含量。
本文使用的“低复杂度溶液”指包含一种或多种低浓度赋形剂的溶液。通常，低复杂度溶液将包含不超过100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM、5mM、4mM、3mM、2mM、或1mM的任何给定赋形剂，虽然低复杂度溶液可以包含多于一种的赋形剂。
制造
产生NY-ESO-1相关多肽的一般方法包括下述过程：
1.制备表达具有亲和标签的NY-ESO-1多肽的重组宿主细胞株；
2. 制备源自该细胞株的种子系统(亲本、主要和工作种子库)；
3. 重组宿主细胞在20-L的发酵罐中发酵；
4. 破碎宿主细胞并提取含有NY-ESO-1相关多肽的粗组合物；
5. 从粗组合物提取并纯化NY-ESO-1相关多肽。
破碎、提取和纯化
细胞破碎在诱导之后，可以通过常规方法分离并破碎含有NY-ESO-1相关多肽的宿主细胞，例如高压均质机、弗氏压碎器、或渗透压冲击等。可以通过各种方式分离含有NY-ESO-1相关多肽的破碎的细胞碎片，包括离心、TFF、振动膜(如Permanne等的美国专利号6,939,697所公开的)。
在一些实施方案中，通过下述步骤破碎宿主细胞，包括：
1.使宿主细胞悬于包含50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、和10 mM EDTA的缓冲液中；
2.通过例如高压均质机破碎宿主细胞；
3.以15,900 x g离心宿主细胞，以获得沉淀；
4.在包含50 mM Tris pH 8和150 mM NaCl的缓冲液中洗涤沉淀。
洗涤. 在一些实施方案中，通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、5%Triton X-100，pH 8.0洗涤沉淀一次。通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、150mM NaCl，pH8.0洗涤沉淀两次
溶解. 破碎(以及任选地洗涤步骤)之后，溶解含有NY-ESO-1相关多肽的分离的细胞碎片。在一些实施方案中，在包含N-月桂酰肌氨酸和三（2-羧乙基）膦盐酸盐(TCEP)的缓冲液中溶解分离的细胞碎片。在一些实施方案中，在包含5% N-月桂酰肌氨酸和和5 mM TCEP 的缓冲液中溶解分离的细胞碎片。在一些实施方案中，在包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP的缓冲液中溶解分离的细胞碎片。
澄清. 在溶解含有NY-ESO-1相关多肽的细胞碎片之后，可以通过多种技术进行澄清步骤，包括离心、过滤等。在一些实施方案中，使用市售的0.45/0.22 μm聚醚砜(PES)双截止过滤器进行澄清。在一些实施方案中，通过离心进行澄清。在一些实施方案中，以15,900 X g通过离心进行澄清。
固定化金属离子亲和色谱(IMAC). 通过亲和色谱策略简化重组蛋白的纯化，其中被框内克隆到靶构建体上的肽或蛋白质亲和标签选择性地与已经固定在固相支持物上的配体相互作用。固定化金属离子亲和色谱(IMAC)，这个方法的一种实施方式，依赖于通过表面结合螯合剂如亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)固定的二价过渡金属离子(例如Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、或Mg2+)。要纯化的蛋白与固定化过渡金属离子的游离配位点相互作用。参见，例如，Lichty et al. (2005) Protein Expression and Purification 41:98-105; Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279。通过与结合在固相支持物上的次氮基三乙酸(NTA)螯合而固定的包含Ni2+的IMAC介质已成为蛋白质纯化的一种通用方法，所述蛋白质携带有C-或N-末端金属离子螯合亲和标签。在一些实施方案中，介质是Ni2+ 琼脂糖凝胶介质。这种介质可以从GE Healthcare, a division of General Electric Company购买。
使用通常包含5-6个连续His残基的常用His-标签技术。因为这种寡聚组氨酸片段相当稀有地表达在天然存在的蛋白质中，5His-或6His-标签通常导致高的选择性。Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279。尽管如此，可以使用其它长度的His-标签，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续His残基。在一些实施方案中，标签中包括除了His之外的其它残基。参见，例如，Knecht (2008) J. Mol. Recognit. 22:270-279; Charlton (2008) Methods in Molecular Biology 421:25-36。在一些实施方案中，His-标签可以包含(Hisx-Ry)z，其中R是非His残基，且x、y、和z是正整数。在一些实施方案中，可以使用HAT-标签。参见Terpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-533。在一些实施方案中， His-标签可以与一种或多种不同的亲和标签结合使用。在一些实施方案中，His-标签可以位于蛋白质的N-末端或其附近。在其它实施方案中，His-标签可以位于蛋白质的C-末端或其附近。
