CN106589092A - 一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法 - Google Patents

一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法 Download PDF

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张隆华
肖亮
周莉
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Abstract

本发明提供了一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法；该方法通过基因合成的方法制备蝎毒素多肽的基因，并构建到带有His6纯化标签及SUMO助溶标签的重组质粒中，利用大肠杆菌表达体系进行高效表达。细胞破碎后经镍柱纯化，酶切去除助溶标签，经HPLC纯化后最终获得具有类似天然生理功能的蝎毒素多肽。本发明制备过程简单，成本低，产量高，制备的蝎毒素多肽具有与天然蝎毒素多肽相同的生理活性。

Description

一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽 的方法
一、技术领域
本发明涉及蛋白质多肽药物领域，尤其涉及一种制备类似天然生理功能蝎来源多肽毒素多肽的方法。
二、背景技术
目前已知的蝎毒素多肽或其类似物的获取方式有三种：其一是直接从蝎子来源的粗毒中提取，经过反相高效液相色谱C18柱分离纯化，从中分离出毒液中多种单一的组分。这种方法可以获得天然蝎毒素多肽，但是缺点在于得到的蝎毒素量非常微小，1毫克粗毒经过分离纯化，仅仅可以获得微克级目的毒素多肽，同时对于大规模生产操作不便。其二是采用拮抗剂-融合蛋白的形式，将毒素多肽序列接在人血清白蛋白(HSA)或者Fc融合蛋白上，应用脂质体2000进行转染表达，应用树脂或色谱系统进行纯化。但这种方法制备出的是融合蛋白，而非多肽自身，其药效相比多肽自身亦有所下降(半抑制浓度IC50为13nM)。其三是采用化学合成来制备，这种方法在自动化肽合成仪上进行固相肽合成获取粗制直链产物，需要再经过二硫键重构和HPLC纯化过程，才能得到有活性的蝎毒素多肽。
三、发明内容
本发明的主要目的是提供一种操作简便，产率高，成本低的制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法。
本发明请求保护一种蝎毒素多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述多肽的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明同时请求所述多肽基因在制备蝎毒素多肽中的应用。
在具体应用中，本发明提供一种制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法，包括以下步骤：
1)获取蝎毒素多肽蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；
2)将蝎毒素多肽的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素质粒；
3)将所构建的质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌，获得细菌悬液；
4)将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素多肽融合蛋白；
5)将His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素融合蛋白用Factor Xa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和蝎毒素多肽毒素的蛋白混合液，将该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而蝎毒素多肽毒素则作为流穿液被收集；
6)将收集的蝎毒素多肽毒素，用HPLC进一步纯化，收集HPLC相应峰对应的蝎毒素多肽蛋白，并质谱验证该多肽蛋白的分子量大小，冻干备用。
作为优选，所述步骤3中蛋白表达的具体步骤如下：
1)将pET28-His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素质粒测序验证，验证正确后，将其转化入Escherichia coli BL21(DE3)gold感受态细胞中；
2)在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃恒温生长24h；
3)挑选单克隆体，接种于4mL含50μg/mL卡那霉素的LB小管中，37℃摇床过夜扩增；
4)将过夜培养的菌液加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃，转速为225rpm培养，OD600达到0.8时加入终浓度为0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，转移至25℃，转速为225rpm培养，20h后，4000rpm离心20min，弃去上清，菌体沉淀使用30mL裂解液(70mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重悬备用。
作为优选，所述步骤4中蛋白纯化的具体方法如下：
1)细菌悬液在冰水浴中用超声破碎仪将细胞以30％功率，3s on/3s off的脉冲破碎15min，重复2-3次，待细胞悬液透亮后，在4℃环境下，14000rpm离心20min，取上清液，与用Binding buffer(20mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)平衡过的Ni-NTA胶混合，在4℃环境中混合孵育1h；
