CN105543234A - 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法 - Google Patents

一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。该方法是通过基因合成方法制备SSD609多肽毒素的DNA序列，用PCR方法在其前面插入Factor-Xa酶切位点，并克隆至带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上。将质粒转化进入大肠杆菌，异丙基硫代半乳糖苷诱导高效表达。细菌破碎后使用镍柱进行纯化，并用Factor-Xa酶切断His6-SUMO融合标签和SSD609，反挂镍柱除去His6-SUMO。SSD609用HPLC进一步纯化后，加入一定比例的GSH和GSSG，使SSD609中二硫键重新连接成热力学稳定的状态，构象变得均一。再次用HPLC纯化SSD609，冻干后备用。本发明所提供的制备SSD609方法操作简便，产量多，纯度高，成本较低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。

Description

一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。
背景技术
最近在一种蜈蚣亚型Scolopendrasubspinipesdehaani的毒液组学和转录组学的研究中发现了许多多肽毒素，其中一些对离子通道有调节作用。他们用3V的电压刺激这种蜈蚣的毒腺，然后用微小的吸管收集毒液。将毒液稀释在Tris-HCl(20mMTris-HCl，100mMNaCl，pH7.6)溶液中之后，离心取上清，冻干(300mg冻干的蜈蚣粗毒需要大约400只蜈蚣，即平均从一只蜈蚣中提取的毒素不到1mg，量非常微小)。然后将300mg蜈蚣粗毒溶于3mLTris-HCl溶液中，用凝胶过滤层析的方法分离。收集分离出来的每一个峰，继续用阴离子交换层析和反相高效液相色谱C18柱分离，进一步纯化，从而分离出许多毒液中单一的组分。SSD609是其中之一，能够可逆地抑制KCNQ1/KCNE1钾离子通道电流，拥有潜在的药物治疗可能性(Peng,K.,Kong,Y.,Zhai,L.,etal.Twonovelantimicrobialpeptidesfromcentipedevenoms[J].Toxicon:officialjournaloftheInternationalSocietyonToxinology,55(2-3):274-279.)。但是这种方法得到的蜈蚣毒素SSD609的量非常微小，本发明提供的利用大肠杆菌异源表达纯化的方法，操作简便、成本低，能够大量制备出拥有生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，该方法操作简便，产量多，纯度高，成本低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。
实现本发明目的的制备流程图如图1所示，具体技术方案如下：
(1)获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQIDNo.1所示；
(2)将SSD609的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒；
(3)将pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌；
(4)将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到His6-SUMO-SSD609融合蛋白；
(5)His6-SUMO-SSD609融合蛋白用FactorXa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和SSD609多肽毒素的蛋白混合液。该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而SSD609多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化；
(6)纯化后的SSD609多肽毒素使用GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肽毒素；
(7)再次使用HPLC对SSD609多肽毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小，冻干备用。
作为优选，所述步骤(3)中蛋白表达的具体方法如下：
将pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒转化进入EscherichiacoliBL21(DE3)gold细胞中，37℃培养箱中生长24h；挑选单克隆，在4mLLB小管中扩增后加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37℃培养，转速为225rpm；当菌液OD600达到0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG进行诱导，融合蛋白开始表达，于25℃培养箱中培养；20h后离心机离心收菌，4000rpm离心20min，弃上清液；用35mL裂解液重悬底部的E.coli细胞，收集细菌悬液，备用。
作为优选，所述步骤(4)中蛋白纯化的具体方法如下：