色谱设置 可以将要纯化的蛋白引入到根据不同方法的固相支持物上，例如，批式色谱或柱色谱。通常，批式色谱方法包括使用加样缓冲液将初始的含蛋白组合物加入到容器中的固相支持物上；可以将其混合。然后从残余物中分离固相支持物，并且可以进行一次或多次洗涤步骤，其中将缓冲液加入到固相支持物中，然后从洗涤缓冲液分离固相支持物。可以使用单独的洗涤缓冲液进行一个或多个单独的洗涤步骤。在一个或多个洗涤步骤之后，如果有的话，向固相支持物加入洗脱缓冲液，并从固相支持物移除洗脱液。
在柱方法中，将固相支持物装填到柱中。然后将含有蛋白质的组合物置于加样缓冲液中并引入到柱上，并使其流过柱，以允许蛋白质与固相支持物结合。可以包括一个或多个洗涤步骤，其中一种或多种洗涤缓冲液流过柱。然后使洗脱缓冲液流过柱并收集洗脱液。
缓冲液. IMAC的传统应用是在第一缓冲液中包含0.5-1 M NaCl以防止蛋白质基于非特异性静电相互作用与固相支持物相互作用。在一些实施方案中，加样缓冲液包含5% N-月桂酰肌氨酸。在一些实施方案中，加样缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP。
洗涤缓冲液可以包含这样的组分，例如与组氨酸竞争金属离子的温和洗脱液、非胺盐、咪唑、非离子去垢剂、或离液剂，以破碎非特异性静电或疏水相互作用；并且pH可以依赖于所希望的效果而变化。参见，例如，Methods in Molecular Biology, vol. 421: Affinity Chromatography: Methods and Protocols, Second edition; Zachariou ed. (2007) Humana Press, Totowa, NJ。
在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液包含1% N-月桂酰肌氨酸和1 mM TCEP。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、和1 mM TCEP。
在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含脲、NaCl、和TCEP。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含8 M脲、0.5 M NaCl、和1 mM TCEP。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑。在一些实施方案中，加样缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、5 mM TCEP，且第二洗涤缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、5 mM TCEP和0.5M NaCl。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含脲、NaCl、和TCEP。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含8 M脲、0.5 M NaCl、和1 mM TCEP。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、500 mM咪唑。
缓冲液交换. 可以在多孔树脂上进行尺寸排阻色谱完成缓冲液交换(凝胶过滤或分子筛色谱)。当在柱上进行缓冲液交换时，通常用含有所希望样品的缓冲液对柱树脂进行预平衡。含有蛋白质的缓冲液流过柱。蛋白质不会进入树脂孔中并快速通过。缓冲液盐和其它小分子将会进入树脂孔，降低它们移动通过树脂床的速度。流速的降低使得较快的大分子与较慢的、较小的分子分离开。当分离的级分从柱中出来时，通过收集它们，可以回收感兴趣的大分子，并与较晚离开床的小分子分离开。因此，携带样品进入柱的缓冲液的成分可以用对柱进行预平衡的溶液代替。可接受的树脂可以包含纤维素、聚丙烯酰胺、右旋糖酐等，只要蛋白不会保留在树脂内。包含合适树脂的柱是可以从市场上买到的，并且包括G-10、G-15、和G25 葡聚糖。在一些实施方案中，使用G-25 葡聚糖树脂进行缓冲液交换。在一些实施方案中，其中的蛋白质被收集的缓冲液包含10 mM醋酸钠pH 5。其它可以溶解NY-ESO-1的缓冲液包括下述缓冲液：
■ 10mM 醋酸钠 pH 5.0、1 mM EDTA、1 mM TCEP、5 mM NaCl
■ 10 mM Na-PO4 pH 6.0或6.5、1 mM EDTA、1 mM TCEP、500 mM NaCl
■ 10 mM Na-PO4 pH 6.5、1 mM EDTA、250 mM精氨酸 1 mM TCEP、250 mM NaCl
■ 10 mM Na-PO4 pH 6.5或7.0、1 mM EDTA、300 mM精氨酸、1 mM TCEP、5%蔗糖