2)将孵育后的Ni-NTA胶和上清的混合物加入重力流穿柱中，使目的蛋白截留在流穿柱上，用含30mM咪唑的Binding buffer洗去结合在Ni-NTA胶上的杂蛋白，接着用300mM咪唑的Binding buffer洗脱目的多肽蛋白，获得纯化的His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素多肽融合蛋白。
作为优选，所述步骤5中蛋白酶切的具体方法如下：
1)将纯化的His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素多肽融合蛋白经过10K MWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩后，置入Factor Xa的酶切缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mMCaCl2，pH8.0)中；
2)将Factor Xa酶按照1:3000(g/g)的比例加入多肽融合蛋白中，20℃-25℃酶切16h；
3)酶切后与平衡好的Ni-NTA胶(20个柱体积水清洗，20个柱体积Binding buffer平衡)混合1h，加入重力流穿柱中，使酶切下来的助溶标签截留在流穿柱上，收集流穿液，即为酶切完成的蝎毒素多肽。
作为优选，所述步骤6中HPLC进一步纯化的具体方法如下：
1)将蝎毒素多肽冻干，加入ddH2O溶解，
2)在高效液相色谱(HPLC)C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈(含有0.1％TFA)以5mL/min流速分离，谱峰于214nm和254nm波长检测，蝎毒素多肽在17min-24min出峰，收集对应的多肽蛋白，然后将收集的多肽蛋白溶液冻干，得到白色固体粉末，用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证。
本发明蝎毒素多肽是一种发现于伊朗黄蝎(Odonthobuthus doriae)毒液，该多肽能够专一性抑制钾离子通道Kv1.3(半抑制浓度IC50为7.2nM)，而对其他Kv1.x通道及hERG通道无作用或作用很弱，因此可以用作选择性鉴别Kv1.3离子通道的多肽工具药。同时，Kv1.3是效应记忆TEM细胞上的重要药物靶点，其抑制剂具有治疗自身免疫性疾病的潜在药物可能，因此该多肽同时具有药物开发的潜能。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明提供的方法能获得较为大量的蝎毒素多肽(平均每1L的菌液能获取4mg的蝎毒素多肽)，其药效及选择性类似天然状态蝎毒素多肽的生理功能。该方法实验周期短暂(从摇菌开始，3天的时间即可获得所需的蝎毒素多肽)，产量高，纯度高，成本低，且拥有类似天然状态下的蝎毒素多肽的生理功能。
四、附图说明
图1是蝎毒素纯化的SDS-PAGE图。
图1中：M：low range protein marker(Da)；1：超声破碎后的全细胞样品；2：离心后的上清；3：挂镍柱之后的流穿；4：30mM咪唑洗脱的杂蛋白；5：300mM咪唑洗脱的目的蛋白；6：Factor Xa酶酶切之前。7：Factor Xa酶酶切之后，新切出来的条带为蝎毒素(框中)。
图2是蝎毒素酶切后镍柱纯化SDS-PAGE图。
图2中：M：low range protein marker(Da)1：Factor Xa酶酶切之前。2：Factor Xa酶酶切之后。3：反挂Ni-NTA胶流穿。4：反挂Ni-NTA胶300mM咪唑洗脱6His-sumo-tag。
图3是蝎毒素纯化的HPLC图。
图4是蝎毒素的ESI-MS质谱图。
图5是蝎毒素的浓度效应曲线。
图6是蝎毒素，对Kv1.X家族的电流选择性的结果图。
五、具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1：1)蝎毒素多肽的质粒构建：
获得蝎毒素多肽的蛋白序列信息以及DNA序列，进行基因合成，其中DNA序列如SEQID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；使用PCR方法在蝎毒素之前加入Factor Xa酶切位点IEGR，通过BamH I和Xho I限制性内切酶酶切位点连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建得到pET28-His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素质粒。测序验证正确。
2)质粒的诱导表达：
将质粒转化进入Escherichia coli BL21(DE3)gold感受态细胞中，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上于37℃恒温培养箱中生长24h。挑选单克隆体，接种于4mL含50μg/mL卡那霉素的LB小管中，37℃摇床过夜扩增培养，然后按照百分之一的比例(菌液比培养基)将过夜培养的菌液加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃培养摇床，转速为225rpm培养。OD600达到0.8时加入终浓度为0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，此时多肽融合蛋白开始表达，将培养瓶转移至25℃培养摇床，转速为225rpm培养。20h后使用Beckman离心机离心收菌，4000rpm离心20min，弃去上清。菌体沉淀使用30mL裂解液(70mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重悬，冻存于-80℃冰箱中用于以后纯化或者直接超声破碎。
3)多肽融合蛋白的纯化：
将菌液放在冰水浴中，用超声破碎仪以30％功率，3s on/3s off的脉冲破碎15min，重复2-3次直到细胞悬液透亮。超声破碎完成后，4℃环境下，使用离心机，14000rpm离心20min，弃去沉淀取上清，得到His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素多肽融合蛋白。