将细菌悬液用超声破碎仪破碎，离心后取上清，得到含有杂蛋白的蛋白混合液。Ni2+-NTA胶先用ddH2O冲洗，再用Bindingbuffer平衡。平衡后的Ni2+-NTA胶与蛋白混合液混合，使His6-SUMO-SSD609蛋白与Ni2+-NTA胶结合；将结合了蛋白的Ni2+-NTA胶加入重力流穿柱，用含30mM咪唑的Bindingbuffer洗去非特异性结合的杂蛋白，再用含有300mM咪唑的Bindingbuffer洗脱His6-SUMO-SSD609融合蛋白。
作为优选，所述步骤(5)中蛋白酶切和纯化的具体方法如下：
His6-SUMO-SSD609融合蛋白使用10KMWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩，用Factor-Xa酶的酶切buffer将浓缩后的His6-SUMO-SSD609融合蛋白稀释至10mL；Factor-Xa酶按照1:3000(g/g)的比例加入His6-SUMO-SSD609融合蛋白溶液，20-25℃酶切16h，此时His6-SUMO-SSD609融合蛋白已被酶切开，分别为His6-SUMO标签和SSD609多肽毒素；酶切后的混合蛋白溶液与用Bindingbuffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合1h，His-SUMO融合标签结合在Ni2+-NTA胶上，流穿出来的即为多肽毒素SSD609蛋白。将该SSD609蛋白冻干，加入ddH2O溶解，用HPLC进一步纯化：含有多肽毒素SSD609的溶液在C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈和0.1％TFA溶液以5mL/min流速分离；谱峰于214nm和254nm波长检测，人工收集目的蛋白。
作为优选，所述步骤(6)中SSD609二硫键重建的具体方法如下：
将得到的SSD609多肽毒素冻干，加入到变复性溶液中。该变复性溶液为0.33MNH4Ac和0.5MGnHCl混合液，所述多肽毒素SSD609蛋白在变复性溶液中的浓度在100μM-200μM之间。按GSH(还原型谷胱甘肽)：GSSG(氧化型谷胱甘肽)：多肽毒素SSD609＝100：10：1的摩尔比，称取相应的GSH和GSSG加入溶有多肽毒素SSD609蛋白的变复性溶液中；调节pH至7.8，4℃静置24-48h；静置后的溶液再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明提供的多肽毒素SSD609制备方法，蛋白表达量高，纯化后毒素纯度高，与直接从动物毒腺中提取的方法相比，操作步骤简单，蛋白产量大，成本较低，且毒素拥有与天然状态相似的生理功能。因此本方法可用于制备大量的拥有天然状态生理功能SSD609毒素。
附图说明
图1拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的制备流程图。
图2pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒构建示意图。IEGR为Factor-Xa酶切位点翻译后的氨基酸。
图3蜈蚣多肽毒素SSD609纯化的Tricine-SDS-PAGE图。M：lowrangeproteinmarker(KDa)；1：30mM咪唑洗脱的杂蛋白；2：300mM咪唑洗脱的目的蛋白；5：FactorXa酶切之后；6：反挂镍柱后的SSD609；7：挂在镍柱上的His-SUMO融合标签。
图4SSD609二硫键重建前后HPLC纯化对比图。A为二硫键重建之前，B为二硫键重建之后。
图5SSD609ESI-MS图。704.0峰为八价离子峰，804.4为七价离子峰，938.3为六价离子峰，1125.7为五价离子峰，1406.9为四价离子峰。所有这些峰的计算值均为5623.8Da左右。
图6电生理方法验证SSD609对KCNQ1/KCNE1钾离子通道的抑制作用。
具体实施方式
以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
以下实施例中所使用的生物材料及化学制剂，若无特别声明，均为本领域常规产品，下面将列出部分常用试剂。
LB培养基：NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L
细胞裂解液：70mMTris，300mMNaCl，pH8.0
BindingBuffer：20mMTris，200mMNaCl，pH8.0
Factor-Xa酶的酶切buffer：20mMTris-HCl，100mMNaCl，5mMCaCl2，pH8.0
变复性溶液：0.33MNH4Ac，0.5MGnHCl
实施例1：pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒构建
获得蜈蚣毒素SSD609的蛋白序列信息以及DNA序列，进行基因合成，其中DNA序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；使用PCR方法在SSD609之前加入FactorXa酶切位点，通过BamHI和XhoI限制性内切酶酶切位点连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建得到pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒(如图2所示)。测序验证正确。具体氨基酸序列如下：HHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGS SEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSIEGRADDKCEDSLRREIACTKCRDRVRTDDYFYECCTSESTFKKCQTMLHQ