■ 10 mM KPO4 pH 7.0、350-500 mM精氨酸
■ 10 mM Na-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸
■ 10 mM Na-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸、1 mM TCEP
■ 10 mM K-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸、5 mM 还原性谷胱甘肽
■ 10 mM K-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸、10 mM 谷氨酸盐
■ 10 mM K-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸、10 mM 抗坏血酸
■ 10 mM K-PO4 pH 7.0、1 mM EDTA、300 mM 精氨酸
■ 10 mM Tris pH 7.0、1 mM EDTA、1 mM TCEP、5 mM NaCl、250 mM 精氨酸、0.15% Tween-80。
在一些实施方案中，使用其他缓冲液交换方法，包括TFF。
浓缩；渗滤. 可以包括渗滤蛋白质的步骤。用于渗滤的可接受的方法和仪器包括离心过滤装置，例如Millipore Amicon Ultra，搅动超滤池(可从Millipore, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821获得)和使用盒式膜(可从Millipore获得)或中空纤维型膜(可从25 Harbor Park Drive, Port Washington, NY 11050获得)的TFF。在这个步骤中，可以浓缩NY-ESO-1相关蛋白。TFF适合于此目的。
在TFF中，沿着膜表面切向泵送含有感兴趣蛋白的流体。施加压力推动部分流体通过膜到达过滤侧。过大无法通过膜孔的颗粒和大分子截留在上游侧。膜孔尺寸将决定哪些颗粒通过。可以使用各种孔径，只要感兴趣的蛋白被保留。涉及TFF的指导可以从TFF装置制造商获得。参见“Protein Concentration and Diafiltration by Tangential Flow Filtration,” 2003，从Millipore Corporation, Billerica MA, USA获得。各种缓冲液都是可接受的。在一些实施方案中，使用10 kDa再生纤维素C-screen膜截留NY-ESO-1蛋白。在一些实施方案中，在包含10 mM醋酸钠pH 5的缓冲液中进行渗滤。其它合适的缓冲液在之前的章节中有描述。
过滤. 渗滤之后，包含NY-ESO-1相关多肽的溶液可以进行过滤，以获得无菌组合物。在一些实施方案中，可以使用0.45/0.2 SartobranTM P滤器过滤溶液。
在一些实施方案中，将纯化的大量蛋白浓度调节至在10 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中~1.7 mg/mL，并在大约-70℃或更低的温度储存。
NY-ESO-1相关多肽
本文描述的NY-ESO-1相关多肽可以包含全长、部分截短的或截短的NY-ESO-1蛋白，或包括能引发对NY-ESO-1的免疫应答的一个或多个表位的它的任何片段。
本说明书中的NY-ESO-1蛋白是指至少有95%、96%、97%、98%、99%或100%与天然存在的蛋白(SEQ ID NO:1)相同的蛋白质。在一些实施方案中，该同一性是针对NY-ESO-1蛋白序列全长的。确定序列同一性的工具是广泛可得的，包括Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，其可以在美国国家生物技术信息中心)National Center for Biotechnology Information)的主页blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=blastn&BLAST_INIT=blast2seq上获得。
在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽可以通过氨基酸的添加、缺失、或取代而与天然存在的蛋白有所不同，如本文其它部分所述。在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽包括保守取代。保守取代是众所周知的，在序列比对的计算机程序中通常设为默认得分矩阵。这些程序包括PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352)，National Biomedical Research Foundation, Washington、和Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), and "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919。