由于多肽融合蛋白带有His6标签，使用镍柱纯化：Ni-NTA胶先用20倍胶体积ddH2O冲洗，去除残留的酒精，然后用20倍胶体积Binding buffer(20mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)平衡，之后与离心后上清混合，在4℃冰箱中混合孵育1h后，将Ni-NTA胶和上清的混合物加入重力流穿柱中，使上清流出，而多肽融合蛋白会结合在Ni-NTA胶上，截留在流穿柱上。之后用含30mM咪唑的Binding buffer洗去结合在Ni-NTA胶上的杂蛋白，接着用300mM咪唑的Binding buffer洗脱目的多肽融合蛋白。将目的多肽融合蛋白收集于50mL离心管中。
4)多肽融合蛋白的酶切：
目的多肽融合蛋白经过10K MWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩后，置入相应的Factor Xa的酶切buffer中(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH8.0)。将FactorXa酶按照1:3000(g/g)的比例加入目的多肽融合蛋白中，20℃-25℃酶切16h。酶切之后用平衡好的Ni-NTA胶(Ni-NTA胶先用20倍胶体积ddH2O冲洗，去除残留的酒精，然后用20倍胶体积Binding buffer(20mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)平衡)混合1h，这样6His-SUMO-tag就会挂在镍柱上，纯化时，流穿出来的是酶切完成的蝎毒素多肽。
5)蝎毒素多肽的HPLC纯化及最终产物的验证：
将蝎毒素多肽冻干，再加入少量的ddH2O溶解。使用高效液相色谱(HPLC)进行纯化。多肽毒素混合物在C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈(含有0.1％TFA)以5mL/min流速分离。谱峰于214nm和254nm波长检测，蝎毒素多肽蛋白在17min-24min出峰，人工收集所相应峰的多肽蛋白，即蝎毒素多肽，如图3所示。然后将收集的蛋白溶液冻干得到白色固体粉末，用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证，如图4所示，质谱图上出现的峰质荷比(m/z)都是一致的，三价离子峰，四价离子峰以及五价离子峰，由它们计算出来的对应的分子量都在4076.4Da左右。蝎毒素在Expasy网站上的计算值为4082.8Da，由于6个半胱氨酸形成3对二硫键，从而失去6Da，因此纯化的产物是正确的。
关于蝎毒素多肽的功能鉴定：
选用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达Kv1.3钾离子通道，CHO细胞没有钾离子通道的本底电流，因此在研究钾离子通道时不会造成干扰。采用脂质体转染的方式。转染时将带有CHO细胞的24孔板原来的0.5mL培养基吸走，除去残留的血清和抗生素，然后加入0.4mLOpti-MEM培养基(无抗生素，无血清)。将2μL阳离子脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)，0.6μg的pcDNA3.1-EGFP质粒和1.0μg的pcDNA3.1-Kv1.3质粒用100μL的Opti-MEM培养基稀释，滴加到24孔板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养4-6h，将质粒导入细胞中。转染完成后，细胞用胰酶消化20s，吹打重悬细胞，滴加到小盖玻片上。
在显微镜下选择带有绿色荧光的细胞进行全细胞电生理记录。给予Kv1.3通道刺激protocol，记录正常Kv1.3通道电流，对该细胞进行局部给药，给予不同浓度的蝎毒素多肽，对比给药前后Kv1.3通道电流，获取蝎毒素多肽对Kv1.3通道电流的抑制曲线，验证其生理功能，如图5所示。
用同样的方法转染Kv1.x家族其他成员(Kv1.1-Kv1.6)，检验蝎毒素多肽对Kv1.x通道电流的作用，验证其对Kv1.3通道的选择性，如图6所示。
细胞培养基：培养细胞使用的DMEM/F12培养基，购买自Gibco公司。使用前加入10％的胎牛血清(FBS)(购买自Gibco公司)以及100U/mL的青霉素和链霉素(购买自Gibco公司)。
细胞外液：150mM NaCl，4mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES，pH 7.4，渗透压290mOsm-300mOsm左右。
电极内液：140mM KCl，10mM NaCl，5mM EGTA，10mM HEPES，pH 7.4，渗透压290mOsm-300mOsm左右。
Kv1.3通道刺激protocol：细胞电压钳制在-80mV，给予去极化电压刺激，从-80mV～+60mV，每次增加20mV，维持200ms，引出Kv1.3钾离子电流，再回到-80mV，每个刺激之间间隔30s，以避免Kv1.3发生积累失活效应。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学技术大学先进技术研究院
<120> 一种蝎毒素多肽基因及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 114
<212> DNA
<213> Odonthobuthus doriae
<400> 1
ggtgttccaa ccgacgtgaa gtgccgtggt tctcctcagt gtatccaacc gtgtaaagat 60
gcgggtatgc gcttcggcaa atgcatgaac ggcaaatgcc actgcactcc gaaa 114
<210> 2
<211> 38
<212> PRT
<213> Odonthobuthus doriae
<400> 2
Gly Val Pro Thr Asp Val Lys Cys Arg Gly Ser Pro Gln Cys Ile Gln
1 5 10 15
Pro Cys Lys Asp Ala Gly Met Arg Phe Gly Lys Cys Met Asn Gly Lys
20 25 30
Cys His Cys Thr Pro Lys
35