其中下划线部分为His6-SUMO亲和标签，斜体部分为Factor-Xa酶切位点IEGR。
实施例2：SSD609蛋白表达、纯化
将上述质粒转化进入EscherichiacoliBL21(DE3)gold细胞中，37℃培养箱中生长24h(卡那霉素抗性)。挑选单克隆，在4mLLB小管中扩增后加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37℃培养，转速为225rpm。菌液OD600达到0.8时加入终浓度为0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，融合蛋白开始表达，于25℃培养箱中培养。20h后使用Beckman离心机离心收菌，4000rpm离心20min，弃去上清。用35mL裂解液重悬底部的E.coli细胞，冻存于-80℃冰箱中用于以后纯化或者直接超声破碎。
将细菌悬液放在冰水浴中，用超声破碎仪3son/3soff的脉冲破碎15min，直到细胞悬液比较透亮为止。超声完成后，使用日立离心机进行离心，14000rpm20min，弃去沉淀取上清。融合蛋白带有His6标签，用镍柱纯化。Ni2+-NTA胶先用ddH2O冲洗，然后用Bindingbuffer平衡，之后与上清混合，在4℃冰箱中混合1h后，即可进行纯化。首先将Ni2+-NTA胶和上清的混合物加入重力流穿柱中，使上清流出，而融合蛋白会结合在Ni2+-NTA胶上。之后用含30mM咪唑和300mM咪唑的Bindingbuffer洗脱杂蛋白和目的蛋白。目的蛋白经过10KMWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩后，使用FactorXa酶进行酶切。将酶按照1:3000(g/g)的比例加入目的蛋白，室温酶切16h(20-25℃)。酶切之后进行反挂镍柱，即酶切后的蛋白与用Bindingbuffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合1h，His-SUMO标签挂在镍柱上，纯化时，流穿出来的是目的多肽毒素。所有洗脱的蛋白样品均用Tricine-SDS-PAGE进行验证(如图3所示)。
将多肽毒素冻干，再加入少量的ddH2O使其溶解，用这种方式浓缩毒素后使用高效液相色谱(HPLC)进行纯化。多肽毒素混合物在C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈和0.1％TFA溶液以5mL/min流速分离。谱峰于214nm和254nm波长检测，人工收集目的蛋白，用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证，计算得到SSD609多肽毒素的质量大小为5623.8Da，与天然SSD609一致(如图5所示)。将蛋白溶液冻干得到白色固体粉末，备用。
实施例3：SSD609二硫键重建
由于纯化出来的SSD609折叠状态不够均一，6个半胱氨酸形成的二硫键可以有许多种连接方式，因此我们对蛋白进行重折叠，使二硫键正确连接。将冻干后的SSD609粉末小心地用分析天平称量，读出重量。然后根据摩尔质量(SSD609是5624.5g/mol)算出物质的量。配制变复性溶液。根据SSD609的物质的量，计算需要加入的溶液数量(保持SSD609的浓度处于100μM-200μM之间。如1μmol的SSD609溶于5mL，则物质的量浓度为200μM，符合要求)。此举为了防止蛋白浓度过高，二硫键形成二聚或多聚。按照GSH(还原型谷胱甘肽)：GSSG(氧化型谷胱甘肽)：peptide(多肽蛋白)＝100：10：1的摩尔比，称取相应的GSH和GSSG加入溶有SSD609的变复性溶液中。调节pH7.8，4℃静置24-48h。GSH和GSSG能够诱导硫醇和二硫键之间的交换反应，模拟生理状态使非天然的二硫键打开，然后重新折叠形成热力学稳定的天然状态。再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分(二硫键重建前后HPLC对比图如图4所示)，该样品冻干后即可用于后续实验。
实施例4：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达KCNQ1/KCNE1钾离子通道，验证SSD609的生理功能
在脂质体的帮助下，将pcDNA3.1-KCNQ1、pcDNA3.1-KCNE1、pcDNA3.1-EGFP质粒共转染到CHO细胞中，在荧光显微镜下选取发绿色荧光的细胞，采用膜片钳电生理技术记录全细胞电流。局部给予不同浓度的SSD609，对比给药前后KCNQ1/KCNE1钾离子通道电流的大小，验证SSD609的生理功能(图6)。
电压刺激：电压维持在-80mV，给予去极化电压刺激，从-80mV～+60mV，每次增加20mV，维持2s，引出KCNQ1/KCNE1钾离子电流，之后在-30mV测试尾电流，再回到-80mV。
细胞外液：150mMNaCl，4mMKCl，2mMCaCl2，1mMMgCl2，10mMHEPES，pH7.4，渗透压310mOsm
电极内液：140mMKCl，10mMNaCl，5mMEGTA，10mMHEPES，1mMMgATP，0.2mMNaGTP，pH7.4，渗透压295mOsm。

Claims (5)