在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽是融合蛋白或化学连接多肽。在一些实施方案中，这种融合蛋白或化学连接多肽包含两个或多个片段、截短的、部分截短的、或全长NY-ESO-1蛋白。在一些实施方案中，这种融合蛋白或化学连接多肽包含异源多肽序列。在一些实施方案中，异源多肽序列是来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)的蛋白D的全长或片段。在一些实施方案中，异源多肽序列可以是亲和纯化标签，例如His-标签，或其等同物，如本文其他部分所述。
示例性的NY-ESO-1相关多肽包括NY-ESO-1 (SEQ ID NO:1)和NY-ESO-1 His-标签构建体(SEQ ID NO:2)，如本文其他部分所述。示例性的NY-ESO-1相关多肽的实施方案可以在本文另外的序列表中找到，以及在WO2008/089074中找到。
在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽可以具有大约8.79(无His标签)至大约9.10(有His标签)的pI。在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽可以以可溶性蛋白聚集体的形式存在，其水动力学尺寸为20-25nm。在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽可以以500-800 kDa的重均分子量存在。在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽可以以大约18-25 mV的正Zeta-电势存在。
在一些实施方案中，NY-ESO-1相关多肽具有下述特性：
-192个氨基酸的重组蛋白，pI为9.1 (包括His标签)
-理论MW为19390.8 Da
-5个Cys残基。
在一些实施方案中，由本文公开的方法产生的NY-ESO-1相关多肽溶液具有下述特性：
-可溶性蛋白聚集体，水动力学尺寸 ≈ 22 nm
-浓度 ≈ 2 mg/mL
-重均分子量为640 kDa
-正Zeta-电势为 ≈23 mV
-由MS确定的100%游离半胱氨酸
-低复杂度溶液(10mM Na-Ac pH 5.0)
由SDS-PAGE概况确定的多聚体形式 ≈ 77%的单体；14%的二聚体；2.5%的三聚体。
在一个实施方案中，NY-ESO-1相关多肽被称为“His/NY-ESO-1”，如实施例中所述。
实施例
实施例1. 发酵
用于产生His/NY-ESO-1的发酵过程总结于图2。下面对该过程进行详细描述。培养基的组成在m3.2.S.2.3中给出。
m.3.2.S.2.2 制造过程和过程控制的描述
参见图1/4 His/NY-ESO-1发酵概述
目前的20-L规模的发酵过程是两步发酵过程，其包括摇瓶中的液体预培养阶段，然后是在20-L发酵罐中的分批补料发酵，包括：
1 预培养阶段，其中含有重组质粒pLICR100kan的来自制造商的工作种子库B2270 (RIX4486，批次ANYEAWA001，2008年1月24日)的大肠杆菌细胞在37℃在存在卡那霉素和葡萄糖的条件下生长，直至650 nm记录的光密度值(OD650nm)在2.0和4.0之间。
2 实际的分批补料发酵(在20-L发酵罐中)进行38 ± 1 h，其中用来自步骤1的15 mL预培养物(2.0 < OD650nm < 4.0)对发酵培养基进行无菌接种，从而起始培养；在28℃发酵14 h之后，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pLICR100kan-编码产物，His/NY-ESO-1的表达，直至发酵结束(~24 ± 1 h，在37℃)。
配置发酵监控平台以记录用于培养产生His/NY-ESO-1的大肠杆菌培养物的所有条件。记录的参数是：pH (通过加入碱调节为6.8)、空气/O2使用、气流和超压、温度和加料速度。在存在卡那霉素(50 μg/mL)的条件下进行所有培养。
m.3.2.S.2.2制造过程和过程控制的描述
细胞的最终体积是大约11 L，取决于整个过程中收集的样品体积。在发酵结束时，以15,900 x g离心30 min收获细胞。在这个阶段，将细胞体储存于-80℃直至进一步处理。
在大肠杆菌培养物达到OD650nm ≥ 20之后(通常是在28℃发酵14 h之后)立即在37℃开始加料和诱导阶段。
发酵过程中采样的生产中的样品和收获的样品通过SDS-PAGE分析进行检查，然后进行考马斯亮蓝燃料染色。
所有培养基和缓冲液过滤灭菌，并且不含动物来源的物质。
对于根据该方法产生的发酵批次，以获得的释放测试数据在m3.2.S.4.4中给出。
实施例2. 细胞破碎和含HIS/NY-ESO-1的包涵体的提取
在诱导阶段期间，His/NY-ESO-1蛋白被分离到包涵体(IB)中。为了释放IB，将发酵结束时获得的大肠杆菌BL21 B2270细胞浆进一步重悬于冷却的裂解缓冲液(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl和10 mM EDTA)中。将重悬的细胞三次通过高压均质机进行破碎。在细胞裂解之后，在4℃以15,900 x g离心30 min收获包涵体。然后用含有50 mM Tris pH 8.0和150 mM NaCl冷却的洗涤液洗涤得到的IB沉淀。洗涤步骤还可以包括下述步骤：