Claims (8)

1.一种蝎毒素多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种蝎毒素多肽基因，其特征在于，所述多肽的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求2所述多肽基因在制备蝎毒素多肽中的应用。
4.一种制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)获取蝎毒素多肽蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.1所示；
(2)将蝎毒素多肽的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素质粒；
(3)将质粒转化进到宿主菌中获得重组菌，培养收集菌液；
(4)洗脱纯化菌液，得纯化的SUMO-蝎毒素多肽融合蛋白；
(5)将SUMO-蝎毒素多肽融合蛋白用Factor Xa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和蝎毒素多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而蝎毒素多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化。
(6)收集HPLC相应峰对应的蝎毒素多肽蛋白，并质谱验证该多肽的分子量大小，冻干备用。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：
将pET28-His6-SUMO-Factor Xa-蝎毒素质粒经过测序验证正确后，将其转化入Escherichia coli BL21(DE3)gold感受态细胞中，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃恒温生长24h；挑选单克隆体接种于4mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB小管中，37℃摇床过夜扩增；将过夜培养的菌液加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃，转速为225rpm培养；OD600达到0.8时加入终浓度为0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，转移至25℃，转速为225rpm培养。20h后离心收菌，4000rpm离心20min，弃去上清。菌体沉淀使用30mL裂解液(70mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)重悬备用。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)蛋白纯化的具体方法如下：
在冰水浴中用超声破碎仪将细胞以30％功率，3s on/3s off的脉冲破碎15min，重复2-3次，待细胞悬液透亮后在4℃进行离心，14000rpm离心20min，取上清液，与用Bindingbuffer(20mM Tris，200mM NaCl，pH8.0)平衡过的Ni-NTA胶混合，在4℃冰箱中混合孵育1h。将Ni-NTA胶和上清的混合物加入重力流穿柱中，使目的多肽蛋白截留在流穿柱上，用含30mM咪唑的Binding buffer洗去结合在Ni-NTA胶上的杂蛋白，接着用300mM咪唑的Bindingbuffer洗脱目的蛋白。将目的蛋白收集于50mL离心管中备用。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)蛋白酶切的具体方法如下：
目的蛋白经过10K MWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩后，更换缓冲液(20mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM CaCl2，pH8.0)。将Factor Xa酶按照1:3000(g/g)的比例加入目的蛋白，室温酶切16h(20℃-25℃)。酶切后与平衡好的Ni-NTA胶混合1h，加入重力流穿柱中，使酶切下来的助溶标签截留在流穿柱上，收集流穿液，即为酶切完成的蝎毒素。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)蛋白纯化的具体方法如下：
将蝎毒素冻干，加入ddH2O溶解，在高效液相色谱(HPLC)C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈(含有0.1％TFA)以5mL/min流速分离；谱峰于214nm和254nm波长检测，蝎毒素蛋白在17min-24min出峰，人工收集对应的蛋白，然后将收集蛋白溶液冻干得到白色固体粉末，用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证。
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CN104937105A (zh) * 2013-01-25 2015-09-23 詹森生物科技公司 Kv1.3拮抗剂及其使用方法
CN105543234A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 中国科学技术大学先进技术研究院 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素ssd609的方法

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