1.一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，包括如下步骤：
(1)获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQIDNo.1所示；
(2)将SSD609的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒；
(3)将pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌；
(4)将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His6-SUMO-SSD609融合蛋白；
(5)His6-SUMO-SSD609融合蛋白用FactorXa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和SSD609多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而SSD609多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化；
(6)经HPLC纯化后的SSD609多肽毒素使用GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘肽)进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肽毒素；
(7)再次使用HPLC对SSD609多肽毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小，冻干备用。
2.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白表达的具体方法如下：
将pET28-His6-SUMO-FactorXa-SSD609质粒转化进入EscherichiacoliBL21(DE3)gold细胞中，37℃培养箱中生长24h；挑选单克隆，在4mLLB小管中扩增后加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37℃培养，转速为225rpm；当菌液OD600达到0.8时加入终浓度为0.5mMIPTG进行诱导，融合蛋白开始表达，于25℃培养箱中培养；20h后离心机离心收菌，4000rpm离心20min，弃上清液；用35mL裂解液重悬底部的E.coli细胞，收集细菌悬液，备用。
3.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤(4)中蛋白纯化的具体方法如下：
将细菌悬液用超声破碎仪破碎，离心后取上清，得到含有杂蛋白的蛋白混合液；Ni2+-NTA胶先用ddH2O冲洗，再用Bindingbuffer平衡；平衡后的Ni2+-NTA胶与蛋白混合液混合，使His6-SUMO-SSD609蛋白与Ni2+-NTA胶结合；将结合了蛋白的Ni2+-NTA胶加入重力流穿柱，用含30mM咪唑的Bindingbuffer洗去非特异性结合的杂蛋白，再用含有300mM咪唑的Bindingbuffer洗脱His6-SUMO-SSD609融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤(5)中蛋白酶切和纯化的具体方法如下：
His6-SUMO-SSD609融合蛋白使用10KMWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩，用Factor-Xa酶的酶切buffer将浓缩后的His6-SUMO-SSD609融合蛋白稀释至10mL；Factor-Xa酶按照1:3000(g/g)的比例加入His6-SUMO-SSD609融合蛋白溶液，20-25℃酶切16h，此时His6-SUMO-SSD609融合蛋白已被酶切开，分别为His6-SUMO标签和SSD609多肽毒素；酶切后的混合蛋白溶液与用Bindingbuffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合1h，His-SUMO融合标签结合在Ni2+-NTA胶上，流穿出来的即为多肽毒素SSD609蛋白；将该SSD609蛋白冻干，加入ddH2O溶解，用HPLC进一步纯化：含有多肽毒素SSD609的溶液在C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈和0.1％TFA溶液以5mL/min流速分离；谱峰于214nm和254nm波长检测，人工收集目的蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法，其特征在于，所述步骤(6)中SSD609二硫键重建的具体方法如下：
将得到的SSD609多肽毒素冻干，加入到变复性溶液中。该变复性溶液为0.33MNH4Ac和0.5MGnHCl混合液，所述多肽毒素SSD609蛋白在变复性溶液中的浓度在100μM-200μM之间。按GSH(还原型谷胱甘肽)：GSSG(氧化型谷胱甘肽)：多肽毒素SSD609＝100：10：1的摩尔比，称取相应的GSH和GSSG加入溶有多肽毒素SSD609蛋白的变复性溶液中；调节pH至7.8，4℃静置24-48h；静置后的溶液再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分。
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