· 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，用20mM Tris、5%Triton X-100，pH 8.0洗涤一次。
· 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，用20mM Tris、150mM NaCl，pH8.0洗涤两次。
图3中给出概括该过程的流程图。
实施例 3. HIS/NY-ESO-1的提取和纯化
纯化过程总结在图3中。其包括几个纯化步骤：
■ 从细胞破碎之后得到的洗涤过的IB沉淀提取His/NY-ESO-1蛋白(第2节)
■ 固定化金属离子(Ni2+)亲和色谱(Ni2+-IMAC)程序；
■ 在葡聚糖 G-25柱上通过凝胶过滤进行调整和缓冲液交换
■ 通过切向流渗滤(TFF)进行浓缩和渗滤
■ 无菌过滤。
有关这些纯化阶段的每一个的进一步的细节在下面章节中提供。m.3.2.S.2.2 制造过程和过程控制的描述
参见图3/4。
m.3.2.S.2.2 制造过程和过程控制的描述
3.1. 提取和纯化过程描述
3.1.1. 从洗涤过的IB沉淀提取His/NY-ESO-1蛋白
简短地说，将洗涤过的IB沉淀重悬于20 mM Tris (pH 8.0)、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、5 mM 三（2-羧乙基）膦盐酸盐(TCEP)中。在室温温和搅拌过夜达到溶解。然后在4℃以15,900 x g离心30 min使提取物澄清。在含有固定化Ni2+的柱上进行亲和色谱之前在0.45/0.22-μm的囊式过滤器上进一步过滤上清液。这一步中使用的缓冲液组合物在m3.2.S.2.3中提供。
3.1.2. 固定化Ni2+亲和色谱(IMAC)
获得的上清中存在的抗原，His/NY-ESO-1，通过直接注入到镍离子金属亲和树脂(IMAC 琼脂糖凝胶 6FF)上进行捕获和纯化。将树脂装填到用Tris 20 mM, pH 8.0预平衡的柱中，然后在20 mM Tris pH 8.0、2% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和1 mM TCEP中平衡。将溶解的IBs加样后，在下述条件下洗涤柱两次：
■ 第一次洗涤是用含有20 mM Tris (pH 8.0)、1% N-月桂酰肌氨酸和1 mM TCEP的溶液进行的；
■ 第二次洗涤是用含有20 mM Tris (pH 7.0)、8 M脲、0.5 M NaCl、1mM TCEP、和20 mM咪唑的溶液进行的。
使用含有20 mM Tris (pH 7.0)、8 M脲、0.5 M NaCl、1mM TCEP、和500 mM咪唑的缓冲液将His/NY-ESO-1从柱上洗脱下来。该步骤中使用的缓冲液组合物在m3.2.S.2.3中提供。
3.1.3. 缓冲液交换
将含His/NY-ESO-1的洗脱液流过用10 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)平衡的葡聚糖 G-25 (介质)脱盐柱进行缓冲液交换。该步骤中使用的缓冲液组合物在m3.2.S.2.3中提供。
3.1.4. 浓缩和渗滤
然后利用10 kDa膜相对10 mM醋酸钠缓冲液pH 5.0对含有His/NY-ESO-1融合蛋白的葡聚糖 G-25流出液进行浓缩和渗滤。最终渗滤材料的浓度调节为在10 mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)中大约1.7 mg/mL。该步骤中使用的缓冲液组合物在m3.2.S.2.3中提供。
m.3.2.S.2.2 制造过程和过程控制描述
3.1.5. 无菌过滤
每一个别批次纯化主体（bulk）通过0.45/0.22-μm 醋酸纤维素膜过滤灭菌。这个阶段产生的纯化的主体蛋白称为“中间纯化主体”，在250 mL聚对苯二甲酸乙二酯(PETG)中储存于-70℃。
3.2. 过程中控制
对表1中指示的样品进行纯化过程的过程中测试，包括：
■ 用二喹啉甲酸(BCA)方法测量总蛋白含量；
■ 在λ = 280 nm进行UV测量；
■ 用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色分析获得电泳概况；
■ 通过Western 印迹分析鉴别His/NY-ESO-1。
■ 生物负载。
■ 表1 纯化过程的过程中控制
1 His/NY-ESO-1存在于下述级分中：溶解的IB、Ni2+-IMAC洗脱液、葡聚糖 G-25洗脱液、超滤截留液、和纯化的主体。
2 所有的取样在无菌管中-80℃保存。
NY-ESO-1蛋白的特性
-192个氨基酸的重组蛋白，pI为9.1 (包括His标签)
-理论MW为19390.8 Da
-5个Cys残基。
我们的方法产生的NY-ESO-1蛋白溶液的特性
-可溶性蛋白聚集体，水动力学尺寸 ≈ 22 nm
-浓度 ≈ 2 mg/mL
-重均分子量为640 kDa
-正Zeta-电势为 ≈23 mV
-由MS确定的100%游离半胱氨酸
-低复杂度溶液(10mM Na-Ac pH 5.0)。
多聚体形式
-SDS-PAGE图谱 ≈ 77%的单体；14%的二聚体；2.5%的三聚体
用NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶；考马斯亮蓝G-250；还原条件；和ImageQuant软件分析进行SDA-PAGE密度测定分析。参见图3/4和下表。
宿主细胞蛋白分析。
使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris / 还原条件通过Western 印迹研究宿主细胞污染物。使用通过标准技术制备的针对大肠杆菌BLR DE3细胞提取物的多克隆抗体检测宿主细胞蛋白。通过密度测量分析确定使用本文公开的方法单独进行三次运行产生的NY-ESO-1多肽中的宿主细胞蛋白含量不超过5% w/w(泳道5、7、9)。参见图4/4。
Claims (36)
1.纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤：
(a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和三（2-羧乙基）膦盐酸盐的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，获得混合物；和
(b) 通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化所述混合物，获得具有亲和标签的纯的多肽。
2.前述权利要求任一项的方法，其中所述缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、5 mM TCEP。
3.前述权利要求任一项的方法，其中所述组合物是细胞团块。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述亲和标签是金属离子结合亲和标签。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述亲和标签是his标签。
6.前述权利要求任一项的方法，其中通过IMAC纯化混合物的步骤进一步包括以下子步骤：
(i) 将混合物加样在IMAC基质上；
(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；
(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；
(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽，获得具有亲和标签的纯的多肽。
7.前述权利要求任一项的方法，其中使用Ni2+基质进行IMAC。
8.前述权利要求任一项的方法，其中使用包含在柱中的基质进行IMAC。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述第一缓冲液包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、1 mM TCEP。
10.权利要求6-9任一项的方法，其中所述第二缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑。
11.权利要求6-10任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、500 mM咪唑。
12.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在通过IMAC纯化混合物的步骤之后，将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换的步骤。
13.权利要求12的方法，其中使用在葡聚糖 G-25柱上的色谱进行缓冲液交换。
14.权利要求12或13的方法，其中使用包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换。
15.权利要求12-14任一项的方法，进一步包括在缓冲液交换步骤之后，浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽的步骤。
16.权利要求15的方法，其中通过TFF进行浓缩和渗滤步骤。
17.权利要求15或16的方法，其中在缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行浓缩和渗滤。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中在包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液中进行浓缩和渗滤。
19.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在溶解所述组合物的步骤之后，使所述混合物澄清的步骤。
20.权利要求19的方法，其中澄清步骤进一步包括离心所述混合物。
21.权利要求19或20的方法，其中澄清步骤进一步包括混合物的过滤。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中澄清步骤进一步包括离心混合物和混合物的过滤二者。
23.权利要求20或22的方法，其中离心步骤以15,900 x g进行。
24.权利要求21或22的方法，其中过滤步骤使用0.45/0.22um PES滤器进行。
25.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在通过IMAC纯化所述混合物之前，破碎包含具有亲和标签的多肽的细胞的步骤。
26.前述权利要求任一项的方法，进一步包括使具有亲和标签的纯的多肽过滤的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述过滤是无菌过滤。
28.权利要求26或27的方法，其中在0.45/0.2 Sartobran? 300乙酸纤维素囊包上进行过滤。
29.纯化具有his标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤：
(a) 通过以下子步骤破碎包含具有his标签的多肽的宿主细胞，所述子步骤包括
(i) 使细胞悬于包含50 mM Tris pH 8、150 mM NaCl、和10 mM EDTA的缓冲液中；
(ii) 应用细胞破碎技术；
(iii) 以15,900 x g离心宿主细胞，获得沉淀；
(iv) 在包含50 mM Tris pH 8和150 mM NaCl的缓冲液中洗涤所述沉淀；
(v) 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、5%Triton X-100，pH 8.0洗涤沉淀一次；
(vi) 通过离心回收含有包涵体的不溶性级分，并用50mM Tris、150mM NaCl，pH8.0洗涤沉淀两次；
(b) 在包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP的缓冲液中溶解所述沉淀，获得混合物；
(c) 通过以下子步骤使该混合物澄清：
(i) 以15,900 x g离心混合物，获得上清；
(ii) 通过0.45/0.22um PES滤器过滤上清；
(d) 通过IMAC纯化该混合物，其包含以下子步骤：
(i) 将所述混合物加样在Ni2+ -IMAC 琼脂糖凝胶柱上；
(ii) 用包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、1 mM TCEP的缓冲液洗涤所述柱；
(iii) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、20 mM咪唑的缓冲液洗涤所述柱；
(iv) 用包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、500 mM咪唑的缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽，获得包含具有亲和标签的多肽的洗脱液；
(e) 使洗脱液在葡聚糖 G-25柱上使用包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换色谱，获得包含具有his标签的多肽的洗脱液；
(f) 通过在包含10 mM乙酸钠pH 5的缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行TFF，浓缩并渗滤具有his标签的多肽；和
(g) 使具有his标签的多肽在0.45/0.2 Sartobran? 300醋酸纤维素囊包上无菌过滤。
30.包含多肽的组合物，其中所述多肽包含按w/w计至少95%的包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽的单体 + 二聚体 + 三聚体种类。
31.包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述组合物进一步包含不超过5%的宿主细胞蛋白含量。
32.包含多肽的组合物，所述多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述组合物进一步包含低复杂度溶液。
33.权利要求31或32的组合物，其中所述多肽包含选自下组的下述特征中的一个或多个：
(a) 可溶性多肽聚集体，水动力学尺寸为大约22 nm；
(b) 浓度为至少大约2 mg/mL；
(c) 重均分子量为大约640 kDa；
(d) 正Zeta-电势为大约23 mV；
(e) 由MS测定的100%游离半胱氨酸；和
(f) 包含10mM Na-Ac pH 5.0的低复杂度溶液。
34.权利要求31-33任一项的组合物，其中所述多肽形成按w/w计大约77%的单体；14%的二聚体；和2.5%的三聚体，如SDS-PAGE所测量。
35.包含N-月桂酰肌氨酸、TCEP和一种或多种包含全长NY-ESO-1的癌症睾丸抗原的组合物。
36.权利要求35的组合物，其中全长NY-ESO-1进一步包含融合配偶体或载体蛋白。
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